בידוד של הכבד CD133 + בתאי גזע משובטים עבור הרחבת

Summary

כאן אנו מתארים את הבידוד של CD133 לבטא בתאי גזע כבד סרטן בתאי גזע מהכבד Murine שלם, תהליך הדורש עיכול רקמות, העשרה התא cytometry בידוד תזרים. אנו כוללים שיטות מתקדמות בידוד תא בודד והרחבת משובט.

Abstract

גזע כבד התא, או התאים סגלגל, להתרבות במהלך פציעה כבד כרונית, והם הציעו להתמיין גם hepatocytes ו cholangiocytes. בנוסף, בתאי גזע בכבד הם שיערו להיות מבשרי עבור משנה של סרטן הכבד, סרטן Hepatocellular. אחד האתגרים העיקריים לבלום עבודה תא מוצק כמו כל איבר הכבד הוא בידודה של אוכלוסייה נדירה של תאים עבור ניתוח מפורט. למשל, הרוב המכריע של תאים בכבד הם hepatocytes (חלק parenchymal), אשר באופן משמעותי יותר מאשר אי - parenchymal תאים. על ידי העשרת תאים סלולריים ספציפי של הכבד (כלומר parenchymal ולא parenchymal שברים), ובחירה של תאים CD45 שלילי, אנו מסוגלים להעשיר את האוכלוסייה החל בתאי גזע על ידי למעלה מ 600-fold.The proceduresdetailed בדוח זה לאפשר אוכלוסייה נדירה יחסית של תאים מאיבר מוצק להיות מיון ביעילות. תהליך זה יכול להיות מנוצל כדי בתאי גזע isolateliver מהכבד Murine נורמלית, כמו גם פגיעה כרונית מודלים הכבד, אשר גדל להפגין גזע כבד התפשטות תאים. לשיטה זו יתרונות ברורים על פני אימונוהיסטוכימיה תקן של הכבד קבוע קפוא או פורמלין כפי מחקרים תפקודית באמצעות תאים חיים יכול להתבצע לאחר שיתוף לוקליזציה הניסויים הראשוניים. כדי לבצע את ההליך המתוארים בדוח זה, יחסים בעבודה עם ליבה מחקר מבוסס זרימה cytometry הוא מומלץ מאוד כמו הפרטים של בידוד FACS הם תלויים במידה רבה על מכשור מיוחדים ידע בסיסי חזק של זרימת cytometry נהלים בסיסיים. המטרה הספציפיים של התהליך הזה היא לבודד אוכלוסייה של גזע לתאי כבד כי ניתן להרחיב clonally במבחנה.

Protocol

כל פתרונות התקשורת, מכשירים, מסננים, צינורות צריך להיות סטרילי מטופלים עם טכניקה סטרילית כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הכן את כל מאגרי התקשורת 24 שעות מראש ולאחסן ב 4 ° C.

1. הפרדה Parenchymal ולא parenchymal מהכבד שלם

1. הכן את הפתרון אנזים לעיכול באמצעות צינור 15 סמ"ק עם ראש הבורג 10 מ"ל סטרילי PBS המכיל 5 מ"ג collagenase, pronase 5 מ"ג, 1 מ"ג ו DNAse.
2. להרדים העכבר באמצעות מוסד שאושר (Animal Care מוסדיים ועדת שימוש) שיטה כמו מחנק CO _2. נגבו את אזור הבטן של בעלי חיים מורדמים עם פתרון אתנול 70%. שימוש בכלים סטריליים, חלל הבטן והכבד לפתוח explant en-לחסום. הסרת כיס המרה מהכבד explanted. העברת הכבד כולו מכסה המנוע למינרית זרימה בכלי סטרילי סגור.
3. הליך זה הושלם ב ברדס זרימה למינרית. בעזרת סכין גילוח סטרילי, בשר טחון כבד עם שילוב של חתכים אופקיים ואנכיים מרובות במשך דקה 1 בצלחת סטרילית. המקום ¼ של עיסת כבד קצוץ בצינור 15 סמ"ק עם 10 סמ"ק PBS עם collagenase, pronase ו DNAse משלב 1.1 לעיל. חזור עם כבד כל ¼ טחון.
4. המקום צינורות עם עיסת ¼ הכבד אנזימים טחון לתוך אמבט מים ב 37 ° C במשך 45 דקות, עם שייקר ב 1-2 מחזורים / שנייה. נגב צינורות עם אתנול 70% לאחר ההסרה מן האמבט במים לפני העברת מכסה המנוע זרימה למינרית.
5. הליך זה הושלם ב ברדס זרימה למינרית. מסננים עיסת הכבד מעוכל דרך רשת 70 מיקרון מסנן לאסוף לתוך צלחת סטרילית. באמצעות 2 מ"ל של aliquots DMEM סטרילי: F12 התקשורת עם סרום 10% חום מומת שור עוברית, יש לשטוף את המסנן ולהשתמש סוף הגומי של הבוכנה מזרק לכתוש את עיסת מעוכל דרך המסנן. חזור 5 פעמים כדי להפוך בנפח כולל של כ 20 מ"ל תסנין. מחלקים את תסנין לתוך 2 15 צינורות שווה מ"ל.
6. העברות כל צריך להסתיים ברדס זרימה למינרית, ולהשתמש צנטריפוגות בקירור ב 4 ° C אם זמין. צנטריפוגה ב XG 50 דקה 1. שמור supernatant # 1 וזורקים parenchymal גלולה. צנטריפוגה supernatant מס '1 של XG 50 דקה 1. שמור supernatant # 2 וזורקים גלולה. צנטריפוגה supernatant # 2 ב XG 50 דקה 1. שמור supernatant # 3 וזורקים גלולה. צנטריפוגה supernatant הסופי # 3 עבור XG 180 במשך דקה 8 להשיג הלא parenchymal חלק.

2. התא האדום תמוגה

עבודה זרימה למינרית מכסה המנוע, לשמור על התאים קר, פתרונות להשתמש מקורר 4 ° C.

1. בלילה לפני ההליך, להתכונן חיץ אדום תמוגה התא על ידי דילול המניות 10X ריכוז BD פארם Lyse חיץ עם לדילול 1:10 עם מים מזוקקים סטריליים. 1X solutionshould להיות מאוחסן במשך 30 ימים בשעה 4 ° C.
2. בלילה לפני ההליך, להתכונן חיץ Miltenyi שימוש סטרילי PBS, בסרום שור 0.5% אלבומין, ו 2mm EDTA. פתרון סינון באמצעות יחידת ואקום לסנן עם מסנן 0.45 מיקרון. המכסה העליון של יחידת tilter עם מכסה פלסטיק המקורי ומאובטח בניילון נצמד. Storeentire לסנן יחידה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות כדי דגה EDTA. יחידת סינון יכול להיות מוחלף עם כובע סטרילי רגיל לאחר 12 שעות.
3. הליך זה הושלם ב ברדס זרימה למינרית. בעזרת צינורית סטרילית 5 מ"ל, מחדש להשעות הלא parenchymal גלולה משלב 1.6 לעיל לתוך מ"ל 1 של 1X חיץ בדילול אדום תא תמוגה דם 2.1 לעיל. שווי צינור להעברת מתוך מכסה המנוע לזרום למינרית.
4. מערבולת בעדינות עבור 5seconds ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C מוגן מפני האור.
5. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות.
6. הליך זה הושלם ב ברדס זרימה למינרית. בטל RBCs lysed ב supernatant, מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל חיץ Miltenyi קרים כקרח סטרילית.
7. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות.
8. הליך זה הושלם ב ברדס זרימה למינרית. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל חיץ Miltenyi קרים כקרח סטרילית.
9. הסר 10 μl של השעיה תא PBS ולהוסיף 10 μl tryan כחול. הרוזן remainingnon-parenchymal תאים באמצעות hemocytometer.

3. CD45 תא דלדול hematopoietic חלק מן הלא parenchymal

עבודה זרימה למינרית מכסה המנוע, לשמור על התאים קר, פתרונות להשתמש מקורר 4 ° C.

1. להשעות תאים μL 100 של חיץ Miltenyi לכל 107 עד 108 תאים תאים הכולל.
2. החל 20 μL Miltenyi CD45 נוגדנים microbead עבור כל 107 תאים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
3. הוסף 2 מ"ל נוספים למאגר Miltenyi ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר supernatant. Re-להשעות תא גלולה (עד 108 תאים סה"כ) במאגר Miltenyi 1 מ"ל.
4. זרימה למינרית על מכסה המנוע, תאים לסנן באמצעות Miltenyi טור LD מגנטי. התחל על ידי הצבת עמודה בעל מגנטית (Miltenyi MidiMACS או QuadroMACS). המקום צינור סטרילי 5 מ"ל להלן לסנן לתפוס תסנין. הכן את העמודה על ידי טעינת 2 מ"ל Miltenyi חיץ.
5. לאחר טרום לסנן לשטוף תושלם, עומס על התאים בעמודה LD. לאחר ההשעיה התא בתוך העמודה, להוסיף 1 מ"ל חיץ Miltenyi וחזור 1 מ"ל Miltenyi חיץ לשטוף 2 פעמים נוספות. אין להשתמש הבוכנה מסופק עם טור להגדיל את המהירות של סינון. רק לאסוף תסנין כאשר מסנן להציב בעל מגנטי.
6. צנטריפוגה תסנין שנאספו של כ -5 מ"ל (הטור מחזיקה מ"ל הנותרים 1) של CD45-מדולדל לא parenchymal תאים ב XG 200 במשך 5 דקות. מחק את העמודה עם CD45 בתאי שמר חיובית.

4. Cytometry זרימה הבידוד של CD133 תאים חיובי

1. הכן התקשורת תא סגלגל. השתמש 01:01 DMEM: F12 בינוני עם 10% חום מומת נסיוב עגל העובר כבסיס, ולהוסיף אינסולין (1 מיקרוגרם / מ"ל), HEPES (5 mol / L), ו פניצילין / סטרפטומיצין (1% נפח / נפח). פתרון סינון באמצעות יחידת ואקום לסנן עם מסנן 0.45 מיקרון.
2. Re-להשעות תאים חיץ Miltenyi ב μL 100 לכל 10 ⁷ תאים. הוסף 2 μL של נוגדן CD133-PE מצומדות. שימוש הקבוצה השנייה של תאים, דגירה עם נוגדנים IgG-PE מצומדות כביקורת. שמור קבוצה שלישית של תאים ללא מכתים כפקד בלא כתם עבור FACS.
3. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך. Re-להשעות במאגר מכתים 2 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה במאגר Miltenyi 1 מ"ל.
4. שלב זה מתבצע באמצעות תקן cytometry זרימה תא הליכי מיון, אשר עשוי להיות מוסד ספציפי. שימוש בתאי בלא כתם ו IgG תאים PE מוכתם, להתאים מיון פרמטרים gating אופטימיזציה של האוכלוסייה + CD133 התא. PE (R-Phytoerythrin) יכול בדרך כלל לשמש cytometer כל זרימת כי יש לייזר פולט ב 488 ננומטר. פליטת שיא עבור PE הוא 575 ננומטר מזוהה בערוץ FL-2.
   
   הערה: שימוש FACS BD Calibur או BD FACS מכונות Vantage, עם התוכנית Cell Quest for איסוף הנתונים, אנו משתמשים העבר פיזור הצד להציג פיזור בהיקף יומן לזהות אוכלוסיות תאים, עם פיזור צד מוגדר 250. FL1 ו fl2 הן בקנה מידה יומן להגדיר 550. פרמטרים אלה מספקים מקום המוצא הראשונית כדי להציג הלא parenchymal בתאי הכבד, ומותאמים לפי הצורך בהתבסס על מכתים האינטנסיביות של אוכלוסיות חיוביות ושליליות.
5. לבודד את CD133 + האוכלוסייה התא באמצעות CD133 + שער לאסוף את התאים סטרילי מדיה תא מסונן.

5. תרבית תאים שיטות

1. FACS צנטריפוגה תאים שנאספו על XG 200 במשך 5 דקות. Re-להשעות תא גלולה בתקשורת תא סגלגל עם כ 5,000 תאים לכל מיליליטר. מאי להתחיל עם ריכוזים גבוהים יותר, עד 50,000 תאים / מ"ל ​​עבור הניסויים הראשוניים, ולצמצם ככל משפר טכניקה כדאיות התא ומשפר את התשואה הכוללת.
2. תאים פלייט על BD Biocoat Laminin מצופה 96 צלחות היטב באמצעות תאים 1000 / ² ס"מ. מקום humidified תרבית תאים החממה ב 37 ° C, עם 5% CO _2. לאחר 24 שעות להוסיף גורם הגדילה hepatocyte (50 ng / nl) וכן גורם גדילה עוריות (20 ng / ml).
3. עבור תאים בודדים, לבודד תאים ישירות μl 50 של מדיה תא סגלגל היטב בכל צלחת 96 Laminin מצופים היטב. השתמש יחיד FACS הגדרות תא לבחירה קפדנית של תא אחד חיובי בלבד. לאחר 24 שעות, להוסיף 50 μl של התקשורת תא סגלגל עם HGF ו EGF לעיל בשלב 5.2. שינוי התקשורת באופן מלא לאחר 5-7 ימים.
4. לאחר הרחבת מושבות הם יותר ומחוברות 50%, אשר מתרחשת בדרך כלל לאחר 2 שבועות, בהתאם למספר הכולל של תאים הכדאיות מצופה תאים, התאים ניתן לפצל 01:03 להלן.
5. פיצול תאים באמצעות טריפסין 0.05%, EDTA. החל רק מספיק כדי לכסות תחתית היטב, 50-100 μL / גם בצלחת 96 היטב. מקום החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות.
6. הוספת 100 μL של התקשורת גם כל להעביר את כל הנוזל בצינור 5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל התקשורת כדי צינור כל צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות.
7. Re-להשעות תאים בצלחת התקשורת בצלחת laminin מצופה, באמצעות תאים 1 היטב לתוך צלחת 3 חדש בארות (יחס 01:03).

6. אישור מעמד דו פוטנציאליים באמצעות RT-PCR

הליך זה הוא מפורט RNeasy פרוטוקול מדריך, אשר מסופק עם קיט RNeasy.

1. השתמש עמודות מיקרו RNeasy עבור 96 מושבות צלחת היטב. לשאוב התקשורת בתרבות מבאר כל אחד. הוסף 75 μl RLT חוצץ (מתוך ערכת RNeasy) ישירות היטב כל אחד. מעבירים לצלחת עם תחתית גומי שוטר סטרילית. Pipettelysate לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות תערובת מערבולת דקה 1. הוסף אתנול 70% ל lysates ומערבבים ידי pipetting.
2. העברת הפתרון טור RNeasy להציב צינור 2 אוסף מ"ל (כפי שסופק בערכת RNeasy) ו צנטריפוגות בצנטריפוגה מיקרו במשך 15 שניות בסל"ד 10,000. בטל eluted תסנין.
3. שימוש חוזר צינור איסוף. הוסף חוצץ 350 μL RW1 (קיט RNeasy) לעמודה צנטריפוגות RNeasy עבור 15 שניות בסל"ד 10,000 לשטוף את העמודההממברנה. בטל לשטוף eluted.
4. הוסף 10 פתרון μL DNase אני המניות 70 הצפת RDD μL (הן מסופק ערכת RNeasy). מוסיפים את 80 μL DNase אני הצפת לערבב RDD הדגירה הממברנה טור דגירה RNeasy ובמשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הוסף חוצץ 350 μL RW1 (ערכת RNeasy) לעמודה צנטריפוגות RNeasy עבור 15 שניות בסל"ד 10,000 לשטוף את הממברנה. בטל לשטוף eluted צינור איסוף.
6. מניחים את הטור ב RNeasy צינור חדש מ"ל 2 אוסף (מסופק בערכה RNeasy). הוספת 500 הצפת הרשתית μL (קיט RNeasy) לעמודה צנטריפוגות RNeasy עבור 15 שניות בסל"ד 10,000 לשטוף את הממברנה. בטל לשטוף eluted.
7. הכן אתנול 80% באמצעות RNase ללא מים (קיט RNeasy). הוספת 500 μL של אתנול 80% בצנטריפוגה columnand RNeasy 2 דקות 10,000 סל"ד. בטל לשטוף eluted.
8. מניחים את הטור ב RNeasy צינור חדש מ"ל 2 אוסף (קיט RNeasy) ו צנטריפוגות במלוא המהירות במשך 5 דקות. מחק כל לשטוף eluted צינור איסוף.
9. מניחים את הטור ב RNeasy צינור חדש מ"ל 1.5 אוסף (ערכת RNeasy). מוסיפים מים 14 μL RNase חינם (קיט RNeasy) למרכז הממברנה עמודה צנטריפוגות במשך דקה 1 במלוא המהירות. איסוף תסנין עם מטוהרים RNA ולהעביר קרח אם יצירת cDNA מיד או לאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
10. שעתוק לאחור באמצעות Omniscript.Dilute מעכב RNase לריכוז סופי של 10 יחידות / μL ב קר כקרח 1x הצפת RT. וורטקס למשך 5 שניות, צנטריפוגה הדופק למשך 5 שניות. הכינו תערובת אב טרי על הקרח על פי עמוד 13 של פרוטוקול Omniscript. וורטקס למשך 5 שניות, צנטריפוגה הדופק למשך 5 שניות. המלץ להכין נפח mastermix 10% יותר מזו הנדרשת עבור סכום הנדרש עבור כל התגובות.
11. הוסף RNA תבנית של צינורות בודדים המכיל תערובת מאסטר. וורטקס למשך 5 שניות, צנטריפוגה הדופק למשך 5 שניות. דגירה של 60 דקות בשעה 37 ° C.
12. PCR הגברה של גנים ספציפיים hepatocyte (אלבומין) ו cholangiocyte באמצעות פולימראז HotStarTaq DNA. הכינו תערובת התגובה בעמוד 15 של הספר פרוטוקול HotStarTaq. המלץ primers דילול המניות ריכוז pm 20 / μl, עם צינור μL / תגובה 1 המשמש primers קדימה הפוכה. בהתאם למספר התאים השתמשו בתחילה להפקת RNA, אנו ממליצים על חלוקת cDNA הסופי בין 3 צינורות תגובה (β-אקטין עבור טעינה מלאה, אלבומין, ו KRT19) כדי להתחיל.
13. עיצוב ה-PCR פריימר מופיע בטבלה 1.
14. המקום צינורות לתוך תגובה thermocycler. המלץ התוכנית הבאה עבור הניסויים הראשוניים: 95 ° Cfor 15 דקות x 1 מחזור ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות x 35 מחזורים, ואחריו 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
15. מוצרי ה-PCR מנותחות באמצעות ברומיד ethidium ספוג agarose ג'ל.

7. אישור פוטנציאל הגידול של CD133 + בתאי גזע

1. הליך זה יכול להיעשות עם טרי תאים מבודדים בשלב 4 או באמצעות תאים בתרבית, כי כבר משלב 5. אנו ממליצים על ביצוע הניסויים הראשוניים עם תאים בתרבית, כמו תאים מבודדים טרי יהיה מופחת הכדאיות ואת התשואה מופחת.
2. Trypsinize תאים באמצעות טריפסין 0.05%, EDTA משלב 5.5 לעיל. לאחר דגירה 3-5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 100 μL של התקשורת זה טוב להעביר את כל הנוזל מכל טוב 5 צינורות בודדים מ"ל (1 = 1 גם צינור). הוסף 1 מ"ל התקשורת כדי צינור כל צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות.
3. Re-להשעות תאים 1 מ"ל קרח קר PBS. הסר 10 μl של השעיה תא PBS ולהוסיף 10 μl trypan כחול. באמצעות הרחקה trypan כחול, לקבוע מספרים של תאים חיים. אם באמצעות FACS בתאים מבודדים, מספר תאים ייקבע על ידי ספירת בידוד FACS.
4. צנטריפוגה תאים ב XG 200 במשך 5 דקות מחדש תלויה PBS בריכוז של 1 x 10 μl ⁶ cells/100 לחיות. הוסף 100 μl Matrigel. ששת בן שבוע החיסון לקויה עכברים עירום הוזרקו תת עורית באמצעות מחט 28 gague. הזרק 1 x 10 ⁶ תאים μl 200 לכל אתר.
5. עכברים מנוטרים על הגידול היומי. לאחר גידולים הטופס, בדרך כלל לאחר דגירה 3-4 שבועות, נפח הגידול נמדד באמצעות מחוגה (גובה x רוחב x אורך).

8. נציג תוצאות:

מהכבד, נורמלי Murine בריא, התשואה הצפויה של הסלולר CD133 + בתאי גזע הכבד 1000 עד 5000 לכל הכבד. תאים אלה הם נדירים יחסית בכבד שקט ולא תרחיב גם בתרבות. אנחנו לא ממליצים להשתמש בניתוח תא בודד על הכבד נורמלי התשואה של תאים קיימא כי תרחיב הוא נמוך ביותר.

עבור כבדי עם פציעה כרונית משמעותית, כגון דיאטה DDC 0.1% למשך 6 שבועות, ¹ או הנדסה גנטית, וכתוצאה מכך פגיעה כרונית, כגון MAT1a ^{- / -} או PTEN הכבד ספציפי ^{- / -} עכברים, ^2-4 מספר צפוי של cells מגביר מבודדים, עם כבד עד 100,000 תאים / מבודד (איור 2). אם תוך שימוש במודלים גנטיים, ידע של קצב הגידול ספונטנית הוא קריטי, כמו נהלים אלה עבור בידוד תא גזע כבד צריך להתנהל חיות חינם הגידול. לדוגמה, אם MAT1a ^{- / -} מודל צורות גידולים ספונטניים בגיל 18 חודשים, מומלץ להשתמש בבעלי חיים לא יאוחר מ 15-16 חודשים, לפני כל דיווח גידולים ספונטניים.

בידוד של תאים בודדים ממודלים פציעה כרונית תניב מספר (3-9 colonies/96 צלחת יפה) מושבות להרחיב מתאי פעם אחת את ההליך הוא שולט, ואת כדאיות התא מובטחת. איור 3 הנוכחי לשלב נציג לעומת תמונות של מושבות שמקורם בודד CD133 + תאים מורחבת לאחר 7 ימים.

אישור מעמד דו פוטנציאל נעשית באמצעות אלבומין ו Krt19 RT-PCR. מושבות של תאים בודדים מורחבת תדגים הן ביטוי של סמנים hepatocytes (אלבומין) ו cholangiocytes (Krt19). איור 4 מראה דו פוטנציאל הביטוי משלוש מושבות מבודדות, עם כ 25 תאים / מושבה בבית 7 ימים.

CD133 + בתאי גזע מהכבד נורמלי פגיעה בכבד הנגרמת כימית (כגון דיאטה DDC 0.1% למשך 6 שבועות) לא יהוו גידולים בעכברים בעירום. CD133 + בתאי גזע מודלים גנטיים ספציפיים (MAT1a ^{- / -} או PTEN הכבד ספציפי ^{- / -} עכברים) יהוו גידולים בעכברים בעירום אם מבודדים מאוחר בשלב טרום סרטניים מאוחר פציעה כרונית. זה פנוטיפ להרכיב הגידול מזוהה כיום כמו תא גזע סרטניים ^2-4 לדוגמה, MAT1a ^{-. / -} עכברים בצורת גידולים בכבד ספונטני בגיל 18 שבועות. CD133 + גזע בכבד תאים מבודדים ב 15-16 שבועות, בשלב מאוחר פציעה כרונית של מחלת כבד, יהוו גידולים בעכברים בעירום. איור 5 מדגים גידולים נציג הזרקה דו צדדי של 1 x 10 ⁶ תאים במבחנה מורחבת של יחיד CD133 + בתאי גזע כבד.

גן	קדימה פריימר	הפוך פריימר
β-אקטין	5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 "	5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 "
אלבומין	5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 "	5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 "
קרטין 19	5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 "	5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 "

טבלה 1: תחל עיצוב RT-PCR

איור 1: סכמטית כוללת של שיטות.

איור 2: CD133 + בתאי גזע כבד מאוד לזהות חלק מועשר CD45 לא parenchymal מדולדל הכבד בקרה וללא כל פגע מן wild-type עכברים מדגים 0.4% CD133 + תאים בתוך שבריר מועשר CD45 לא parenchymal מדולדל.. בשנת הגנטי עקום החוצה MAT1a ^{- / -,} המהווה מודל של פגיעה בכבד כרוני, האוכלוסייה CD133 מתרחב פי 10 או יותר בשבריר מועשר אותו.

איור 3: הרחבת מושבות של יחיד CD133 + שיבוטים שלב, לעומת תמונות של ארבע מושבות שמקורם בודד CD133 + תאים מורחבת על laminin 96 צלחות מצופים היטב..

איור 4:. Bi-פוטנציאל ביטוי גנים מתוך CD133 + תא גזע כבד מושבות מורחבת clonally ביום 7, מושבות כ 25 תאים. התבטאות גנים מדגים ביטוי סמן סמן hepatocyte אלבומין ו cholangiocyte Krt19, המאשר דו פוטנציאל מעמד CD133 + תאים.

איור 5: CD133 + בתאי גזע כבד טופס גידולים בעכברים בעירום חצים מצביעים גידולים הגוברת 4 שבועות לאחר 1x10 ⁶ תאים CD133 + מוזרק מן MAT1a ^{- / -} מודל.. CD133 + תאים המושרה פציעה רעלן כבד כרונית, כגון CCL ₄ או 0.1% דיאטה DDC, לא יוצרים גידולים. היווצרות גידול משמש לזיהוי פוטנציאל ממאיר, או גזע סרטניים פנוטיפ התא בתוך האוכלוסייה בתאי גזע.

Discussion

בניגוד למערכת hematopoietic, שבו בתאי גזע hematopoietic אחראים לשמירה מערכת בידול הסלולר replacesnormal פיזיולוגי להתהפך של לויקוציטים, בתאי דם אדומים וטסיות דם, תא גזע בכבד, או מבוגר ובתאים בכבד, אינם משתתפים כבד נורמלי הומאוסטזיס. ^​​5,6 לאחר פגיעה בכבד חריפה או כריתה חלקית, hepatocytes, כמו אפיתל הכבד הבדיל, לעבור כמה סיבובים של התפשטות להחליף את מסת הכבד לאיבוד. ^5,6 רק במהלך פציעה כרונית הם גזע לתאי הכבד נצפתה להתרבות. ^{1,5 -11,} אלה המבוגרים איבר ספציפי בתאי גזע מוצעים להתמיין גם hepatocytes ו cholangiocytes. ^1,5-8 מעניין, הרוב המכריע של סרטן הכבד מתפתחת על רקע של פגיעה כרונית, וכך גזע לתאי כבד הם שיערו גם להיות מבשרי עבור משנה של סרטן הכבד. ^2-4,12-17

אחד האתגרים העיקריים גזע עובדים תא הכבד הוא בידוד של אוכלוסיות נדירות של תאים לניתוח פונקציונלי. למשל, הרוב המכריע של תאים בכבד הם hepatocytes, אשר גדול יותר באופן משמעותי מאשר cholangiocytes אחרים קטנים יותר שאינם parenchymal תאים. על ידי שבירת כל הכבד לתאים תאים (hepatocytes גדול - חלק parenchymal תאים קטנים יותר - שאינם parenchymal חלק), ועוד בחירה של תאים CD45 שלילי (לא hematopoietic תאים), אנו מסוגלים להעשיר את האוכלוסייה החל בתאי גזע על ידי מעל 600 של פי. ^1,18-21 לציין, אנחנו בשום אופן המעידים כי האוכלוסייה CD133 + היא אוכלוסייה 100% טהור בתאי גזע, אבל ברור מייצג אוכלוסיה הטרוגנית של תאים, עם באים ממשפחות שונות ואת הפוטנציאל ואכלוס. אחת המגבלות העיקריות של התחום היא הגדרות של בתאי גזע ובתאים. אנו משתמשים "תא גזע" טווח רחב יותר בעבודה זו, אלא בהגדרה מחמירה, CD133 + לא parenchymal תאים מייצגים אוכלוסייה דו אבי השושלת. בהתחשב במצב הנוכחי של גזע ומחקר ובתאים בכבד, דוח זה מספק נקודת זינוק חוקרים המעוניינים בתחום זה. כמו סמנים חדשים לצוץ, כגון EpCAM, ^22,23 או גורמי שעתוק, כגון Sox9, ²⁴ הם יכולים להיות משולבים. לדוגמה, מצאנו שיעור גבוה למדי של חפיפה בין EpCAM תאים + ו-CD133 + תאים.

בדו"ח זה, אנו בפירוט תהליך של בידוד תא גזע מהכבד Murine נורמלית, כמו גם פגיעה כרונית מודלים הכבד, אשר גדל להפגין גזע כבד התפשטות תאים. לשיטה זו יתרונות ברורים על פני אימונוהיסטוכימיה תקן של הכבד קבוע קפוא או פורמלין כפי מחקרים תפקודית באמצעות תאים חיים יכול להתבצע לאחר בידוד. ^1,3,4 המטרה הספציפיים של התהליך הזה היא לבודד אוכלוסייה טהורה יחסית של גזע לתאי כבד שיכול יורחב clonally במבחנה.

המגבלה העיקרית בהליך זה היא כי הרוב המכריע של תאים בודדים לא תהיה בת קיימא לאחר cytometry זרימה (ראה סעיף קליעה Trouble). זוהי תוצאה של שעות נדרש להכין את התאים, ואת ההליכים הרבים הנדרשים כדי לחדד את האוכלוסייה לפני הבידוד. אם הכבד מתעכל ההשעיה תא בודד לניתוח FACS מיידית, את ההבדל בין גודל hepatocytes ולמוסדות אחרים ללא כוונת parenchymal תאים יגרום ליצירת FACS יעיל שער בלתי אפשרי. אם לא parenchymal בתאי הכבד מנוצלים, ללא סילוק תאים hematopoietic, קיים סיכון כי מספר משמעותי של תאים CD133 + עשוי להיות ממוצא hematopoietic עלול לזהם את השבר. יתר על כן, על ידי עיבוד התאים דרך מסנן Miltenyi, רק תאים בודדים ואשכולות קטנים מאוד של תאים נאספים. הדבר מבטיח כי המדגם לא סותמים את המחט צריכת FACS.

חלופות הליך זה כולל שינוי עבור כל סמן פני חלופה התא, כגון CD49f, EpCAM, או צירוף של סמנים, כגון CD133 + + EpCAM דו"ח שפורסם second מנצל שיפוע צפיפות לבודד גזע לתאי כבד מן חלק בלתי parenchymal. הליך זה מחייב צנטריפוגות Ultra-(8000 XG), מוסיף זמן משמעותי הנוהל, שעל פי ניסיוננו, הקטינה באופן משמעותי מראש FACS תשואה הסלולר ופוסט FACS הכדאיות. ⁸

ניסויים עתידיים כוללים מגוון רחב יותר של ניתוח ביטוי גנים, ביניהם גנים בכבד העובר, כגון HNF3, HNF4α, ועל כן αfp.In, ניתוח כתם immunocytochemistry המערבי של חלבונים הביע יכול להיות מנוצל כדי לאשר RT-PCR התוצאות של תאים בתרבית.

נושא אחד לציין הוא העבודה האחרונה כי זיהו CD133 ביטוי בתאי stellate הכבד. ²⁵ כעת אנו שגרתי מסך דגימות שלנו סמנים של תאים stellate (ראה סעיף קליעה Trouble), ויש להם לא אידentified זיהום משמעותי שברים שלנו. זו עשויה להיות קשורה בטכניקות שונות של מערכת העיכול והכבד ובידוד התא. ^2,3,26

בהתבסס על העובדה כי הרוב המכריע של תאים לא תהיה בת קיימא מיד לאחר בידוד FACS, אנו ממליצים כי התאים להיות מצופה, או כפי בתפזורת CD133 + תאים או תאים בודדים, לפני השימוש בבעלי חיים. 5-7 ימים במבחנה יביא לשיפור משמעותי של התוצאות של ניתוח הגידול. בנוסף, בהתחשב בתלאות בידוד תא בודד, זה צריך להיעשות רק פעם מושבות ניתן להרחיב מ CD133 בתפזורת + תאים מבודדים. דיון מעמיק יותר מהתנאים תרבות שונים וחלבונים פיגום אשר עשוי להיות מנוצל כדי גזע ותרבות הכבד ובתאים התאפיינה גם על ידי לולה ריד. עבודה זו מספקת תנאים חלופיים שינויים, אשר החוקרים עשוי לשלב תוכנית המחקר שלהם פעם אחת הטכניקות הבסיסיות הן בידוד שולט. ^27,28 ד"ר יצירתו של ריד מספקת גם ניתוח מפורט יותר של הביולוגיה השושלת והתבגרות בין בתאי גזע כבד ואת אבות מחויב.

במונחים של ניתוח הגידול vivo, יש לנו הצלחה באמצעות טרי תאים מבודדים תאים מורחבת clonally CD133 + תאים במבחנה, בעיקר באמצעות 1x10 ⁶ תאים. התמקדנו זנים ontwo הגנטי של פגיעה בכבד כרוניים, MAT1a ^{- / -} ו PTEN הכבד ספציפי ^{- / -} עכברים, ויש לנו מנוצל בשני עכברים בעירום wild-type עכברים כמארחים עבור הגידול. מניסיוננו, CD133 + בתאי גזע כבד רק טופס גידולים אם הם מבודדים פגיעה משמעותית מודלים כבד כי הם טרום ממאירים. ראוי לציין, כי גידולים נוצר CD133 + תאים בכלל יש גם קרצינומה hepatocellular ותכונות בסרטן כיס המרה, דבר המצביע על תא גזע או מוצא התא ובתאים של גידולים. ^2-4,29

מעקב אחרי עובדים גידולים מתועדים כולל ניתוח פתולוגי תקן של רקמת הגידול (H & מכתים E) מכתים immunohistochemical. בנוסף, גידולים יכולים להיות טחון מתעכל לניתוח FACS מחדש או תרבות. ^2-4,30

לסיכום, יש לנו נוהל מפורט הבידוד, הרחבת, ואפיון הבסיסיים של CD133 + בתאי גזע כבד CD133 + סרטן בתאי גזע.

צרות הירי:

CD45 זיהום:

עבור שלב 3, אם יש זיהום CD45 + תאים, אשר ניתן להעריך על ידי הוספת CD45-FITC Ab לפני ניתוח FACS ובידוד, לבדוק על מנת להבטיח כי נוגדן CD45 microbead אינו פג וכי תסנין נאסף רק בעוד מסנן היה בעל מגנטי. תסנין כל שנאספו תוך המסנן אינו בעל מגנטי יכיל תאים CD45 +.

התא נמוכה מספר:

עבור הכבד שלם, המספר הכולל של CD133 + לא parenchymal מבודד עשוי להיות פחות מ -10,000. תאים אלה הם נדירים בכבד שקט. עבור דגם פציעה כרונית, כגון הדיאטה 0.1% DDC, המספר יגדל באופן משמעותי עד 100,000 תאים. אם מספר תא הכולל הוא נמוך משמעותית מספרים אלה, נושא אחד שצריך לקחת בחשבון הוא מכתים Ab FACS. בדוק כדי לוודא Ab CD133 אינו פג, כפי מכתים עניים תגרום תשואה גרועה. כמו כן, אנו ממליצים על ביצוע ניתוח FACS הלא parenchymal בתאי הכבד על מנת לקבוע את האוכלוסייה יחסית לפני בידוד FACS ניסיון.

תא הכדאיות נמוכה לאחר FACS:

אחת הבעיות של הקיום עשוי להיות קשור איך התאים מעובדים על פני זמן מה. באופן אידיאלי, התא כולו בידוד ההליך, צעדים 1-4, צריכה להתנהל ללא עיכובים בין השלבים וסיים באותו יום. כל עיכוב משמעותי בין שלבים 1-4 יהיה לצמצם במידה ניכרת את הכדאיות התא. בעיה שנייה הקשורה כדאיות התא עשויה להיות קשורה ללחץ נדן המשמש לבידוד FACS. אנו ממליצים להשתמש בלחץ נמוך נדן. לבסוף, לאחר תאים מבודדים, הם צריכים להיות מצופה מיד, כמו כל אחסון משמעותי על הקרח לאחר מיון יהיה גם להפחית את הכדאיות.

CD133 + לא parenchymal ההטרוגניות:

דיווחים אחרונים מצביעים על כך stellate תאים בכבד יכול להיות גם CD133 הביטוי יש פלסטיות. ²⁵ לפיכך, בנוסף אימות עוצמה דו גנים עם אלבומין ו Krt19, אימות נוסף יכול לכלול גנים הקשורים בתאי stellate, כגון חלבון fibrillary גליה חומצי בתאי stellate שקט ו אלפא חלקה אקטין שרירים desmin בתאי stellate הופעל. ^3,4,26 בנוסף, האוכלוסייה CD133 + מייצג אב באוכלוסייה רחבה יותר. תוספת של סמן שנייה, כגון EpCAM, עשוי לסייע לחדד את האוכלוסייה נוספת, ההטרוגניות גבול.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
DMEM: F12	Invitrogen	10565-018	עם פנול אדום
CD45 microbeads	Miltenyi	130-052-301
פקטור גדילה hepatocyte	סיגמא	H1404
הצמיחה אפידרמיס גורם	סיגמא	E4127
DNase	סיגמא	DN25	1 גרם
Collagenase D	רוש	1088874
Pronase	רוש	0165921
70 מיקרון רשת מסננת	דיג	352350
Omniscript RT	Quaigen	205111	50 תגובות
HotStarTaq	Quaigen	203203
Miltenyi טור LD	Miltenyi	130-042-901
CD133-PE FACS Ab	eBioscience	12-1331-82
Laminin צלחות מצופה	BD	354410	96 גם
טריפסין 0.05% EDTA	Invitrogen	25300-354	100 מ"ל
RNeasy מיקרו Kit	Quaigen	74004	50 עמודים עבור 5x10 5 תאים או פחות
פארם Lyse	BD	555899	10X ריכוז