LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

Summary

כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

Abstract

התערבות RNA (RNAi) הוא מנגנון פנימי הסלולר לרגולציה של ביטוי גנים. רתימת העוצמה המולדות של מערכת זו מאפשרת לנו רמת גן מציאה ביטוי בהפסד של מחקרים לתפקד גן.

ישנן שתי שיטות עיקריות לביצוע RNAi. הראשונה היא השימוש RNAs התערבות קטנה (siRNAs) כי הם מסונתז כימי, והשני מנצל מכבנה קצר RNAs (shRNAs) מקודד בתוך פלסמידים ^1. האחרון יכול להיות transfected ישירות לתוך התאים או ארוזים לחלקיקים שכפול פסול lentiviral. היתרונות העיקריים של שימוש shRNAs lentiviral היא הקלות של הכנסת לתוך מגוון רחב של סוגי תאים, היכולת שלהם להשתלב ביציבות הגנום עבור מציאה גן ארוך טווח הבחירה, ואת יעילותם בניהול תפוקה גבוהה אובדן מסכי לתפקד. כדי להקל על יצרנו את LentiPlex ונקווה ספריה shRNA.

MISLentiPlex שיאון אנוש ספריית shRNA משולב הוא בריכה הגנום כולו lentiviral מיוצר באמצעות תהליך קנייני. הספרייה כוללת למעלה מ 75,000 מבנים shRNA מאוסף TRC מיקוד 15000 + גנים אנושיים ^2. כל ספריה נבדק לייצוג shRNA לפני שחרור המוצר, כדי להבטיח כיסוי ספריה חזקים. הספרייה היא סיפקה בפורמט מוכן לשימוש lentiviral בבית titers של לפחות 5 מ"ל 10 x ⁸ / TU באמצעות assay p24 ו מראש מחולקים לעשרה subpools shRNA של כ 8000 מבנים כל אחד. Primers הגברה וסדר ניתנים גם לצורך זיהוי מטרה במורד הזרם.

מחקרים קודמים הקימה פעילות antitumor סינרגיסטי של TRAIL בשילוב עם פקליטקסל ב A549 תאים, ריאה אנושית קרצינומה של תאים קו ^{3, 4.} במחקר זה אנו מדגימים את היישום של ספרייה ונקווה LentiPlex shRNA במהירות לנהל מסך הבחירה חיוביות גנים המעורבים o cytotoxicityו A549 תאים כאשר הם נחשפים TRAIL ו פקליטקסל. אחד המחסומים נתקל לעתים קרובות עם תפוקה גבוהה מסכי העלות וקושי deconvolution, אנחנו גם פרט גישה חסכונית polyclonal ניצול סידור המסורתית.

Protocol

LentiPlex משולב מסך ההתקנה

כדי לזהות רצפי shRNA של עניין, חשוב להגדיר את המסך כך שרוב התאים מקבלים רק אחד shRNA לבנות. באמצעות משרד הפנים נמוך (ריבוי של זיהום), ההסתברות של integrants מרובות לכל תא הוא ירד מאוד. עם זאת, יעילות התמרה, ו MOIs הרצוי ולכן תלוי מאוד בסוג תא היעד. לכן, זוהי חובתו של משרד הפנים להגדרה אופטימלית מתבצעת לפני תחילת המסך בסוג התא החדש.

1. התמרה של תאים יעד LentiPlex עם משלחת משולב shRNA הספריה

1. בפועל משרד הפנים להשתמש ישתנו עבור תאים מסוגים שונים. אם הם משכפל הרצוי ואז מספר צלחות יש להגביר בהתאם. בנוסף, בדרך כלל זה לא יהיה יתרון לשלב את subpools שונים. שמירה subpools הנפרד יסייע בתהליך deconvolution. ודא נכסr תיוג של כל מנה רקמה תרבות עם מספר subpool שמוחל במהלך התמרה. נמוך הפנים מומלץ להפחית את ההסתברות integrants מרובות לכל תא.
2. יום 1 - Seed את המספר המתאים של 60 מ"מ צלחות עם מספיק תאים כדי להשיג ~ 70% confluency ביום המחרת (10 בריכות בסך הכל, כל אחד ביצע בשלושה עותקים = ​​30 מנות בסך הכל). לצורך המחקר שלנו, 60 מנות מ"מ היו זורעים עם 6 x 105 A549 תאים להשיג confluency של 70% לפני התמרה. הדבר מבטיח כי התאים הם עדיין בשלב הצמיחה המעריכית. שיעורי הצמיחה משתנה בהתאם לסוג התא צריכה להיקבע לפני תחילת המסך.
3. אפשר תאים לדבוק דוגרים על ידי לילה ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified באווירה של 5% CO _2.
4. (אופציונאלי) כלילת שני נוסף 60 מ"מ מנות עבור התמרה עם shRNAs בקרה שלילית. לייבל את הכלים "שליטה" על SHC001H ו "בקרת B" עבור SHC002H.
5. יום 2 - ה Transduceדואר תאים עם חלקיקי LentiPlex ויראלי. ביום של התמרה, להפשיר את חלקיקי lentiviral על הקרח.
6. העברת חלקיקי מופשר אל מכסה המנוע זרימה למינרית ולשמור על הקרח, אם לא בשימוש מיידי.
7. לחשב כמה כל אחד בבריכה תת אדם ויראלי להוסיף את התאים כדי לקבל את משרד הפנים של 1 בכל הכלים תרבית תאים.
   1. דוגמה: 1 x 10 ⁶ תאים / תבשיל; titer ויראלי = 5 x 10 ⁸ TU / מ"ל; הרצוי של משרד הפנים 1. ט) 1 x 10 ⁶ תאים / תבשיל x (של משרד הפנים 1) = 1 x 10 ⁶ יחידות transducing (TU) צריך ב.) 1 x 10 ⁶ TU / (5.0 x 10 ⁸ TU / מ"ל) המתקבל C של = 2 μL של פתרון מניות lentiviral יש להוסיף את המנה המתאימה. לדלל את כמות מחושבת של הנגיף μL 100-300 התקשורת להשלים כדי להבטיח חלוקה טובה יותר של הנגיף כאשר הוסיף בצלחת תרבית תאים.
8. הסר מדיה מן התאים מראש seeded. הוסף להשלים התקשורת containing ברומיד hexadimethrine פתרון כל מנה. הריכוז הסופי של ברומיד מומלץ hexadimethrine בתקשורת הוא 8 מיקרוגרם / מ"ל. השתמש ברומיד hexadimethrine פחות אם אתה מוצא את זה כדי להיות רעיל לתאים היעד שלך.
9. הוסף חלקיקים shRNA lentiviral אל הכלים המתאימים בהתאם לעיצוב הניסוי מראש. בעדינות מערבולת הצלחות כדי לפזר באופן שווה על פני הנגיף לתאים.
10. דגירה 18-20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified באווירה של 5% CO _2.
11. (אופציונלי) חזור על 3-8 על זהות משרד הפנים עם SHC001H (ריק וקטור shRNA הבקרה) בכלי בקרה A ו SHC002H (מקושקשות shRNA שליטה) בחוק הפיקוח דיש ב התייחס הכלים האלה זהה את הכלים ניסיוני לאורך הניסוי.
12. יום 3 - שנה את התקשורת. לשאוב וירוס המכילים מדיה להוסיף מדיה שלם טרי (ללא ברומיד hexadimethrine). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

2. התייחס מצופהתאים עם רכיב טיפולי מגיב /

1. יום 4 - מדיה לשאוב מבארות ולהוסיף התקשורת טרי המכיל מרכיב טיפולי בריכוז האופטימלי. כמו עם התנאים תרבות, טיפולים ישתנו ריכוזי נכונה המשכים צריך להיקבע מראש. במחקר זה, השתמשנו באפשרות 100 ng / mL של TRAIL ו 1 מיקרומטר של פקליטקסל. תאים שטופלו במשך 48 שעות.
2. התאים שורדים צריך להיות מחדש seeded לתוך צלוחיות T75 ואיפשר להרחיב עד כמעט 100% ומחוברות.
3. (אופציונאלי) בסוף הבחירה, לבדוק בקרה צלחת ואת צלחת בקרה דיש ב A ו-B צריך צלחת לכל אחד מאיתנו יש מושבות פחות מ לפחות אחת המנות ספריה נקווה. אם יש מספר גבוה באופן בלתי צפוי של מושבות בצלחת, מאשר כל אחד את תהליך התמרה השפיע על מסלול הקשורים הפנוטיפ הרצוי או לחץ סלקטיבי אינו חזק מספיק מחדש אופטימיזציה של assay ייתכן שתידרש. אם B מהודרת מכיל מושבות רבות מדיאז הביטוי של shRNA ומעורבות של מסלול RNAi עלול להיות בעל השפעה על הפנוטיפ של עניין. אם זה לחזור על המקרה עם SHC001H, על מנת להבטיח כי ההשפעה אינה ספציפית SHC002H.

3. Deconvolution מן האוכלוסייה תא polyclonal

1. קציר האוכלוסייה הטרוגנית של תאים subpool כל לבודד הדנ"א הגנומי. בניסוי שלנו, תאים נשטפו בקצרה PBS ו trypsinized לפני הדנ"א הגנומי היה מבודד באמצעות GenElute היונקים הגנום Miniprep ערכת וסיפקה פרוטוקול (Sigma-Aldrich, G1N70). לחלופין, טיהור אחרים כל גנומית ערכות הזמינים כעת בשוק יכול לשמש לבידוד DNA. חשוב לעקוב אחר ההמלצות פרוטוקול בסכום התחלתי של תאים בתרבית.
2. PCR הגברה של מטרות. הליך ההתאוששות shRNA תבנית המאפשרת הגברה של הבריכה כולה מוסיף shRNA מן האוכלוסייה התא הנבחר, או שליפה של indiviכפול shRNA תבניות ממושבות כי נאספו בנפרד מורחבת. לאחר הגברה של מוסיף shRNA מתוך מלאה תאים היעד הנבחר, מוצרי ה-PCR יכול להיות רצף.
3. צעד זה הגברה PCR היה מותאם שימוש Sigma רדימיקס, קטלוג מס 'P2893. ריאגנטים אחרים יכולים לשמש הגברה, אבל בתנאי רכיבה על אופניים ו / או ריכוז מגנזיום ייתכן שיהיה צורך לשנות עבור הגברה מוצלח. Primers הגברה ב mM ריכוז 20 כלולים בערכה LentiPlex.
4. הגדר את תגובת PCR, כמתואר בטבלה 1. מוסיפים את המרכיבים לפי הסדר הרשום. הסכומים המתוארים כאן הם עבור one תגובה 50 μL. לתגובות נוספות, בהיקף תערובת רכיבים אמן על ידי המספר הרצוי של תגובות וכוללים overage 10%. כמות של תבנית ה-DNA המומלץ הוא 5-10 ng.
5. מומלץ מאוד כי התגובה תבנית אחת מורכבת של וקטור המשימה shRNA האדם בקרה חיובית מדולל כדי appropriate ריכוז. הגברה מוצלחת עם תבנית זו מציינת כי הרכיבים assay PCR ותנאי הרכיבה מספיקות. הערה: כדי למנוע זיהום שריד של דגימות חומרים כימיים ניסיוניים, הוא הציע כי שליטה חיובי להיות מדולל במיקום נפרד מהמקום שבו עוקבים PCR תגובות מוגדרים.
6. שמור את תוכנית ה-PCR המפורטים בטבלה 2 לתוך thermocycler שלך.
7. עבור מדגם זה, משלבים 3 תגובה PCR μL עם μL 1 של צבע ו electrophorese לצד μL 5 של DirectLoad ™ PCR 100 נ"ב סולם נמוך, מס 'קטלוגי D3687 על 1% agarose ג'ל כדי לאשר את קיומו של amplicon 309 נ"ב.
8. Subcloning של PCR amplicons: מוצרי PCR היו Topo משובטים באמצעות ערכת Topo ת"א שיבוט, בעקבות פרוטוקול של היצרן (Invitrogen, K4575-01). התוצאה היא מוצר אחד PCR הכלול וקטור אחד.
9. 250 מושבות חיידקים בודדים (שכל אחת מהן מכילה יחיד PCR amplicon) היו מבודדים לגדולn ב 2 תרבויות מ"ל של LB עם 100 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין. פלסמיד דנ"א הופק אז באמצעות פלסמיד GenElute Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. מטוהרים DNA פלסמיד היה מתעכל עם EcoRI ו electrophoresed כדי לאשר את קיומו של הכנס.
11. דגימות DNA פלסמיד היו רצף ואז להכניס shRNA מזוהה באמצעות shRNA LentiPlex רצף חיפוש במסד הנתונים המסופק עם הספרייה LentiPlex.

4. יעד זיהוי ואימות

1. רצף shRNA יוזם עם 5'-GAAACACCGG-3 ". הזן לפחות הבא 10 אך פחות מ 21 נוקלאוטידים כמו רצף שאילתה בתיבת החיפוש ב חיפוש המצורפת shRNA טופס רצף מסד נתונים של Access.
2. בחר את מינים של shRNA נקווה. לחלופין, בחר את subpool שממנו רצף נמצא.
3. כעת לחץ על כפתור "מצא כניסות פוטנציאל" כדי לבצע את החיפוש. זה אמור לזהות את הרצף המקביל TRC shRNA (ים) התואמים הדואר רצף נתונים. מידע נוסף על רצף TRC shRNA (ים) לזהות את יעדי הגן המקביל ניתן למצוא בקלות ב Sigma-Aldrich של ג'ין מועדף: http://www.sigma.com/yfg
4. הגנים שזוהו היעד צריך להיות מאומת על ידי חזרה על assay ההקרנה המקורי עם המשובט TRC המקורי בתוספת לפחות שני shRNAs נוספים היעד הגן אותו באמצעות 1 shRNA לעצב היטב 1. להיטים אמנם יציג את פנוטיפ זהה ברוב של בארות.

5. נציג תוצאות

דוגמה עבודה ונקווה LentiPlex מסך מפורט באיור 1. תאים transduced כי התרבו בנוכחות TRAIL ו פקליטקסל הורשו להרחיב עד צלוחיות היו ומחוברות. הדנ"א הגנומי היה לקצור נתון הגברה ו PCR שיבוט כפי שמודגם באיור 1, בטרם הוגשה לזיהוי רצף shRNA כמתואר Figuמחדש 1 ג 250 היו שיבוטים רצף, של 25 היו אלה המיוצגים על ידי מספר רב של שיבוטים ואת 225 הנותרים היו מיוצגים על ידי שיבוט רק 1 ולא נרדפו בשלב זה.

כפי שניתן לראות בתרשים 2, גנים מועמדים מספר כולל TBX3, PPP2CA ו AKT2 היו מיוצגים על ידי כפילים מרובים. הגורם T-box שעתוק, הופיע TBX3 בסך הכל של ארבעה שיבוטים כבר מעורב הגירה הגידול ^5. Downregulation PPP2CA הודגמה לשמר את הצמיחה של תאים בתרבית בתנאים LNCaP חסר אנדרוגן על ידי להקלת אנדרוגן, מניעת המושרה תא מחזור מעצר ומניעת אפופטוזיס ^6. AKT2 הוא סרין RAC-beta / תראונין חלבון קינאז ו oncogene המשוערת הפגינו לשחק מספר תפקידים בסרטן הפיתוח ^{7, 8.}

* ריכוז סופי של Mg ^{2 +} בתמיסה יהיה 3 מ"מ;1.5 מ"מ הוא תרם מן רדימיקס תקי ו 1.5 mM מפתרון מגנזיום כלוריד.
1. טבלת Lentiplex תגובת PCR תנאי

2. טבלה Lentiplex PCR תוכנית הגברה

באיור 1. (א) LentiPlex ונקווה המסך, (ב) עבודה deconvolution polyclonal, ו (ג) זיהוי של מטרות shRNA.

LentiPlex א ונקווה המסך. ראשית, תאים Seed, ולאחר מכן להוסיף subpools shRNA, (10 בריכות בסך הכל, כל אחד ביצע בשלושה עותקים, עבור 30 מנות בסך הכל). בשלב הבא, לטפל עם רכיב טיפולי מגיב / (במקרה שלנו, שביל אבאclitaxel, בהתאמה). ואז, ולזרוע מחדש תאים לשרוד צלוחיות ולאפשר להרחיב. קציר אוכלוסייה הטרוגנית של תאים subpool כל לבודד הדנ"א הגנומי.

Deconvolution ב polyclonal. בצע PCR להגביר DNA המכיל את הכנס shRNA. מוצר ה-PCR אחיד בגודל, אבל polyclonal ברצף מאז gDNA תבנית גם polyclonal. מוצר ה-PCR משובטים לתוך וקטור והפך לאחר מכן לתוך חיידקים המוסמכות.

ג זיהוי מטרות shRNA. מושבות בודדים מבודדים פלסמיד דנ"א מופק. כל כפיל מכיל את וקטור שיבוט עם פיסה PCR בודדים. פלסמיד דנ"א מתעכל כדי לאשר את קיומו של הכנס ועל רצף. הכנס את shRNA מזוהה באמצעות shRNA LentiPlex רצף הנתונים חיפוש.

באיור 2. שזוהו יכולגנים didate. 25 גנים מועמדים שזוהו שהיו להיטים רבים. 225 גנים מועמדים רק 1 פגע לא נרדפו. אנא ראה לוח 1 משלים עבור התמוטטות של שיבוטים בודדים לכל גן מועמד.

משלים טבלה 1. הפרט TRC שיבוטים ספריית שזוהו מתוך סידור polyclonal ID Gene כניסות המשובטים זוהה.

Discussion

במחקר זה, אנו מציגים מסך הגנום כולו כדי לזהות גנים המעורבים cytotoxicity של תאים A549 בעקבות הטיפול פקליטקסל / TRAIL. השימוש בגישה נקווה מסך הגנום כולו מפחיתה את הזמן, עלות ההשקעה בציוד הקשורים בדרך כלל עם מסכי ערוכים קונבנציונאלי. קריטי להצלחה של המסך הם ביצעו ניסויים אופטימיזציה מראש. התנאים התמרה ואת משרד הפנים צריכה להיקבע באופן אמפירי.

שיטת הבחירה צריך לאפשר בחירה חזקים של תאים המציג את הפנוטיפ הרצוי (למשל, הישרדות, ביטוי חלבון פני השטח, וכו '). אופטימיזציה של הפרמטרים הללו יהיה לצמצם את מספר תוצאות חיוביות שגויות שאותרו.

כאן, gDNA היה שנקטפו מן האוכלוסייה עיקר התאים הנבחרים ולאחר מכן Topo משובטים לזהות מוסיף shRNA בודדים. אחת שיפור אפשרי עבור ניסוי זה היה כדי לבחור עבור תאים חיים באמצעות FACS על מנת להבטיחרק תאים חיים נאספים. מטרות זיהו יהיה תוקף על ידי התמרה עם יעד ספציפי shRNAs ב assay הקרנה. להיטים אמנם יציג את הפנוטיפ ברוב הבארות.

ספריית LentiPlex משולב גמישה בבקשתו. זה תואם עם מגוון רחב של יישומים הזרם וניתן להשתמש באסטרטגיות בחירה חיובי או שלילי. בהתאם לתנאי ההקרנה, deconvolution של מוסיף shRNA מושגת באמצעות PCR / שיבוט, microarray, או הדור הבא של רצף ^{9, 10.} בעוד הכוח והמהירות של טכניקות אלה deconvolute מסכי RNAi היא מבוססת היטב, דאגה אחת עם microarray ו הדור הבא של שיטות ריצוף הוא הזמינות של ביואינפורמטיקה המשאבים והידע הדרושים כדי לנתח ולפרש נכונה תוצאות הניסוי. העלויות הכרוכות טכניקות אלה יכולים לעתים קרובות פעמים להיות מכשול ההתחייבות של מסכי הגנום רחב. APCR / שיבוט הגישה מבוססת, בעוד לא חזק כמו microarrays ואת הדור הבא סידור מהווה חלופה העלות האפקטיבית נמוכה יותר.

Agilent מציעה כעת מערך מותאם אישית המבוסס על ספריית TRC shRNA לסיוע נוסף מסכי LentiPlex. אפשרויות אלה לאפשר לחוקרים להשתמש LentiPlex ללמוד מגוון רחב של תפקודים תאיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוג
LentiPlex מערך משולב	Sigma-Aldrich	SHPH01
תאים A549	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	oductDetail.do? lang = he & N4 = T5694% 7CSIGMA & N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> T5694
פקליטקסל	Sigma-Aldrich	T7402
Topo ת"א שיבוט Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart תקי רדימיקס	Sigma-Aldrich	ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> P2893
GenElute ערכת פלסמיד Miniprep	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	ניו אינגלנד Biolabs	R0101
hexadimethrine ברומיד	Sigma-Aldrich	H9268