ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

Summary

שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.

Abstract

הפרוטאזום הוא אברון התאי העיקרי מעורב בפירוק החלבונים של חלבונים, לא תקינים, misfolded פגום או מתחמצנים ^{1, 2.} תחזוקה של פעילות הפרוטאזום הייתה מעורבת בתהליכים תאיים חשובים רבים, כמו תגובתו של תא לחץ ^3, רגולצית מחזור תא והתמיינות תאי ⁴ או בתגובה של מערכת חיסון ^5. התפקוד הלקוי של מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום כבר קשור להתפתחות של גידולים ומחלות ניווניות ^{4, 6.} בנוסף, ירידה בפעילות הפרוטאזום נמצאה כתכונה של הזדקנות תאית והאורגניזם ^{7 הזדקנות, 8, 9, 10.} כאן, אנו מציגים שיטה למדידת פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים באמצעות חלבון היתוך GFP-DGN. כדי להיות מסוגלת לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים ראשוניים, הדנ"א משלים בונה מקודד חלבון היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) DGN-(GFP-DGN, לא יציב) וריאנט נושא מוטצית frameshift (GFP-dgnFS, ¹¹ יציבים) מוכנסים בוקטורי הביטוי lentiviral. אנחנו מעדיפים טכניקה זו על טכניקות מסורתיות transfection כי זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלוי בסוג התא או גילו של התורם. ההבדל בין פלואורסצנטי מוצג על ידי GFP-dgnFS (יציב) החלבון והחלבון המעורער (GFP-DGN) בהעדר או הנוכחות של מעכבי הפרוטאזום ניתן להשתמש כדי להעריך את פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בכל מתח תא מסוים. הבדלים אלה יכולים להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ epifluorescence או ניתן למדוד על ידי cytometry זרימה.

Protocol

1. בניית פלסמיד

1. אוליגו-נוקלאוטידים סדר המותאם אישית לקידוד DGN ⁽¹¹ ACKNWFSSLSHFVIHL) ולdgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) ולקשור אותו לוקטור pEGFP-C1 להשיג היתוך של GFP עם DGN / dgnFS (איור 1).
2. להגביר את רצף הקידוד לGFP-DGN וGFP-dgnFS באמצעות PCR בהתאם לפרוטוקול של קיט שיבוט topo יווני pENTR ולהמשיך בpLenti6/V5 topo שיבוט הקיט כיווני (איור 6).

2. ייצור וירוס

1. היום לפני transfection (יום 1) זרע החוצה 293FT תאי HEK בתוך T75 צלוחיות, כך שהם יהיו confluent 90-95% ביום transfection.
2. ביום transfection לדלל 36 μl של מגיב lipofectamine 2000 ב 1.5 מ"ל של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה ב15 מ"ל בז. השתמש 15 מ"ל בז אחר ולדלל 3 מיקרוגרם pLenti6/V5 נושא את הדנ"א המשלים לבנות לאו GFP -DGN או GFP-dgnFS, pMD2.G 2.5 מיקרוגרם מעטפת הקידוד פלסמיד ועמוד שדרת וקטור מיקרוגרם 7.5 psPAX2 ב1.5 מ"ל של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה. אחרי 5 דקות את ה-DNA המדולל משולב עם מגיב 2000 המדוללים lipofectamine.
3. דגירה את התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר את מתחמי ה-DNA lipofectamine לטופס.
4. הסר את המדיום של 293FT תאי HEK, להחליף אותו בזהירות על ידי 7 מ"ל של מדיום (ללא אנטיביוטיקה) ומוסיף את תערובת ה-DNA lipofectamine לבקבוק ורוקו הלוך ושוב לערבוב (יום 2). דגירת בקבוק הלילה על 37 מעלות צלזיוס בhumidified 5% CO ₂ חממה.
5. שינוי בינוני למחרת (10 מ"ל בינוני ללא אנטיביוטיקה; יום 3).
6. לאחר 48 שעות (יום 5) הקציר supernatant, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולסנן את supernatant דרך 0.45 מיקרומטר PVDF מסנן.

תרבות בינונית - DMEM (HEK 293FT)

אוהל "> DMEM
10% FBS
0.1 המ"מ MEM NEAA
6 מ"מ L-גלוטמין
פירובט נתרן MEM 1 mM
1% עט דלקת (לא חובה)
500 מיקרוגרם / המ"ל Geneticin (אופציונלי)

3. ריכוז נגיף על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

1. הוסף פתרון אחד נפח פוליאתילן גליקול (50 גליקול mM פוליאתילן, 41 המ"מ NaCl, חיטוי, pH = 7.2; PEG) ארבעה כרכים של supernatant ו הדגירה במשך 2 שעות ב 4 ° C. לערבב אותו בזהירות בכל 20-30 דקות על ידי היפוך.
2. ספין למטה XG ב 1500 למשך 30 דקות ב 4 ° C. גלולה לבנה צריכה להיות גלויה.
3. לשאוב supernatant וסרכזת שוב ב 1500 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב את פתרון PEG הנותר.
4. Resuspend הגלולה במדיום או פוספט נאגר מלוח (PBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה ומערבולת נמרצת במשך 20 עד 30 שניות. כקו מנחה לשימוש 500 μl T75 בקבוק אחד וaliquot אותו ל 100 μl. אחסן את הווירוס ב-80 ° C.

= "Jove_title"> 4. Titering של וירוס

1. זרעים מתוך 5 × 10 ⁴ תאים U2-OS לכל אחד גם מצלחת 6-גם היום לפני transfection.
2. ביום transfection להסיר את מדיום התרבות ולהחליפו ב1 מ"ל של DMEM המכיל 8 מיקרוגרם / המ"ל polybrene (hexadimethrine רומיד). דלל את הנגיף המרוכז supernatant 1:10 ו1:100 ולהוסיף כל μl 1 עד 1 היטב. לריכוזים גבוהים יותר וירוס להשתמש μl 1, 5 ו 10 μl μl של supernatant נגיף המרוכז לבארות שנותרו. אחד טוב שנשאר כביקורת חיובית.
3. למחרת להחליף את המדיום של 2 מ"ל של DMEM.
4. התחל עם הבחירה ביום למחרת. החל Blasticidin 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​על כל באר. החלף את המדיום המכיל אנטיביוטיקה בכל יום שני.
5. כ 6-7 ימים לאחר שהתחיל את בחירת תאי untransduced מתים. להכתמה לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולכסות את התאים עם קריסטל סגול (10 מ"ג / ליטר קריסטל סגולבאתנול 20%) ודגירה במשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר. Aspirate קריסטל הסגול (ניתן לעשות שימוש חוזר כמה פעמים) ולשטוף את בארות פעמים עם DDH ₂ O ולייבש את הצלחת.
6. ספירת המושבות ורבו עם 1000 והדילול המתאים (איור 7). הליך זה מאפשר לחשב יחידות transfection (TU) של הנגיף / המ"ל.

תרבות בינונית - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6 מ"מ L-גלוטמין
1% עט דלקת

5. תמרה של פיברובלסטים אנושיים דיפלואידיים (הליך זה יכול לשמש לכל סוג תא.)

1. זרעים מתוך 5 × 10 ⁴ fibroblasts אדם דיפלואידיים (HDFS) לצלחות 6-גם היום לפני התמרה.
2. השתמש ריבוי של זיהום של שניים יחד עם מיקרוגרם 8 / polybrene מ"ל כתמרה משפרת בסך של מ"ל אחד.
3. שינוי בינוני ביום למחרת.
4. כאשרהתאים הם ב70-80% מתחילת confluency בחירה עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin. לאחר הבחירה הושלמה (אין תאי untransfected יותר למות) ההתרחבות של התאים יכולה להתחיל והתאים מוכנים לניסויים. בחירה כרונית עם blasticidin מאפשרת לייצר יציבות תא קו overexpressing GFP-DGN או היתוך חלבוני GFP-dgnFS, מוכנים למדידת פעילות הפרוטאזום. הליך זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלויה בסוג התא.

6. מדידה על ידי זרימת cytometry

1. זרעים מתוך 1 × 10 ⁵ תאים (ביצוע או GFP-DGN או GFP-dgnFS) היום לפני הניסוי.
2. לטפל בתאי בקרה 3 שעות לפני המדידה עם מעכב הפרוטאזום, למשל 100 מק"ג / LLNL מ"ל.
3. לשטוף פעמים עם PBS ולקצור את התאים באמצעות 0.5 מ"ל של טריפסין. כדי להפסיק להשתמש trypsinisation 4.5 מ"ל של מדיום התרבות ולהעביר את התאים ל15 מ"ל בז.
4. ספין לאהוא תאים בטמפרטורה של 300 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
5. לשאוב את המדיום, resuspend תאים בPBS וספין למטה שוב ב 300 XG למשך 5 דקות בשעת 37 ° C.
6. לשאוב PBS, resuspend ב400 μl של FACS חיץ (10 Hepes מ"מ, 140 המ"מ NaCl, 2.5 המ"מ CaCl _2, pH = 7.4) ולהעביר את התאים לתוך צינורות FACS.
7. לשמור על התאים בדגימות קרח ולמדוד על ידי cytometry זרימה. התאים לא צריכים להיות מאוחסנים כבר מ 30 דקות ב 4 ° C.

7. נציג תוצאות

חלבון היתוך GFP-DGN נושא רצף שהוא ממוקד לפרוטאזום ולכן החלבון הוא מייד מושפל: היא מקבילה לירידה באות פלואורסצנציה GFP. Frameshift המוטציה (GFP-dgnFS) מבצעת גרסת מוטציה של הרצף הזה ולא מושפל על ידי הפרוטאזום, זה מוביל לפלואורסצנטי הירוק הגבוה יותר. מסיבות אלו, צעירים HDFS עם פעילות גבוהה הפרוטאזום צפוי וtransduced עם GFP-DGn להראות (6% תאים חיוביים) אות פלואורסצנציה נמוכה בשתי מדידות זרימת cytometry ובepifluorescence (איור 2 א 'וב', איור 3). אותו HDFS transduced עם GFP-dgnFS להציג 39.7% מתאים חיוביים. הטיפול בתאים עם המעכב LLNL הפרוטאזום (N-אצטיל-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) העלה את האות למקסימום של 62.9% בשניהם, GFP-DGN ותאי GFP-dgnFS (איור 2 א 'וב' ).

כדי לקבוע ירידה אפשרית בפעילות הפרוטאזום בדגימות עור אדם בגיל, עורי fibroblasts שבודד מתורמים צעירים, בגיל עמידה ומבוגרים היו נגוע בGFP-DGN וGFP-dgnFS, כפי שתואר לעיל, והוא גדל לאותו מספר מעבר לפני הניתוח על ידי זרימה cytometry. בניסויים אלה, עלייה מובהקת באות ה-GFP בין אנשים צעירים (11.2 ± 0.88% תאי GFP חיובי) ובגיל עמידת תורמים (20.4 ± 2.27% תאים GFP חיוביים, P = 0.003) נצפו, המציין ירידה בProteasפעילות Ome בדגימות שהתקבלו מתורמים בגיל ⁷ (איור 4). לא חל ירידה נוספת בפעילות הפרוטאזום נצפתה בפיברובלסטים שבודדו מאנשים ותיקים (איור 4). עוצמת קרינה לGFP-dgnFS הייתה בכל המקרים עד 90% (נתונים לא מוצגים) המצביעים על יעילות transfection גבוהה בשלוש קבוצות הגיל השונות.

איור 1. רצף GFP-DGN וGFP-dgnFS. הוצג הוא בסופו של ה-GFP-3'(ירוק) באתר השיבוט המרובה של pEGFP-CL1 הווקטור (אפור) ורצף DGN / dgnFS (אדום).

איור 2. ניתוח cytometry זרימה של ה-GFP-DGN ופיברובלסטים אנושיים דיפלואידיים GFP-dgnFS. א fibroblasts אדם הצעיר עורלה (HFF-2) היו נגוע בוקטורי lentiviral נושאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-DGN גן או GFP-dgnFS (frameshift) לבנות, כפי שצוין ונותח לGFP פלואורסצנטי באמצעות cytometry זרימה (FACS קנטו השני, הקיטון דיקינסון). איפה ציין, תאים טופלו גם ל3h עם מעכב הפרוטאזום N-אצטיל-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLNL). תאים נגועים שמשו כביקורת. ניסויים בוצעו בtriplicates. נתוני B. הם נציג של שלושה ניסויים עצמאיים. המספרים משקפים את כמות התאים חיוביים GFP. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. ניתוח פלואורסצנטי מיקרוסקופיה של ה-GFP-DGN וGFP-dgnFS HFF-2 תאים. צעיר HFF-2 היו כאל באיור 2. ב 9 ימים לאחר הדבקה, תאים היו visualized על ידי קרינה ומיקרוסקופ לעומת השלב.

איור 4. שינויים בפעילות הפרוטאזום בהזדקנות עור אנושית., הפיברובלסטים עורלת האדם מתשעה תורמים שונים בקבוצות הגיל שצוינו הורחבו מינימאליים ונגועים במבני lentiviral קידוד עבור GFP-DGN. ב 9 ימים לאחר הדבקה, התאים נותחו על ידי cytometry זרימה. נתונים התקבלו על שלוש דגימות בכל קבוצת גיל בכפילויות (± SE).

איור 5. גישה ניסויית. נוקלאוטידים מותאמים אישית-אוליגו לDGN וdgnFS המשובטים לתוך וקטור pEGFP-C1 ווירוסים מיוצרים עבור כל מבנה באמצעות 293FT תאי HEK. כייל של הווירוסים נקבע. תאי transduced עם הווירוס והתרחבו. לאחר הטיפול המועדף התאים מנותחיםלאות פלואורסצנציה ידי cytometry זרימה.

איור 6. מפה של pLenti GFP-DGN. המפה של וקטור pLenti6/V5-DEST כוללים רצף GFP-DGN מוצגת. קיצורים: PCMV (אמרגן CMV), GFP-DGN (רצף של ה-GFP-DGN), P _SV40 (SV40 אמרגן מוקדם), EM7 (EM7 אמרגן), Blasticidin (גן ההתנגדות Blasticidin), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR עם U3 אזור נמחק), SV40 הרשות הפלסטינית (SV40 אות polyadenylation), אמפיצילין (גן התנגדות אמפיצילין), PUC האורים (מקור PUC), PRSV / 5'LTR (אמרגן היברידי RSV / 5'LTR), Ψ (-HIV-1 אות אריזת Ψ ), RRE (אלמנט תגובת Rev-HIV-1).

איור 7. צלחת U2-OS titering. U2-OS נזרעה על צלחת 6-היטב וtransfected עם ריכוזי וירוסים שונים (דילול של 1/100 ו1 / 10, 1, 5 ו 10 μl של שיתוףncentrated supernatant הנגיפי). אחד גם שמש כשליטת untransfected (NT). לאחר 6-7 ימים, התאים היו מוכתמים בקריסטל סגול ואוויר היבש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרסום הראשון באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמצע לפעילות כתב היוביקוויטין-הפרוטאזום פורסם בשנת 2000 ^12. מאז, GFP הפך לכלי נפוץ לדמיין פעילות הסלולר, במיוחד בתהליך היוביקוויטין-הפרוטאזום. כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום in vivo במודל עכבר מהונדס ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
וקטור pEGFP-C1	BD Clontech Bioscience	6084-1
pENTR יווני topo שיבוט הקיט	Invitrogen	K2400-20
ערכת שיבוט topo יווני pLenti6/V5	Invitrogen	V496-10
מגיב Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
DMEM	סיגמא	D5546
PVDF המסנן (Rotilabo-Spritzenfilter)	רוט	P667.1
פוליאתילן גליקול	סיגמא	P2139
NaCl	מרק	1.06404.1000
פוספט של Dulbecco Buffered סאליne 1x (PBS)	Invitrogen	14190
hexadimethrine רומיד	סיגמא	10,768-9
Blasticidin	Invitrogen	R21001
קריסטל סגול	סיגמא	C3886
FACS צינורות	BD Biosciences
סטרפטומיצין פניצילין (עט-דלקת)	Invitrogen	15140130
L-גלוטמין 200 מ"מ	Invitrogen	25030024
עוברי בסרום שור (FBS)	Biochrom AG	S0115
חומצות אמינו לא חיוניות ממ (NEAA) 100x	Invitrogen	11140035
100 מ"מ פירובט נתרן MEM	Invitrogen	11360039
D-(+)-גלוקוז (45%)	סיגמא	G8769
Geneticin	Invitrogen	11811023
CaCl2	מרק	C5080
Hepes	סיגמא	H3375
טריפסין-EDTA (0.05%)	Invitrogen	25300054