פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

Summary

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של אותות אופטיים flavoproteins מהותי autofluorescence הדמיה אותות ריח עורר פעילויות המפה על פני השטח של הנורה חוש הריח אצל עכברים.

Abstract

במוח, גירויים חושיים מפעיל מופץ אוכלוסיות של נוירונים בין מודולים תפקודית אשר להשתתף קידוד של הגירוי. פונקציונלית טכניקות הדמיה אופטית הם יתרון לדמיין את הפעלת מודולים אלה בקורטקס הסנסורי עם רזולוציה מרחבית גבוהה. בהקשר זה, אותות אופטיים אנדוגני הנובעות המנגנונים המולקולריים הקשורים neuroenergetics הם מקורות חשובים של ניגוד להקליט מפות מרחבי של הגירוי החושי על פני שדות רחבים במוח מכרסמים.

כאן, אנו מציגים שתי טכניקות על בסיס השינויים של תכונות אופטיות אנדוגני של רקמת המוח במהלך ההפעלה. ראשית אותות אופטי פנימי (IOS) המיוצרים על ידי שינוי מקומי החזר אור אדום עקב: (i) קליטה על ידי שינויים ברמת החמצן בדם ואת נפח הדם (ii) פיזור פוטון. השימוש in vivo IOS להקליט מפות המרחבית החל באמצע 1980 של עם observatiעל מפות אופטי חביות זיף בחולדה ואת העמודות התמצאות החתול הראייה בקליפת ^1. IOS הדמיה של פני השטח של הנורה מכרסם העיקרי חוש הריח (OB) בתגובה odorants הודגם מאוחר יותר על ידי הקבוצה של לארי כץ ^2. הגישה השנייה מתבססת על אותות flavoprotein autofluorescence (FAS) בשל שינויים במצב חמזור אלה ביניים מטבולי המיטוכונדריה. ליתר דיוק, טכניקה מבוססת על הקרינה הירוק בשל מצב מחומצן של flavoproteins כאשר הרקמה הוא נרגש עם אור כחול. למרות אותות כאלה היו כנראה בין מולקולות ניאון המתועד הראשון לחקר פעילות המוח על ידי מחקרים חלוץ הסיכויים בריטון ועמיתיו ^3, זה לא היה עד לאחרונה כי הם שימשו במשך מיפוי של הפעלת המוח in vivo. FAS הדמיה יושמה הראשון בקליפת החושית במכרסמים בתגובה לגירוי hindpaw על ידי קבוצה של Katsuei Shibuki ^4.

מערכת ההרחה היא בעלת חשיבות מרכזית לקיומה של הרוב המכריע של המינים החיים משום שהיא מאפשרת איתור זיהוי יעיל של חומרים כימיים בסביבה (מזון טורפים). OB הוא ממסר הראשון של עיבוד מידע ההרחה במוח. הוא מקבל תחזיות מביא מן הנוירונים חושי הריח העיקרי לזהות מולקולות odorant נדיפים. כל נוירון חושי מבטא רק סוג אחד של קולטן odorant ונוירונים נושאת את אותו סוג של קולטן לשלוח תהליכים העצב שלהם מוגדרים היטב microregions אותו ~ 100μm ³ היוו של neuropil דיסקרטית, glomerulus חוש הריח (איור 1). בעשור האחרון, IOS הדמיה טיפחה את החיפושים התפקודי של OB ^{5, 6, 7,} אשר הפך לאחד המבנים חושית למד ביותר. מיפוי של פעילות OB עם FAS הדמיה לא שבוצעה עד כה.

הנה, Wדואר להראות צעדים רצופים של פרוטוקול יעיל עבור IOS ו FAS הדמיה למפות ריח עורר פעילות OB העכבר.

Protocol

1. הכנת בעלי חיים הדמיה (בהתאם להמלצות האירופי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, הוראה 86/609/EEC)

1. 6 עד 8 שבועות הישן C57BL6 עכברים זכרים מורדמים עם קוקטייל של קטמין (10mg/kg) ו xylazine (100mg/kg) מוזרק intraperitonealy. הניתוח מתחיל כאשר העכבר אינו מגיב hindpaw קמצוץ. במהלך הניסוי כולו החיה מושם על כרית חימום. טמפרטורת הגוף מנוטר באופן רציף ומתוחזק על 37 ° C. עומק ההרדמה נשמר לאורך כל הניתוח על ידי הפעלת הדמיה לבדוק את העדרו של איבר לסגת. הזרקה תת עורית של 20% קוקטייל ההרדמה הראשוני הוא מנוהל אחרת.
2. בעזרת קוצץ, להסיר את השיער מן הקרקפת. נקו את העור חשוף משיער שיורית באמצעות גזה סטרילית ספוגה מלוחים.
3. מקמו את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic. חוטם צריך להיות במישור זהה האחורי של הראש,על מנת להגדיר את פני השטח של הנורה חוש הריח כדי האופקי. מאובטח היטב את האוזן וברים האף על מנת למנוע תנועות במהלך ההדמיה.
4. החל משחה עיניים על העיניים של בעלי חיים כדי למנוע התייבשות וכאב.
5. לחטא את כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70 מעלות ובאזור הקרקפת עם מטאטא רצופים של בבטאדין.
6. כדי להסיר את העור המכסה את הגולגולת, להתחיל על ידי ביצוע חתך בעור במספריים בחלק האחורי של הראש בין האוזניים. ואז לחתוך לכיוון הבסיס של האוזן לכיוון anteroposterior לכיוון המצח לאורך העפעפיים של שני הצדדים. סיום להסיר את הקרקפת על ידי חיתוך העור על גבי חוטם קרוב לבר האף.
7. תחת תצפית המשקפת, השתמש במקלון צמר גפן ספוג מלוחים בעדינות כדי לנתק את periosteum על החלק העליון של הגולגולת. השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את הרקמות שנותרו לגרד את פני השטח של הגולגולת עם אזמל יש הכנה נקי.
8. OB הוא מבנה סימטרי מורכב משני hemibulbs אשר ממוקמים בין העפעפיים. הם מוגבלים מקורי ו לכיוון הזנב על ידי סינוס ורידי, ו מופרדים על ידי תפר sagittal. מניחים חתיכת ספוג הג'לטין נספגים ספוגה במים מזוקקים על העצם מעל OB. חשוב לשמור על לחות באזור העצם לאורך כל הניסוי.

2. הכנת חלון גולגולתי

1. הסר את ספוג הג'לטין ולהתחיל ידי מגרדים בעדינות את העצם עם להב n 10 ° אזמל. שמור על זווית קבועה של 45 מעלות בין להב לבין העצם, ולהעביר את הלהב מן העפעפיים לצד sagittal האזור הנורה. אין להפעיל לחץ אנכי על העצם או לשרוט את העצם מעל הסינוס ורידי.
2. במהלך תהליך דילול, להפסיק כל 5min והמקום ספוג הג'לטין hydrated על העצם להתקרר ההכנה. ספוגית את הגולגולת עם הספוג כדי להסיר אבק העצם.
3. שמור גורפתקירור לחילופין עד לדמיין את trabeculae, שכבת עצם ספוגית. Vasculature קנס של OB חייב להיות גלוי בשלב זה. עצור מגרד את העצם, ולהתחיל להשתמש בקצה של אזמל בניצב "למשוך" מלבן התוחם את OB. בשלב זה n ° 11 להב אזמל ניתן להשתמש. שמור את הניתוח בתוך גבולות של הסינוסים ורידי שאמור להיות בטוח לשבץ כל אזמל.
4. Dig בהדרגה התעלה מלבני נוצר באמצעות תנועות רצופות של אזמל. נגבו את קצה את האזמל מעת לעת לנקות אותו ולשמור אותו חדה. היה זהיר במיוחד של עומק קצה אל תיגע במשטח הדורה.
5. כדי לקבל תחושה של עובי של העצם הנותרים, לדחוף אותו בעדינות עם קצה של זוג מלקחיים. אם קפלי דש העצם תחת לחץ, לעבור לשלב הבא.
6. תחת טיפת מלח, השתמש קצה של אזמל אוריינטציה אופקית להרים את דש העצם. הסרת דש חייב להיעשות גarefully להימנע לקרוע את העצמות הנותרות.
7. לאחר פני השטח של OB חשוף, לבדוק בהעדר דימום או כלי דם השקה. פציעה של דורה או את פני השטח רקמות תפחית את הסיכוי לקבל אותות אופטיים. נגב את האזור עם ספוג טבול ג'לטין מלח כדי לשמור על לחות הנורה.
8. החל מלט שיניים polyacrylate להקים גם על העצם סביב החלון.
9. מניחים ירידה של נקודת התכה נמוכה agarose (1.2%) על הדורה, ולשים כוס כיסוי סטרילי בכל הממדים של החלון. במהלך הפגישה הדמיה, כמות קטנה של agarose ניתן להוסיף על מנת לפצות את התייבשות. Agarose תמנע OB לנוע עם הנשימה תספק משטח שטוח עבור הדמיה אופטית.

3. דימות אופטי ההתקנה למיפוי פעילות חוש הריח

1. גירוי חוש הריח יש להגדיר במדויק על ידי שימוש olfactometer זמן ועוצמת. אנו משתמשים בגרסה מותאמת אישית של מערכת multivial זלוף Valvebank 8II מ אוטומציה מדעיים הקשורים בסיסי מדחס אוויר (אוויר דחוס לנשימה יהיה מתאים גם כן). מערכת זו מאפשרת שליטה מדויקת ומהירה שסתום חיצוני. פתרונות של odorant טהור הם בדילול מלא שמן מינרלי בריכוז שנבחר. כדי להפעיל את אלדהידים OB הגבי כגון hexanal משמשים בדרך כלל. נפח המדויק של odorant מדולל (20 עד 50μl) נטען על נייר מסנן והושמו מאגר מזרק. באמצעות מערכת זלוף, לחץ אוויר מבוקר מועבר למערכת, על מנת להבטיח שיעור קבוע של אספקת אוויר השטף odorized לאף חיה במהלך פתיחת שסתום. Odorant מועבר באמצעות צינורות Tygon R-3603 שואב אבק (Saint-Gobain Corporation) נושאת האוויר בקצב הזרימה של ~ 1000ml/min. הימנע זיהום בין odorants וכמויות שיורית של odorant בצינור. אם זמין, שחזור של הגירוי odorant ניתן controlled באמצעות גלאי יינון להבה (microFID Photovac 2020).
2. התקנה אופטיות מופעלת. זה מורכב מקורר interlaced 12 ביטים מצלמת CCD (ORCA AG Hamamatsu) הקשורים stereomicroscope פלואורסצנטי (לייקה MZ16), olfactometer המחשב נשלט ומנורות עירור התייצב עם מסננים התערבות מתאימה bandpass. תכנית המתאר ההתקנה שלנו ניתנת באיור 2. עבור אותות אופטי פנימי דימות (IOSI), טונגסטן הלוגן 200W מנורה (אוריאל QTH) בשילוב עם אור טבעת סיבים (שוט) פקוק סביב המטרה מיקרוסקופ משמשים כדי לספק תאורה יציבה אפילו. עבור Flavoprotein autofluorescence איתותי דימות (FASI), מנורת מתכת 150W Halide (לייקה) עם מדריך הליבה 5mm אור נוזל לספק אפילו עירור מקומי של הקרינה דרך נמל עלית תאורה של stereomicroscope.

   רכישת תמונה וסינכרון חומרה ממומשות על ידי תוכנה מותאמת אישית. ים פתוחource תוכנה Micromanager יכול לשמש גם כדי לשלוט על הרכישה התקנה אופטיות.

4. הדמיה אופטית

1. מניחים את מסגרת stereotaxic תחת stereomicroscope, חלון גולגולתי מרוכז בתחום של תצוגה (ראה איור. 2A עבור סכמטית של ההתקנה אופטי).
2. כוון את המיקרוסקופ להתמקד הנימים. לפני ניסויים גירוי (ראו תיאור 5) תמונה של הנורה הוא נלקח תחת אור (ירוק) 560nm (טבעת סיבים) אשר מספק ניגודיות טובה עבור דימות כלי הדם. תמונה זו משמשת כפקד אנטומיים כדי לבדוק את מצב הכנת והוא רכש מספר פעמים במהלך הניסוי.
3. עבור IOS הדמיה, עוצמת האור משתקף שתועדו על ידי מצלמת CCD תחת 630 + / -10 ננומטר (אדום) תאורה. תמונות נרכשים על מסגרת מלאה (ללא binning) בשעה 5 פריימים לשניה אשר תואמות את זמן החשיפה של כ 150ms. כוח של מקור האור מותאם מחדש אח אפור רמות לפחות ~ 3000 על שטח OB, קרוב הרוויה של פיקסלים CCD בארות. פעולה זו מאפשרת לנצל את הדינמיקה 12bits של ה-CCD כדי ללכוד שינויים בעוצמת להתעלף במהלך ההפעלה. מקסימום IOS אמפליטודות להגיע ~ 1%.
4. עבור FAS דימות פלואורסצנטי נרכש תחת עירור של 480nm + /-20nm (כחול) אור epiflurorescence. סינון גבוהה לעבור על 515nm מוגדר ללכוד אור. תמונות נרכשות ב 5 פריימים לשניה עם binning של 4 על 4 על מנת למקסם את הרגישות. נורית ההפעלה עירור מותאם באופן דומה IOS עם רמות האפור של 3000 על שטח OB. מקסימום FAS אמפליטודות להגיע ~ 3%.

   במשך שתי שיטות הדמיה, עומק השדה במישור נושא זהה והיה נמדד 0.5 מ"מ עבור הגדלה של כ 4 פעמים.

5. אור יש לכבות בין ניסויים הדמיה כדי למנוע חימום photobleaching של התכשיר.

le "> 5. הניסויים הדמיה

1. תקן מושב הדמיה כלל הבסיס של 5 עד 10s שהאוויר רק מועבר, ואחריו גירוי הריח במשך 3 עד 10s תלוי ריכוז הריח הנבחר, 70 עד 82s נרשמות נוסף עם זרימת אוויר מתמדת התאוששות הבסיס (איור 2A). בסוף המשפט, אור כבוי אוויר טהור מועבר על משך הניסוי בין מרווח (1 עד 3 דקות) כדי לשטוף את מולקולות הריח שיורית ולהימנע הרגלה חושית. ניסויים ריח היו משולבים עם משפטים ריקים (אספקת אוויר).
2. ריח עורר אזורי הופעל הם דמיינו כאזורים כדורית בקירוב על המפות ועל מתאימות לגודל של glomeruli בודדים (80 עד 200μm בקוטר ^9). עיבוד תמונה הוא הסביר 2B איור. מפות חוש הריח מוצגים באיור 3. בניגוד לכל מערכת חושיות אחרות, יחס אות לרעש ב OB היה מספיק כדי לפתור ריח עורר תגובות בניסויים יחיד (איור. 3B עבור IOS ו איור. 3D עבור FAS).
3. עכברים מומתים מיד בתום הפגישה הדמיה בשיטות בהתאם להמלצות האירופי לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.

6. נציג תוצאות (ראה מפות הריח באיור 3):

איור 1 ארגון מבנית של הנורה הריח העיקרי מכרסמים. עצב סנסורי חוש הריח, תאים חושית העיקרי נמצא אפיתל ההרחה הראשי, לבטא את קולטן odorant אותו להתכנס על glomeruli באותו OB. Glomeruli חוש הריח, את עגולי neuropils (מעגלים מקווקווים), הממוקמים על פני השטח של OB. שים לב כי רשת כלי דם סמיך מאוד ומורכב נמצא ברמה גלומרולרי. קיצורים (למעלה / למטה): ONL: שכבת עצב ההרחה, GL: שכבת גלומרולרי, EPL: שכבה חיצונית plexiform; MCL:שכבת תאים צניפי; GCL: שכבת גרעין התא.

איור 2 ההחזרה אותות הקרינה ההקלטה in vivo. א רחב בתחום הדמיה אופטית ההתקנה. המוח של העכבר הרדים חשוף או אדום (IOS) או כחול (FAS) אור דרך טבעת או סיב טבעתי המצורפת העדשה אופטיקה או יציאת עלית תאורה של מיקרוסקופ. ריחות נטענים לתוך צלוחיות אטום odorized האוויר מועבר לאף חיה (אור ירוק: שסתום פתוח). ב הקלטת פרוטוקול ועיבוד נתונים. IOS ו FAS נרשמות סדרה של ניסויים בודדים (שנות ה -90 של משך הזמן). התרשים מראה את ציר הזמן של משפט אחד: הבסיס נע בין 5 ל 10s, גירוי בין 3 ל 10s, ולחזור בסיסית בין 70 ל 82s. עיבוד תמונה מחייב פיקסל אחר פיקסל חיסור של ערכים אינטנסיביות במהלך הבסיס לערכים בעוצמה בתקופות של גירוי (עבור FAS) or גירוי בתוספת לחזור בסיסית (עבור IOS). הפרש זה מחולק מכן על ידי ערכי הבסיס לקבל וריאציה% (ראה תמונות וכתוצאה מכך איור. 3).

איור 3 ריח עורר מפות הפעילות OB באמצעות IOS ו FAS הדמיה. א vasculature של OB הגב דמיינו תחת אור ירוק. לפני הספירה. IOS הדמיה (משפט בודד לעומת שלושה ניסויים בממוצע בהתאמה) עבור המצגת 10s של hexanal 20%. חיצים לבנים מצביעים על אזורים כדורי עניין זה מופעל על ידי ריח. מפות אלו הושגו באמצעות הפעלת המסגרות בממוצע במהלך בשנייה הראשונה לאחר סיום גירוי ריח (לכל היותר% וריאציה ההחזרה ב -0.63% ו -0.52 ב '). הערה אזורי השחור של ספיגת שם ההפעלה ריח התרחשה. תקליטור. FAS רכשה ברצף בעכבר זהה odorant זהה (משפט בודד לעומת שלושה ניסויים בממוצע בהתאמהly). מפות אלו הושגו באמצעות הפעלת המסגרות בממוצע במהלך בשנייה הראשונה לאחר תחילת גירוי ריח (מקסימום של 0.72% הקרינה וריאציה ב D ו 0.66% ב-E). שימו לב לבן של אזורי פליטת autofluorescence מסומנים על ידי חצים שחורים תואמים את אזורי שחור IOS. ההיבט מגורען לראות במפה FAS נובע 4 על ידי binning 4 נדרש לשיפור הרגישות. תמונות FAS לא תוקנו מ autofluorescence הלבנה. מידות בפועל של תמונות להיות: 0.7 רחב מ"מ x 1.2 מ"מ אורך.

Discussion

במאמר זה אנו מציגים IOS ו FAS שיטות הדמיה עבור vivo בהקלטות של ריח עורר פעילות OB העכבר. כדי להשיג מטרה זו פשוטה יחסית וזולה רחב בתחום ההתקנה הדמיה אופטית הכרחי. הרכישה של דימות נתונים דורש אימון כדי לבצע את הניתוחים בסדר להימנע מכל פגיעה הדורה או רקמת המוח. בפרט, דימום גדול יהיה לקלוט פוטונים הדמיה רשמה בסופו של דבר את הניסוי.

אחד היתרונות של IOS ו FAS ההדמיה, כדי למנוע את הזריקה של קליעים נותבים ניאון, אשר עלול לגרום לרעילות הסלולר או תופעות לוואי בלתי רצויה. הן מאפשרות להתמודד עם בעיות על מפות הריח ובכך קידוד המרחבי של גירויים חושיים. בניגוד הדמיה 2-DeoxyGlucose, הם מספקים אפשרות ריחות תמונה מספר חיה אחת. עם זאת, מאז חדירת הפוטון מוגבל בתוך הרקמה, IOS ו FAS מוגבלים החלק הגבי של OBולא ניתן להקליט מאזורים הגחון.

אות אנדוגני הדמיה אופטית מציעה רזולוציה מרחבית מצוינת בתחום ההדמיה vivo. שיפורים טכניים חישובים דאגה כמותית של מרכיבי הדם של החזר אותות ^8,9, כמו גם הדינמיקה של חמצון הדם ונפח במהלך הפעלת חושי ^10. הדמיה Multiwavelength גישות IOS הדמיה מפותחים כיום במעבדה שלנו באופן מלא לכמת ריכוז המוגלובין חמצון הכולל ב OB במהלך הפעלת החושים. אלה מדידות אופטיות ספקטרוסקופיות הוסיף FAS הדמיה ייתן את ההזדמנות כדי להשיב את היחסים פתורות בין הדינמיקה של כלי הדם ואת תאיים במהלך ההפעלה החושית ^11,12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם העוצר	חברה	מספר קטלוגי
Imalgene	Merial
Rompun	באייר
Agarose, סוג III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50
Hexanal 98%	אלדריץ'	115,606, 100 מ"ל