ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

Summary

רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAVs) וקטורים נעשים חשובים יותר ויותר עבור In vivo מחקרים בבעלי חיים. אנו מתארים כיצד rAAVs ניתן לייצר במעבדה וכיצד אלה יכולים להיות וקטורים titered לתת קריאה מדויקת של מספר חלקיקים זיהומיות מיוצר.

Abstract

בשנים האחרונות רקומביננטי adeno הקשורים וקטורים ויראליים (AAV) הפכו חשובים יותר ויותר עבור vivo במחקרים בבעלי חיים, והם גם כעת נבדק בניסויים קליניים בבני אדם. Wild-type AAV הוא חבר פתוגניים שאינם משפחת parvoviridae ו-לקוי מיסודו שכפול. הפרופיל התמרה רחבה, תגובה חיסונית נמוכה, כמו גם את הביטוי transgene חזקה מתמיד שהושגו עם וקטורים אלו הפכה אותם כלי פופולרי תכליתי עבור במבחנה משלוח גן vivo. rAAVs ניתן בקלות ובזול המיוצר במעבדה, המבוססת על פרופיל בטיחותי גבוה שלהם, מקבלים בדרך כלל סיווג בטיחות נמוכה. כאן, אנו מתארים שיטה לייצור ו titering של rAAVs כימרי המכיל את החלבונים capsid של שני AAV1 ו AAV2. השימוש של אלה הקרויים וקטורים chimeric משלבת את היתרונות של שני ההורים קפסיד כגון מניות titres גבוה (AAV1) וטיהורעל ידי כרומטוגרפיה זיקה (AAV2). אלה קפסיד AAV הם הטובים ביותר למד כל קפסיד AAV, ו בנפרד יש דפוס infectivity רחבה. וקטורים chimeric המתואר כאן צריך את המאפיינים זיהומיות של AAV1 ו AAV2 ולכן יכול להיות צפוי להדביק מגוון רחב של רקמות, כולל נוירונים, שריר שלד, לבלב, כליות ועוד. השיטה המתוארת כאן משתמש טיהור טור הפרין, שיטה האמין לתת titer ויראלי גבוה והכנת ויראלי נקי יותר שיטות טיהור אחרים, כגון צנטריפוגה דרך מפל צזיום כלוריד. בנוסף, אנו מתארים כיצד אלה וקטורים ניתן titered במהירות ובקלות לתת קריאה מדויקת של מספר חלקיקים זיהומיות מיוצר.

Protocol

ראה איור 1 להמחשה המסכם את הפרוטוקול הבא.

הערה בטיחות: כל החומר כי כבר במגע עם חלקיקים נגיפיים התאספו צריך לחטא עם פתרון Virkon או חומר חיטוי מתאים אחר.

1. הכנה של מניות ה-DNA פלסמיד (~ 2 ימים)

1. פלסמידים הבאים נדרשים ^1:
   • pRV1 - מכיל את הודעות AAV2 רצפים שווי
   • pH21 - מכיל את AAV1 הודעות רצפים שווי
   • pFdelta6 - adenovirus-helper פלסמיד
   • AAV פלסמיד המכיל את הקלטת ביטוי רקומביננטי מוקף AAV2 אותות אריזה (חוזר מסוף הפוכה, ITRS)
2. בעוד pFdelta6 צריך להיות מבוגר Stbl2 תאים המוסמכות כדי למנוע מחיקה חלקית, pRV1 ו pH21 ניתן לגדל תאים DH5alpha המוסמכות. פלסמידים AAV ניתן לגדל תאים Stbl2 אם מחיקות חלקיות להתרחש בתאים DH5alpha.
3. ה-DNA פלסמיד צריך להיות באיכות גבוהה ללא מזהמים RNA. פלסמידים יכול להיות מוקרן על שלמות באמצעות מעכל הבאים:
   • pRV1 - לעכל עם XbaI לתת להקות של 7.5 קילו ו 3.8 קילו
   • pH21 - לעכל עם EcoRI לתת להקות של 4.5 קילו, 2.8 קילו ו 0.2 קילו
   • pFdelta6 - לעכל עם HindIII לתת להקות של 5.5 קילו, 3 קילו, 3 קילו, 2.3 קילו ו 1.5 קילו

2. הכנת האדם תאים כליה 293 (Hek293) עובריים עבור transfection (2 - 3 ימים)

1. פלייט two 80% ומחוברות 150 ס"מ ² בקבוקי Hek293 תאים לחמש בקוטר 15 ס"מ רקמות מנות Nunc תרבות. תאים צריך להיות 70-80% ומחוברות לפני transfection (כ 48 שעות לאחר ציפוי). התרבות תאים שונה תקן Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) עם גלוקוז נמוכה המכיל 10% עוברית עגל בסרום 100 U / ml פניצילין / 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
2. 3 שעות לפני transfection DMEM להסיר ולהחליף Iscove"בינוני זה שונה של Dulbecco (IMDM) המכיל 5% עובר עגל בסרום.

3. Transfection של פלסמידים ויראלי (~ 1 שעה עבור transfection, 3 ימים של דגירה)

1. הכן הבאים על אצווה אחת (5 x 15 ס"מ רקמות צלחות התרבות) של הנגיף:
   • 62.5 מיקרוגרם פלסמיד AAV
   • 125 מיקרוגרם pFdelta6
   • 31.25 מיקרוגרם pRV1
   • 31.25 מיקרוגרם pH21
   • 1650 μl 2.5 M CaCl ₂
   • 12 מ"ל DH ₂ O
2. ב 2 הכיתה מסנן רקמה ברדס תרבות סטרילי transfection את התערובת לתוך שפופרת 50 מ"ל.
3. בעוד vortexing הפתרון, להוסיף במהירות של 13 מ"ל 2 HEPES x שנאגרו מלוחים (pH 7.05). החלפת מכסה של שפופרת 50 מ"ל ולהמשיך מערבולת למשך 15 שניות. השאר לעמוד למשך 1 דקה 45 שניות, משקע לבן עדין צריך טופס.
4. בעדינות להוסיף 5 מ"ל של הפתרון transfection לכל צלחת 15 ס"מ רקמה תרבות. צלחות מערבולת לערבב ולחזור חממה.
5. 16 שעות לאחר transfection להסיר בינוני IMDM ולהחליף DMEM.

4. Lysing של תאים קצירת rAAVs (2 שעות)

1. 72 שעות לאחר transfection, להסיר מדיה צלחות תרבית תאים וזורקים. כל פסולת יש להתייחס פתרון Virkon או חומר חיטוי מתאים אחר.
2. לשטוף בעדינות את התאים פוספט 1x חם שנאגרו מלוחים (PBS, pH 7.4).
3. הוסף 25 מ"ל PBS חם כל צלחת בעדינות להסיר תאים עם מגרד תא. איסוף להשעיה 50 צינורות מ"ל.
4. גלולה תאים XG ב 800 במשך 10 דקות.
5. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 150 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס pH 8.0, השתמש 10 מ"ל לכל צלחת בתרבית רקמה. פיצול לשתי צינורות 50 מ"ל.
6. הכן פתרון חדש של deoxycholate נתרן 10% DH ₂ O. הוסף 1.25 מ"ל של זה צינור עבור כל ריכוז סופי של 0.5%. הוסף benzonase nuclease לריכוז סופי של 50 יחידות לכל מיליליטר. מערבבים צינור ביסודיות.
7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
8. הסר פסולת הסלולר על ידי centrifuging XG ב 3000 במשך 15 דקות. העברה שפופרת 50 מ"ל טריים, להבטיח את כל פסולת התא הוסר על מנת למנוע חסימה של עמודות הפרין (ראה שלב 5). בשלב זה, הדגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C לפני שתמשיך. יש לנו לאחסן דגימות במשך מספר שבועות ב -20 ° C, ללא הפחתה של infectivity.

5. טור טיהור הפרין של rAAVs (2 - 3 שעות)

1. HiTrap ההתקנה הפרין עמודות באמצעות משאבה peristaltic כך פתרונות לזרום דרך העמודה ב 1 מ"ל לדקה עבור צעדים 5.2-5.4. חשוב לוודא שאין בועות אוויר מוכנסים בעמודה הפרין.
2. לאזן את הטור עם 10 מ"ל 150 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.0.
3. החלת 50 וירוס פתרון מ"ל לעמודה ולאפשר לזרום.
4. לשטוף טור עם 20 מ"ל 100 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.0.
5. באמצעות מזרק 5 מ"ל להמשיך לשטוף את w עמודהith 1 מ"ל 200 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.0, ואחריו 1 מ"ל 300 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.0. מחק את הזרימה דרך.
6. שימוש במזרקים 5 מ"ל ו elute לחץ עדין את הוירוס מן הטור על ידי יישום:
   • 1.5 מ"ל 400 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.0
   • 3.0 מ"ל 450 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.0
   • 1.5 מ"ל 500 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 8.0
   • איסוף אלה בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.

6. ריכוז סינון סטרילי של rAAVs (1 שעה)

1. תתרכז וקטור באמצעות Amicon אולטרה 4 יחידות מסנן צנטריפוגלי עם הפסקת 100,000 משקל מולקולרי. טען 4 מ"ל של eluate עמודה לתוך concentrator ו צנטריפוגות XG ב 2000 למשך 2 דקות (בטמפרטורת החדר). בטל flowthrough ו concentrator מחדש עם פתרון וירוס הנותרים צנטריפוגה לחזור. נפח מרוכז צריך להיות כ 250 μl. אם נפח מרוכזים באופן משמעותי יותר מזה, לא להשליך את זרימתדרך עינית ולהמשיך צנטריפוגות באחד השלבים דקה עד נפח כ 250 μl.
2. הוסף 250 μl של PBS לנגיף עבור נפח סופי של 500 μl ולהסיר concentrator.
3. וקטור סינון באמצעות מסנן 13 מ"מ קוטר 0.2 מיקרומטר מזרק. וקטור צריך להיות aliquoted ומאוחסנים ב -80 ° C עד הנדרשים.

7. Titering מניות ויראלי (3 ימים)

זה דורש היזם כי הוא פעיל Hek293 תאים נהיגה גן עיתונאי או מוצר לגילוי הגן immunocytochemically. כאשר ייצור וקטור כי אינו תואם Hek293 תאים שורות תאים אחרים או בתרביות תאים ראשונית ניתן להשתמש.

1. הכן 18 פולי-L-ליזין coverslips זכוכית מצופה או 18 בארות של שקופיות Nunc קאמרית על ידי זריעת Hek293 התאים, כך הם 40-50% ומחוברות. עבור טיטרציה של Cre תלויי rAAVs להשתמש Hek293 התאים ביציבות להביע Cre recombinase ^2.
2. להדביק כל טוב עם ד סדרתיilutions של וקטור AAV (איור 2A). השתמש 3 בארות לכל דילול. אנחנו באופן קבוע להוסיף וירוס ישירות היטב כל אחד.
3. לאחר 72 שעות לתקן Hek293 תאים ידי הוספת נפח שווה של paraformaldehyde 4% (PFA) עד בינוני (מתן ריכוז סופי של PFA 2%) למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.
4. לשטוף תא שלוש פעמים PBS, לשטוף ב DH ₂ O ו coverslip.
5. ספירת תאים transduced משלוש בארות, כי יש גורם לדילול הגבוה ביותר, אך עדיין מכילים תאים נגועים, למצוא את הממוצע של אלה להכפיל בפקטור את הדילול לתת את מספר יחידות זיהומיות לכל microliter (איור 2 ב).

8. תוצאות חזויות

Hek293 תאים transduced עם קידוד וירוס משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (eGFP) מוצגים בתרשים 2B. אנחנו בדרך כלל להשיג titers עקבית של כ 6 x 10 ⁶ חלקיקים זיהומיות לליטר מיקרו. אנו משתמשים באופן שגרתי אלה וקטורים עבור stereotaxic injection לתוך המוח מכרסם מבוגר. זה מספק שיטה רבת עוצמה לביטוי באזור ספציפי גן ^2. כדי לשלב ספציפי זה אזור עם הביטוי תא מסוג גנים סלקטיבית אנו מזריקים Cre recombinase תלויי rAAVs לאזורים היעד של העכברים הטרנסגניים ^Cre-2. איור 2C-E מציג דוגמאות של זריקות stereotaxic של Cre תלויי rAAVs קידוד eGFP לתוך אזורי מוח שונים של מבוגר parvalbumin-Cre העכברים הטרנסגניים ^3.

באיור 1. איור סכמטי של פרוטוקול לייצור rAAV. . 1) Hek293 תאים מצופה גדלה 70-80 מפגש%. 2.) פלסמידים AAV וגם עוזר מוכנים ו transfected Hek293 לתוך התאים. 3.) בינוני משתנה בחזרה DMEM 16 שעות לאחר transfection ו Hek293 התאים בתרבית למשך 56 שעות. 4.) Hek293 התאים נקצרים ו lysed. וקטורים rAAV מופרדים מן ההריסות התא על ידי גentrifugation. 5.) חלקיקים נגיפיים הם מטוהרים באמצעות עמודות הפרין לפני ריכוז עיקור. 6). Hek293 התאים גדלים על 24 צלחות טוב להדביק עם דילולים סדרתי של וקטור AAV כדי לקבוע את מספר יחידות זיהומיות.

באיור 2. Titering ו ביישום vivo של rAAV1 / 2. (א) ההתקנה של Hek293 תאים למדידת כייל הנגיף. Hek293 תאים transduced עם דילולים הסידורי של rAAVs. C, שליטה נגוע, N, 1 μl של המניה ויראלי חי. (ב) Hek293 תאים נגועים עם rAAVs להביע eGFP. (CE) ביטוי eGFP ויראלי מוגבל Cre-להביע עצב באזורים שונים של יעד parvalbumin-Cre העכברים הטרנסגניים לאחר ההזרקה stereotaxic של Cre המופעל rAAVs. תמונות דוגמאות להראות immunoreactivity GFP ב pallidus התלמוס רשתי וגלובוס (ג), (ד) gyrus משוננת ו (ה) באזור CA1 של ההיפוקמפוס. DG, דהntate gyrus, RT, רשתי thalamic גרעין, GP, pallidus גלובוס. סולם ברים: B, 500 מיקרומטר, C, 100 מיקרומטר; ד ', 100 מיקרומטר, E, 500 מיקרומטר.

Discussion

וקטורים rAAV הופכים חשובים יותר ויותר עבור vivo במחקרים בבעלי חיים. הנה, יש לנו תיאר פרוטוקול פשוט וזול עבור rAAVs ייצור, אשר עשוי להקל על היישום הנרחב של וקטור זה שימושי ידי הימנעות מיקור חוץ יקר של ייצור וירוס לחברות. פרוטוקול (מבוסס על התייחסות 1) מתאר את ייצור rAAV1 / 2 וקטורים chimeric המכילים חלבונים capsid משני קפסיד ההורים בבית יחס שווה ^4. טיהור של וקטורים rAAV באמצעות קשירה עמודות הפרין מסתמך על הביטוי של חלבונים AAV2 capsid, אבל יכול להיות משולב עם קפסיד אחר מאשר AAV1 שתוארו כאן. בנוסף, AAV6 דווחה להיקשר הפרין, למרות עם זיקה מופחתת, שעלולים להיות מטוהרים עם עמודות הפרין באמצעות הליך זה ^5,6. יצוין, עם זאת, כי קפסיד אחרים ידרוש ריכוזים שונים של NaCl עבור elution טור הפרין ^5,7.

אריזות הגנום rAAV הוצגה להיות אופטימלי בין 4.1 ו 4.9 kb עם ירידה חדה של יעילות האריזה עד 5.2 קילו ^8. הגבלה זו אריזה יכול להיחשב החיסרון הגדול של המערכת rAAV, שכן סוג ספציפי תא תקנה הביטוי transgene מושגת בדרך כלל על ידי cis משחק גדול אלמנטים אשר לא ניתן לאכלס בתוך חלקיקי AAV קטן. כדי להתגבר על קבוצות כייל נמוך, כגון אלה הנובעים מנסה גנים החבילה שהם קרוב לגבול אריזה AAV אנחנו שילוב קבוצות ויראלי נפרד מרוכז כדי μl 250 לתוך אצווה 500 one μl, במקום להוסיף PBS כפי שמתואר בשלב 6.3. התמרה אמין תא מסוג מסוים יכולה להיות מושגת על ידי Cre נהג עכברים שילוב וקלטות rAAV מותנה (ראה להלן), כדי למנוע מתיחת גבול האריזה.

יש לציין, בעוד פרוטוקול זה מנסה לספק קל לעקוב אחר ההוראות המופיעות על ייצור לא גבוההiter rAAV, זה דורש נוכחות של חלבון AAV2 moieties capsid לטיהור על ידי כרומטוגרפיה זיקה הפרין. קפסיד אחר מאשר AAV2 חייבים להיות מטוהרים באמצעות נהלים חלופיים ^9. אחד היתרונות של טיהור טור הפרין הוא הוא האמין לייצר וקטורים AAV כי יש שיעור infectivity גדולים יותר מאלה המיוצרים באמצעות שיפוע צזיום כלוריד ^10. עם זאת, ישנם גם מספר חסרונות לשיטה זו. לדוגמה, חלבונים אחרים הנקשרים הפרין עשוי גם להיות נוכח המניה ויראלי מטוהרים. בעוד של-כמיהות הפרין מטוהרים וקטורים יכול להיות מושפע titer וקטור ^10, הגישה שלנו ממוקדת או ²⁰ מעוררים או מעכבים נוירונים (איור 2) מעסיקה Cre-Induced ההפעלה הביטוי AAV בתיווך transgene והוא titre עצמאית. חלופה טיהור טור הפרין הוא השימוש שיפוע צפיפות iodixanol, אשר מייצרת titer ויראלי גבוה והכנת טהור יותר לשימוששיפוע צזיום כלוריד ^10. שיטה זו יכולה גם להיות משולב עם טיהור טור הפרין לייצר וקטור גדול מ 99% טהור ^11. לכן, שיקול דעת צריך לקחת על ידי קבוצות כמו אל הפרט באיזו שיטה לטיהור ויראלי הוא הטוב ביותר עבור יישום מסוים במורד הזרם שלהם.

הבעיה הנפוצה ביותר הקשורים בפרוטוקול זה כייל הנגיף נמוכה. מניסיוננו זה בדרך כלל ניתן לייחס transfection יעילות נמוכה, או elution של הנגיף מן העמודות הפרין. כל החומרים transfection צריך להיות בטמפרטורת החדר לפני transfection ו transfections הבדיקה יש לבצע כדי למצוא את התנאים האופטימליים במעבדה כל אחד. שיטות אחרות של transfection, כגון lipofectamine, הם יעילים מאוד, אבל יכול להיות יקר. בנוסף, ריכוז ה-pH של פתרונות elution הפרין עמודה היא קריטית עבור elution מלאה של virions מ witho עמודות הפריןut נזק. נקודה חשובה נוספת היא כי התאים האריזה חייבת לדבוק גם אל פני השטח של הכלים בתרבית רקמה. אם התאים לנתק בשלב מסוים במהלך ההליך מומלץ להפסיק את הניסוי להפשיר בקבוקון חדש של תאים.

במרחב ובזמן בקרת ביטוי transgene במכרסמים מושגת בקלות על ידי מיקוד אנטומי מדויק השלב ההתפתחותי של החיה. העברה יעילה AAV בתיווך גן הוכח ברחם ^12,13. במוח הבוגר, באזור נגוע חלקיקים rAAV לאחר ההזרקה stereotaxic יכול להיות מותאם מאזורים ממוקדים קטנים מאוד, לאזורים הרבה יותר גדול לא רק על ידי שינויים כייל הנגיף אלא גם על ידי שינוי הפרמטרים של ההזרקה. אלה כוללים את נפח ומהירות זריקות הכללת mannitol polyol עם ההשעיה וירוס ^14. Mannitol יכול לשמש גם כדי לשפר את זיהום של מגוון רחב של רקמות לאחר ההזרקה rAAV מערכתית ^{15 <}/ Sup>.

כושר האריזה של rAAV (כ 4.7 קילו) הוא כנראה הגורם המגביל ביותר במונחים של גנים יכול לבוא לידי ביטוי מתוך אלה וקטורים ויראליים. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ניתן להתגבר חלקית לתוך נפרד וקטורים rAAV ידי הגנים פיצול גדול או קלטות הביטוי מציגה רצף גישור, ייזום ביטוי גנים כאשר virions ידביק את התא אותו ^16. רמות הביטוי של הגנים הנישאים על ידי וקטורים rAAV יכול להיות גם משפר באמצעות עצמית חינם וקטורים rAAV ^17. הזרקת Stereotaxic של וקטורים rAAV מספק שיטה מהירה, זולה עוצמה גרימת ביטוי גנים באופן אזורים ספציפיים. בשילוב עם דור 2 ^nd אסטרטגיות התערבות RNA ¹⁸ rAAVs יכול לשמש גם עבור אזורים ספציפיים גנים להפיל. rAAVs יכול להיות משולב עם Cre-העכברים הטרנסגניים או תאים מסוג מסוים היזמים להשיג במעגל של התא מסוגספציפית ביטוי גנים, המתיר מניפולציות גנטיות עם רזולוציה מרחבית גבוהה ^2,19-21, בעוד rAAVs הולם במערכת למשל ט 'מוסיפה לשלוט הזמני על הביטוי וירוס בתיווך גן ^22,23. דוגמאות אלה ממחישות את הפוטנציאל העצום קומבינטורית של וקטורים אלו צופים גידול מהיר rAAV מבוססי מחקרים בשנים הבאות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Amicon מסננים צנטריפוגלי Ultra	Millipore	UFC810024	100,000 MWCO
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco של הנשר שונה בינוני (DMEM)	Invitrogen	10567014	מוסף עם FCS 10% ו 10 יחידות / מ"ל ​​penicillin/100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין
Hek293 תאים	התרבות האמריקאית סוג אוסף	CRL-1573	השתמש במעבר פחות מ 30
HEPES שנאגרו מלוחים	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap הפרין מחסנית	סיגמאאולדריץ	54836
שונה Iscove של Dulbecco של המדיום	Invitrogen	12440-053	מוסף עם FCS 5%
נתרן deoxycholate	Sigma-Aldrich	D5670	הפוך את פתרון חדש עבור כל אצווה
15 ס"מ רקמות תרבות מנות	פישר סיינטיפיק	157150
Stbl2 תאים המוסמכת	Invitrogen	10268-019
Virkon פתרון	פישר סיינטיפיק	NC9821357	השאירו לחטא לילה לפני השלכת לניקוז