פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

Summary

שיטה לייצר פרוסות organotypic מן המוח התיכון E12.5 העוברי Murine מתואר. תרבויות פרוסה organotypic ניתן להשתמש כדי לבחון את התנהגות של נוירונים דופאמינרגיים או נוירונים המוח התיכון הגחון.

Abstract

העכבר הוא אורגניזם מודל מצוין ללמוד התפתחות המוח יונקים בשל שפע של נתונים מולקולריים וגנטיים. עם זאת, המוח המתפתח העכבר אינו מתאים מניפולציה הדמיה קל in vivo מאז העובר העכבר אינו נגיש ואטומים. תרבויות פרוסה Organotypic של המוח העוברי ולכן הם בשימוש נרחב ללמוד התפתחות המוח Murine במבחנה. Ex-vivo מניפולציה או שימוש העכברים הטרנסגניים מאפשר שינוי של ביטוי גנים, כך subpopulations של תאים עצביים או גליה יכול להיות מתויג עם חלבוני ניאון. התנהגותם של תאים שכותרתו לאחר מכן ניתן לצפות באמצעות זמן לשגות הדמיה. זמן לשגות הדמיה הצליחה במיוחד עבור הלומדים התנהגויות תא העומדים בבסיס התפתחות קליפת המוח בשלבים עובריים בסוף ^1-2. עובריים organotypic תרבות פרוסה מערכות באזורי מוח מחוץ forebrain הם establis גם פחותהד. לכן, שפע של זמן לשגות נתונים הדמיה המתאר נדידת תאים עצביים מוגבל forebrain ^3,4. זה עדיין לא ידוע, אם גילה את העקרונות למוח הגב להחזיק נכון עבור אזורים במוח הגחון. במוח הגחון, הנוירונים מאורגנים בקבוצות ולא שכבות עצביות ולעתים קרובות הם צריכים לעבור מסלולי הנדידה מסובך להגיע עמדתו הסופית שלהם. המוח התיכון הגחון הוא לא רק מערכת מודל טוב להתפתחות המוח הגחון, אך מכיל גם באוכלוסיות עצביות כגון נוירונים דופאמינרגיים הרלוונטיים בתהליכי מחלה. בעוד לתפקד ניוון של נוירונים דופאמינרגיים נחקר בפירוט רב המבוגר והמוח המזדקן, מעט מאוד ידוע על התנהגותם של הנוירונים האלה במהלך הבידול שלהם שלב ההגירה ^5. אנו מתארים כאן דור של תרבויות פרוסה מיום עובריים (E) 12.5 המוח התיכון עכבר הגחון. אלה פולחן פרוסהures מתאימים פוטנציאלי לניטור דופאמין פיתוח הנוירון על פני כמה ימים במבחנה. אנו מדגישים את השלבים הקריטיים ביצירת פרוסות המוח על אלה בשלבים המוקדמים של ההתפתחות העוברית ולדון את התנאים ההכרחיים לשמירה על התפתחות תקינה של נוירונים דופאמינרגיים במבחנה. כמו כן, אנו מציגים תוצאות של ניסויים זמן לשגות הדמיה. בניסויים אלו, מבשרי המוח התיכון הגחון (כולל מבשרי דופאמין) וצאצאיהם תויגו באופן פסיפס באמצעות Cre / loxP ועין מתנהלת מערכת מיפוי מבוסס גורל ^6.

Protocol

חלקים של פרוטוקול זה שונה מן Daza et al. 2007 ^7.

1. ההכנות

1. ניתן להכין יום אחד מראש
   1. הכן 1X קרבס חיץ (1.5 ליטר): 126 mM NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 1.2 מ"מ לאא ₂ PO _4: H ₂ O, 1.2 mM MgCl _2, 2.5 מ"מ CaCl _2, גלוקוז 11 מ"מ, 25 מ"מ NaHCO _3, כדי להתאים את ה-pH 7.4. סנן לעקר (0.22 נקבוביות בגודל מיקרומטר) ולאחסן ב 4 ° C.
   2. הכן את המדיום תרבות (20 מ"ל): 5 HBSS מ"ל, 9 מ"ל גלוקוז DMEM גבוהה, 850 μL של גלוקוז 30%, 5 מ"ל סוס בסרום (25%). הוספת 200 Penicllin 100x סטרפטומיצין μL /. חנות ב 4 ° C.
2. הכן לפני תחילת לנתיחה
   1. הכינו 100 מ"ל של 4% ההיתוך agarose נמוכה (LMP agarose) ב 1X קרבס חיץ: הפתרון במיקרוגל עד agarose הוא נמס לגמרי, ואז המקום agarose בתוך אמבטיה C ° 45 מים.
   2. מלאו את הרטטעב מגש עם חיץ קר כקרח חיץ קרבס 1X ולהתחיל את אלמנט קירור (לשמור על 4 ° C). תקן סכין גילוח במנשא להב הגדרת אזור vibratome עם מכחול אזמל, דק כף מחוררת מיני להרים את הפרוסות. הכינו צלחות פטרי סטרילי (35 x 10 מ"מ) עם חיץ קרבס 1x לאיסוף פרוסות. שמור על הקרח.
   3. הגדרת את אזור סטרילי דיסקציה עם צלחות פטרי (100 x 15 מ"מ) לנתיחה יותר ויותר כלים סטריליים פטרי (35 x 10 מ"מ) להטבעת, מספריים קטנים, שני מלקחיים קנס (דומון 5), כף מחוררת מיני, כוס פסטר אש פיפטה מלוטש עם סיבוב סגור טיפ 1 ו L של המאגר קרבס 1X על הקרח. תמחקי את כל הכלים דיסקציה עם אתנול 70%.
   4. הוסף בינוני תרבות הבארות של צלחת חצי באר (1.5 mL / טוב) ולמקם אותו בתוך 37 ° C חממה.
   5. הכינו צלחת שישה היטב עם 1.5 mL / סטרילי גם 1X קרבס חיץ 15 μL Penicilin / סטרפטומיצין (100x) / כן. בתנאים סטריליים, מקום Milתרבות licell Cell מכניס לתוך בארות. מניחים את צלחת שישה היטב ליד vibratome כך את פרוסות המוח ניתן להעביר על גבי הקרומים לסנן מיד לאחר חתך.

2. Dissection והטבעה של המוח העוברי

1. הרדימי עכבר נשים בהריון באמצעות isoflurane ולהקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם (עוברים צריכה להיות בשלב E12.5). לנתח את הרחם של העכבר על ידי משיכת את הרחם עם מלקחיים. שימוש במלקחיים אחרות להפריד את mesometrium מן הרחם. מניחים את הרחם במאגר קר כקרח קרבס 1X. השתמש מלקחיים בסדר להפריד את קיר שרירי הרחם, הקרום של רייכרט ואת הקרביים שק החלמון מן העובר. הסר את העוברים מן הרחם. מניחים את העוברים גזור לתוך צלחת פטרי סטרילי נפרד עם 1X קרבס חיץ.
2. מנתחים את המוח תחת stereomicroscope. כדי לנתח את המוח, תחילה חותכים את הראש של העובר. תקן ראשעל ידי פירסינג מלקחיים בסדר דרך הראש (בגובה העיניים). השתמש עוד זוג מלקחיים בזהירות כדי להסיר את העור ואת הגולגולת. השתמש מלקחיים בזהירות להרים את המוח החוצה ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי סטרילית עם 1X קרבס חיץ. חשוב מאוד כי שלמות של המוח כולו נשמר במהלך לנתיחה, שכן נזקים לרקמת המוח תיצור בעיות (כגון רקמות רטוש) במהלך חתך על vibratome.
3. לשטוף את מוחם פעם נקודת התכה נמוכה של 4% (LMP) agarose. שבץ מוח 2-3 בכל פעם טרי 4% LMP agarose. מניחים את הכלים הטבעה על הקרח כמו גם ככל האפשר. השתמש פיפטה פסטר עם קצה אש מלוטש עגול להרים את המוח עד התחתון של agarose הוא הקרושה. המוח צריך להסתפק במצב שטוח אופקי בתחתית לחסום את agarose.
4. לאחר agarose יש הקרושה מלא (לאחר כ -3 דקות), חתוך את agarose המקיפים את המוח ואת הדבק לחסום agarose לבמה הדגימהשל vibratome. כאשר אבני הדבקה, לוודא כי הצד הגחוני של המוח במקביל הפלטפורמה, מכיוון שכל יש לחתוך במטוס סעיף אופקי.

3. Vibratome חתך

1. השתמש סכין גילוח עבור חתך. כדי לקבל פרוסות שלמות חשוב מאוד לשמור על הטמפרטורה 4 מעלות צלזיוס במהלך חתך.
2. סעיף 300 מיקרומטר פרוסות אופקי עבה בתדר של 50 הרץ, משרעת להב של 1.1 מ"מ ו למהירות של 25 מ"מ / sec.
3. השתמש במכחול עדין לדחוף את הפרוסה כף מחוררת מיני לאסוף את פרוסות המוח ולהעביר אותם לתוך צלחת עם חיץ סטרילי קר כקרח קרבס 1X. בחר את הפרוסה המכיל רקמות המוח התיכון הגחון (ראה איור 1). במוח E12.5 עכבר יש רק אחת 300 מיקרומטר פרוסה אופקי המכיל רקמות המוח התיכון הגחון כולל נוירונים דופאמין.

4. פורסים תרבות

צעדים 4.2-4.5 צריך להתבצע בתנאים סטריליים.

1. מעבירים את פרוסות המוח על תרבות להכניס Millicell קרום התא צלחת שישה היטב עם 1x קרבס חיץ (ראה נקודה 1.2.5). כדי להעביר את הפרוסה להשתמש כף מחוררת מיני (כלים המדע פיין) ו במכחול דק. עד 3 פרוסות ניתן להציב על קרום אחד.
2. מעבירים את הפרוסה עם קרום לצלחת שישה היטב עם המדיום תרבות (ראה נקודה 1.2.5). החלק העליון של קרום לא צריך להיות מכוסה על ידי המדיום. פרוסת המוח מקבל בינוני מלמטה אוויר מלמעלה.
3. מניחים את צלחת שישה היטב חממה עם 5% CO ₂ ב 37 ° C. חשוב מאוד כי את הפרוסות מונחות בחממה תוך 2 שעות לאחר השלב הראשוני של הניתוח. זמן הכנה ממושך יותר יכול לגרום הישרדות עניים הפרוסות.
4. פרוסות יכול להישמר במבחנה עד 3 ימים. שינוי של 50% בינוני התרבות ביום 2 ^nd.

s = "jove_title"> 5. זמן לשגות הדמיה

1. בואו הפרוסות להתאושש בחממה במשך 4-5 שעות לפני תחילת זמן לשגות הדמיה.
2. עבור הדמיה זמן לשגות, לשמור על פרוסות על להכניס את הקרום והעברת להכניס לתוך צלחת-μ Ibidi 35 מ"מ (החלק התחתון של המנה מורכבת של חומר עם איכות אופטית גבוהה).
3. הוסף 1 מ"ל של מדיום פלוס תרבות 1.5 חומצה אסקורבית μL (200 mM) על המנה. חומצה אסקורבית מגן על פרוסות נגד phototoxicity.
4. דגירה פרוסות בתא סביבתי על 37 מעלות צלזיוס עם CO2 5% במהלך הדמיה זמן לשגות.

6. נציג תוצאות

איור 1 מדגים את הכנת תרבויות פרוסה organotypic מהמוח E12.5 העכבר. איור 2 מראה פרוסות organotypic האופקי (חריפה לאחר מספר ימים בתרבית) השיג E12.5 טופס במוח העכבר. שכן, השוואה חלקים במוח קפוא על שלבי ההתפתחות המקבילהמוצגים. הנוירונים במוח התיכון דופאמין הם דמיינו עם אימונוהיסטוכימיה עבור hydroxylase טירוזין (TH). דופאמין במוח התיכון נוירונים הפרויקט מטרות forebrain. תחזיות אלו מתחילים הטופס E12.5 ולהרחיב לקראת forebrain בימים שלאחר מכן. אנו רואים את התפתחות תחזיות forebrain אינדיקציה טובה להתפתחות נורמלית של נוירונים דופאמינרגיים בתרבות. בתוך המוח התיכון פרוסות אופקיות נוירונים דופאמינרגיים להאריך התחזיות שלהם לכיוון הנכון אזור היעד forebrain. לאחר DIV 3 (ימים במבחנה) או כאשר אזורי מטרה forebrain פגומים, תחזיות סוטה להאריך כלפי המוח התיכון הגבי. דוגמאות של פרוסות העטרה של המוח התיכון E12.5 מוצגים באיור 3. נוירונים דופאמינרגיים דמיינו עם immunostaining עבור TH להאריך את תחזיות סוטה אל המוח התיכון, הגב. איור 4 מראה ניתוח מתרבים, תאים אפופטוטיים נמקי ו בתרבויות פרוסה organotypic. BrdU immunostaining לדמיין תאים מתרבים מראה כי התאים להתרבות בתנאים תרבות לאחר DIV 1. הפצת מופחת לאחר DIV 4. לאחר DIV 3, תאים רבים במוח התיכון הגחון לעבור נמק (מכתים propidium יודיד) ו apotosis (immunostaining עבור caspase-3 ביקע). איור 5 מראה נתיבי הנדידה של YFP שכותרתו נוירונים פיקוח בניסוי זמן לשגות הדמיה פרוסה חריף .

באיור 1. סכמטי המדגים את הכנת תרבויות פרוסה organotypic. פרוסות 300 מיקרומטר המוח אופקי מוכנים על ידי חתך מוח E12.5 באמצעות vibratome. (א) Schematic להציג sagittal של המוח E12.5 העכבר. רמות סעיפים מצוינים. שטח שבו נמצאים נוירונים דופאמינרגיים מתואר ורוד, תחזיות מסומנים בכחול. (ב) שרטוטים של שלוש פרוסות כי ניתן להשיג את הגב אל הגחון ועל thaלא להכיל forebrain (FB) ואת המוח התיכון (MB). שים לב, רק פרוסה אחת מכילה נוירונים דופאמינרגיים (ב פרוסה). פרוסה המתאים ניתן לזהות המבוססת על המיקום של החדרים ואת ההמשכיות של רקמת המוח התיכון ואת המוח הקדמי (חיצים, להשוות ב סעיף סעיף ג). שטח שבו נמצאים נוירונים דופאמינרגיים מסומן בוורוד, אזור המכיל מבשרי דופאמין מתואר, חיצים ירוק כחול עולה תחזיות מתפתחות. (ג) נתח המכיל נוירונים בתרבית על דופאמין הוא מוסיף הממברנה. קיצורים: המוח התיכון vMb, הגחון, DMB, המוח התיכון הגב; Hyp, ההיפותלמוס, המוגלובין, למוח האחורי.

באיור 2. תחזיות של נוירונים המוח התיכון דופאמין בתרבויות פרוסה organotypic תלויים היושרה של המוח הקדמי. אימונוהיסטוכימיה עבור hydroxylase טירוזין (TH) לתייג נוירונים דופאמין. (א) פרוסה חריפה (0 DIV)מראה את מיקום תקין של נוירונים דופאמין במוח התיכון הגחון. החץ הלבן מצביע על האזור מוצג בהגדלה גבוהה יותר הבלעה. תחזיות ל forebrain לא פיתחו עדיין. לאחר DIV 1, התחזיות ל forebrain מתחילים הטופס. תחזיות להאריך לתוך forebrain ב DIV 2-3. ראשי חץ לבן מציינים את מיקומם של גופי התא שמוצג בהגדלה גבוהה ריבועי (מסגרת לבנה). חיצים צהובים מדגישים את תחזיות נורמלי פרוסות שלמות שמוצג בהגדלה גבוהה ריבועי (מסגרת צהובה). תחזיות חריגה להתפתח פרוסות עם forebrain פגום. החיצים האדומים מציינים את תחזיות סוטה אל המוח התיכון, הגב שמוצג בהגדלה גבוהה ריבועי (מסגרת אדומה). נזק מסומן בכוכבית אדומה. לאחר DIV 3, רוב פרוסות (n = 5 / 7) היו תחזיות סוטה לכיוון המוח התיכון הגבי. (ב) immunostaining TH על אופקי חלקים במוח קפוא בשלבים התפתחותיים שונים כדי להראות את ההתפתחותהתחזיות דופאמין in vivo. ראשי חץ לבן מציינים את מיקומם של גופי התא שמוצג בהגדלה גבוהה ריבועי (מסגרת לבנה). החצים צהוב לסמן את המיקום של תחזיות שמוצג בהגדלה גבוהה את ריבועי (מסגרת צהובה). הרמה של בסעיפים קפוא נבחר בקפידה להתאים את רמת התרבויות פרוסה organotypic. שים לב כי חלקים קפואים יחיד (12 מיקרומטר) אינו מייצג את הפרוסה organotypic כולו (300 מיקרומטר). לכן, התחזיות הראו על E13.5 ו E14.5 נצפו על סעיפים 120 מיקרומטר הגחון יותר בקטע המכיל את גופי התא (כוכביות צהוב).

באיור 3. העטרה המוח התיכון פרוסה תרבויות מוכתם עבור hydroxylase טירוזין (TH) כסמן נוירונים דופאמין. (AC) Slices לאחר DIV 1, 2 או 3. נוירונים דופאמינרגיים לפתח תחזיות סוטה לכיוון המוח התיכון הגבי (rהחצים ed). ראשי חץ להראות את המיקום של גופי התא דופאמין.

איור 4. שגשוג תאים כדאיות התא בתרבויות המוח התיכון organotypic פרוסה. (א) תאים מתרבים תויגו על ידי תוספת של BrdU (50 ng / mL, Sigma) עד בינוני התרבות במשך 18 ח פרוסות היו immunostained לאחר מכן עבור BrdU. לאחר DIV 1, תאים BrdU שכותרתו ממוקמים באזורי חדרית (חיצים אדומים). לאחר DIV 4, תאים מתרבים מפוזרים יותר אזור חדרית ברורים נשמר עוד. (ב) תאים נקרוטי תויגו על ידי תוספת של יודיד propidium (1μg/μL, Sigma) למדיום תרבות 2 שעות ו - דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר DIV 1, המוח התיכון הגחון (vMb) אינו נמקי, אך רבים יודיד propidium תאים שכותרתו ניתן לראות המוח התיכון forebrain הגבי ו. אחרי 3 DIV את הכדאיות התא ירידה midbra הגחוןלהיכנס לבר סולם: 500 מיקרומטר (C) Immunostaing עבור caspase-3 ביקע לדמיין תאים אפופטוטיים. בשלב DIV 1 או 2, נוירונים דופאמינרגיים רק מעטים (TH) הם אפופטוטיים. לאחר DIV 3, נוירונים דופאמינרגיים להתחיל לעבור אפופטוזיס. לוחות באמצע בצד ימין הן בהגדלה גבוהה יותר של האזור ארוזות לוחות שמאל. התמונות בהגדלה גבוהה הן תחזיות בעוצמה מקסימלית של Z-ערימות של 14-16 מסגרות. תמונות נלקחו כל 0.5 מיקרומטר עם Apotome Zeiss הגדרת.

איור 5. מסלול הנדידה של YFP שכותרתו נוירונים פרוסה חריפה. (א) פרוסה אופקי המשמש הדמיה זמן פקיעה של YFP שכותרתו נוירונים. פרוסה הודגר במשך 5 שעות לפני הדמיה. תאים תויגו באמצעות ועין מתנהלת Cre / loxP מערכת ^6. ששש עכברים ^{קואל 8} ורוזה ^{loxP-STOP-loxP-EYFP} עכברים כתב ⁹ אנחנושימוש מחדש. רקומבינציה של האלל הכתב רוזה (וביטוי EYFP) מושרה בתאים המבטאים קואל (ששש, להביע תאים), אבל רק על הניהול של טמוקסיפן (Sigma). בדוגמה זו, טמוקסיפן (3 mg/40 גרם משקל גוף) היה מנוהל על עכברים בהריון E8.5. זה ניסיוני הגדרת התוצאות בעיקר תיוג של מבשרי נוירונים דופאמינרגיים וצאצאיהם בתוך המוח התיכון הגחון ^10,11. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (ב) האיתור תוואי הנדידה של YFP שכותרתו נוירונים פרוסה חריפה. זמן לשגות תמונות של YFP שכותרתו נוירונים גורל ממופה נרכשו כל 30 דקות במשך זמן כולל של 5 שעות 30 דקות על מיקרוסקופ Zeiss Axio-Observer (אובייקטיבי EC PlnN 10x / 0.3). פרוסות הודגרו בתא סביבתי (חממה XLS1 Pecon) בשעה 37 ° C ו מסופק עם ₂ CO 5% במהלך ההדמיה. העמדה הראשונית של התאים מסומן עם חצים אדומים; עמדות הגירה מסומנים בכוכבית אדומה.

Discussion

פרוסה organotypic תרבות השיטה המוצגת כאן מספקת מערכת לטווח הקצר בניתוח חוץ גופית לפתח נוירונים דופאמינרגיים ומסלולי הנדידה והשלכה שלהם המוח התיכון הגחון עובריים. מצאנו כי ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול כי יש בהשתתפות בקפידה על מנת לקבל פרוסות המאפשרים התפתחות ת?...

Materials

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
גלוקוז 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
סוס סרום	Invitrogen	26050-088
DMEM (ז 4,5 / L Glc., עם L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)	Sigma-Aldrich	D6429-500
פניצילין / סטרפטומיצין 100x	Sigma-Aldrich	P4333-20
L-חומצה אסקורבית	Sigma-Aldrich	A4403	להכין מלאי החנות 200mm ו - ב -20 ° C
Ultrapure LMP agarose	Invitrogen	15517-022
Millicel מוסיף	Millipore	PICMORG50
μ-צלחת 35 מ"מ, נמוך	Ibidi	80136
Vibratome	Microm	HM 650V
Razor Blade	Plano GmbH	121-6
Histoacryl דבק	BRAU9381104	בראון Aesculap
כף מחורר Dia קוטר 15 מ"מ	המדע כלים פיין	10370 -18
מלקחיים 5 Dumoxel	המדע כלים פיין	11252-30

חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
Hydroxylase הארנב נגד טירוזין	Millipore	AB152	דילול 1:500
עכבר אנטי-tyrosine hydroxylase	Millipore	MAB318	דילול 1:500
עכבר אנטי BrdU	BD Pharmingen	555627	דילול 1:200
הארנב נגד ביקע caspase 3	תא האיתות טכנולוגיה	9661	דילול 1:200
חמור נגד ארנב IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	דילול 1:500
חמור נגד עכבר IgG-Cy3	ג'קסון ImmunoResearch	715-165-150	דילול 1:200