הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

Summary

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.

Abstract

מינים החמצן מגיב לכלול מספר מולקולות DNA ו-RNA נזק ו לחמצן חלבונים ושומנים (peroxydation שומנים בדם). אלה מכילים מולקולות חמצן כוללים H ₂ O ₂ (מי חמצן), NO (תחמוצת החנקן), O ₂ ^- (אניון תחמוצת), peroxynitrite (ONOO ^-), חומצה hydrochlorous (HOCl), ו רדיקלי הידרוקסיל (OH ^-) .

מינים חמצוני מיוצרים לא רק תחת מצבים פתולוגיים (סרטן, reperfusion איסכמי /, מחלות נוירולוגיות לב וכלי דם, מחלות זיהומיות, מחלות דלקתיות ^1, מחלות אוטואימוניות ^2, וכו ...) אלא גם במצבים פיזיולוגיים (לא פתולוגי) כגון חילוף החומרים התאי ^{3 , 4.} ואכן, ROS ממלאים תפקידים חשובים רבים מסלולי איתות תאיים (התפשטות, הפעלת תא ^{5, 6, 7} הגירה וכו '.). ROS יכול להיות מזיק (זה נקרא אז בשם"סטרס חמצוני nitrosative") כאשר מיוצר בכמויות גבוהות של תאים תאים תאיים בדרך כלל להגיב על ידי ROS upregulating נוגדי חמצון כגון superoxide dismutase (SOD) ו Catalase (CAT), peroxidase גלוטתיון (GPX) ו גלוטתיון (GSH) המגן אותם רדיקלים חופשיים על ידי המרת מסוכן מולקולות מזיקות (כלומר מים). ויטמינים C ו-E יש גם כמתואר נבלות ROS (נוגדי חמצון).

רדיקלים חופשיים הם מועילים סכומים נמוכים ^3. Macrophage ו נויטרופילים בתיווך תגובות חיסוניות לערב את ייצור שחרור NO, אשר מעכב וירוסים, פתוגנים התפשטות הגידול ^8. NO גם מגיב עם ROS אחרים ולכן, יש גם תפקיד כמו detoxifier (נבלות ROS). לבסוף NO פועלת על כלי לווסת את זרימת הדם שהינה חשובה ההסתגלות של השריר לממש ממושכת ^{9, 10.} פרסומים אחדים הראו גם כי ROS מעורבים Sens אינסוליןitivity ^{11, 12.}

שיטות רבות להעריך ייצור ROS זמינים. במאמר זה אנו מציעים מבחני פשוט, מהיר, וזול מספר: מבחני הללו אומתו על ידי פרסומים רבים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות ROS או השפעותיו בתאי יונקים. בעוד שחלק מבחני אלה לזהות ROS מרובים, אחרים לזהות רק ROS יחיד.

Protocol

1. איתור של ROS באמצעות carboxy-H ₂ DCFDA

Carboxy-H ₂ DCFDA הוא לא פלורסנט אלא בנוכחותו של ROS, כאשר זה מגיב מתחמצן, הוא הופך להיות פלואורסצנטי ירוק.

1. מיד לפני השימוש, פתרון להכין מלאי חדש של carboxy-H ₂ DCFDA ב dimethylsulfoxide סטרילי (DMSO) או 100% אתנול. הימנע מרובים ההפשרה / ההקפאה מחזורים של צבע שלך.
2. שוטפים את התאים עם HEPES שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) או פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר עקבות של המדיום המקורי.
3. טען תאים עם צבען (ואת צבע שליטה, סעיף ראו הערה). ב assay זה השתמשנו Jurkat, קו אנושי תא לוקמיה. השתמש carboxy-H ₂ DCFDA בריכוז הסופי של 1μM במדיום תרבות קבוע עם סרום מופחת (2%).
4. דגירה התרבויות במשך 30 דקות בחושך, בתוך חממה קונבנציונלי (37 ° C, CO2 5%). מחק את כל פתרונות לצבוע בשימוש.
5. הסר carboxy-H ₂ DCFDA המכיל בינוני לשטוף פעמיים עם HBSS או PBS. מתוך שלב זה קדימה, להגן על התאים שלך מפני האור.
6. הוסף בינוני טרי המכיל תרופה לפי בחירתך את carboxy-H ₂ DCFDA טעון תאים דגירה כרצונכם. בדוגמה זו אנו משתמשים H ₂ O ₂ (0.03%) במשך שעה 1.
7. הערכת ROS על ידי מיד לניתוח התאים על ידי זרימה cytometry באמצעות הערוץ FL1 (פלואורסצנטי ירוק), או על ידי קורא צלחת פלואורסצנטי, או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הקרינה ניתן לאתר באמצעות עירור ופליטה אורכי הגל המתאימים פלואורסצנטי ירוק.

הערה: בקרת צריכה לכלול carboxy-H ₂ DCFDA טעון בתאים שלא טופלו ותאי מטופל בלא כתם. Carboxy-H ₂ DCFDA ידוע לזהות peroxides אבל יכול להיות גם על ידי ROS חמצון אחרים. מגיב זה יכול גם להיות שונה באמצעים אחרים, לצבוע רגישות חמצון בקרה כגון 5 - (ו -6), carboxy-2 ", 7'-dichlordiacetate ofluorescein (carboxy-DCFDA) ולכן צריך להיכלל במבחן.

2. מדידה של ייצור תחמוצת החנקן (NO)

יהיה עליך Sulfanilamide ו-N-1-napthylethylenediamine (NED) פתרונות dihydrochloride, ורמת ניטריט. Assay זה נקרא assay Griess.

פתרון NED: הכן פתרון 0.1% dihydrochloride N-1-napthylethylenediamine מדולל פתרון water.Sulfanilamide סטרילי: הכן פתרון 1% sulfanilamide בדילול מלא חומצה זרחנית 5%. תקן ניטריט: לדלל את רמת הנתרן 0.1M הניטריט המניות 100μM במדיום סטרילי, לעשות דילול סדרתי במדיום זהה.

תנאי אחסון: כימיקלים חנות לפי הוראות היצרן בטמפרטורת החדר. כאשר מחדש, נד ופתרונות Sulfanilamide מאוחסנים מיד לאחר השימוש ב 4 ° C, בחושך, וגם לתקופה מקסימלית של 3 חודשים.

1. התרבות תאים בצלחת 96 באר,השימוש triplicates עבור כל תנאי, והם כוללים בקרות נאותה על פי הניסויים שלך.
2. פנקו את התאים כדי לגרום NO הייצור. בניסוי שלנו אנו משתמשים lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) ו-IL-4 רקומביננטי לטיפול בתאים שלנו. בפרוטוקול זה, השתמשנו RAW 264.7, macrophage עכבר קו תאים (leukaemic עכבר קו מונוציטים macrophage התא).
3. ביום של assay, להביא את שני ריאגנטים לטמפרטורת החדר.
4. ספין הצלחת שלך, לאסוף supernatants תא ולהעביר 50μl לצלחת 96 חדש גם כן. הכן הגבלת בארות דילול של מניות פתרון סטנדרטי שלך לעשות עקומת סטנדרטי.
5. הוסף 50μl הפתרון Sulfanilamide לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב.
6. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
7. הוסף 50μl של פתרון N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב.
8. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
9. מדוד absorbance מיד באמצעות קורא צלחת עם מסנן של אורכי גל שבין 520nm ו 550nm.

אם אתם משתמשים שונים צלחת / תבשיל גדלים, להשתמש 1/1/1 נפח לפתרון כל supernatant המדגם.

צבע סגול יופיעו בארות חיובית. התוצאות שהושגו עם תקן יעזור לך לבדוק את היציבות של פתרונות שלך.

3. איתור של ROS פעולה: חלבונים חמצון

שיטה אחרת כדי לזהות את הייצור של ROS הוא להסתכל על התוצאות הסופיות על ידי גילוי חמצון של חלבונים. ואכן, ROS לשנות גלוטתיון, נוגד חמצון זה בא לידי ביטוי ברוב התאים יש תפקיד מגן מפני ROS. בעקבות חמצון על ידי ROS, שינוי של הקטינה גלוטתיון (GSH) תוצאות בקבוצה (תיאול) sulfhydryl של ציסטאין היותו קשור גלוטתיון שנייה באמצעות גשר דיסולפיד. הדבר מוביל להיווצרות חלבון dimerized (GSSG חלבון חמצון). GSH ניתן לשחזר באמצעות שינוי של GSSG ידי רדוקטאז גלוטאתיון. הגידול יחס GSSG / GSH משקף סטרס חמצוני. Assay הבא מבוסס על זיהוי וכימות של החלבונים האלה חמצון. שיטה זו אינה סלקטיבית עבור ROS ספציפי אלא מזהה את ההשפעות של NO, H ₂ O _2, O ₂ ו ^- ROS אחרים. כאן אנו למדוד את הכמות הכוללת של חמצון (GSSG) ו מופחת (GSH) גלוטתיון באמצעות אותות bioluminescent.

1. זרעים התאים בצלחת 96 באר (לבן / שקוף, תחתית שטוחה) כרגיל. לצורך ניסוי זה, השתמשנו 1x10 ⁴ תאים לכל היטב חסיד 264.7 ו A549 תאים גלם Jurkat תאים ההשעיה. בהתאם לגודל של התאים שלך מספרים אלה יכולים להיות מותאמים. אנו ממליצים לתאי צלחת חסיד יום לפני המבחן כדי לאפשר להם לצרף את הצלחת. מספיק בארות צריכים להיות מוכנים לגילוי חלבון חמצון מופחתת, כמו גם עבור "רק בינוני" ובתאים שלא טופלו כפי שולטת. השתמש triplicates כל התנאים.
2. פנקו את התאים שלך עם התרופה שלך בפעם הנדרש. כאן התייחסנו תאים Jurkat ו A549 תאים 1h עם H ₂ O ₂ (ב 5mm ו 2.5mm בהתאמה). Raw 264.7 תאים שטופלו 200ng/ml של LPS עבור 16 ח במהלך תקופה זו הדגירה, להביא את כל ריאגנטים שלך לטמפרטורת החדר (RT). הפוך את כל ריאגנטים לא יותר מ 30 דקות לפני ביצוע הבדיקה. הטבלה שלהלן מציגה את הכרכים של ריאגנטים לכל טוב. במידת האפשר, חשוב להסיר את המדיה שמכילה את סוכן הפחתת לפני שתמשיך הבדיקה.

	חסיד תאים		השעיה תאים
	תמוגה סך Glu	חמצון Glu תמוגה	תמוגה סך Glu	חמצון Glu תמוגה
Nem, 25mm	אף אחד	0.5μl	אף אחד	0.5μl
Luciferin-NT	1 μl	1 μl	1 μl	1 μl
מאגר תמוגה פסיבי, 5X	10μl	10μl	10μl	10μl
מים מזוקקים	39.0μl	38.5μl	14μl	13.5μl
נפח סופי לכל טוב	50μl	50μl	25μl	25μl

3. הסר בינוני מבארות עם תאים חסיד. אל תסיר בינוני בבארות עם תאים ההשעיה.
4. הוסף מופחת מגיב תמוגה גלוטתיון מחומצן או תמוגה מגיב גלוטתיון את בארות המתאים וללחוץ במשך 5 דקות ב RT.
5. הוסף מגיב הדור Luciferin ו incubatדואר במשך 30 דקות ב RT.
6. הוסף מגיב איתור Luciferin ו דגירה במשך 15 דקות ב RT.
7. קרא את האות bioluminescent בזמן שילוב של שנייה 0.25-1 דולר היטב באמצעות luminometer הקורא צלחת.

	חסיד תאים	השעיה תאים
מספר נייד לכל טוב	1x10 4	1x10 4
תא השעיה לכל תרופה + טוב	100 μl, יש להסיר לפני 3.4	25μl, לא יוסר
מגיב גלוטתיון מופחתת תמוגה	50 μl	25μl
גלוטתיון מחומצן תמוגה מגיב	50 μl	25μl
Luciferin מגיב דור	50 μl	50 μl
Luciferin מגיב איתור	100 μl	100 μl

4. נציג תוצאות:

איור 1 איתור של ROS באמצעות carboxy-H2DCFDA לצבוע. תאים Jurkat (קו אנושי תא לוקמיה) שטופלו עם H ₂ O ₂ הושוו לא טופלו התאים. ROS גורם שינוי של carboxy-H ₂ DCFDA כי מאיר ירוק כפי שזוהו על ידי cytometry זרימה, השיא ניאון H ₂ O ₂ תאים שטופלו שינוי לעומת הפסגות שולטת (H ₂ O ₂ תאים שטופלו מוכתמים בצבע חמצון לא רגיש ולא שטופלו בתאים מוכתם carboxy-H ₂ DCFDA). תוצאות לאשר את קיומו של ROS בתאים שטופלו.

איור 2 איתור oו NO באמצעות ריאגנטים Griess. RAW 264.7 תאים (עכבר macrophage) טופלו LPS ו - IL-4. עלייה משמעותית בייצור NO זוהה בתאים שטופלו לעומת שליטה בתאים שלא טופלו.

שורות תאים	ללא טיפול	המטופלים
Raw 264.7	13.0	8.3
A549	21.6	10.5
Jurkat	5.2	2.8

לוח 1: איתור של ROS בתיווך חמצון של חלבונים. RAW 264.7 תאים שטופלו LPS, Jurkat ו A549 (סרטן ריאה אנושית) תאים שטופלו H ₂ O _2. תוצאות מבוטאות כיחס מופחת (GSH) / חמצון (GSSG) גלוטתיון. יחס נמוך של גלוטתיון (GSH) / (GSSG) התגלו תאים שטופלו לעומתשליטה בתאים שלא טופלו, חושף כי חלבונים היו מתחמצן יותר בתאים שטופלו.

Discussion

במצבים פתולוגיים אחדים כגון מחלות, סרטן דלקתיות, איסכמיה / reperfusion, גם טיפולים כגון קרינה או כימותרפיה (ציספלטין למשל) לעורר ייצור יתר ROS. לפיכך, גילוי מדידת רמות ROS חשוב רבים, מחקרים בסיסיים טרום קליניים וקליניים. עם זאת, ROS יש מחצית חיים קצר מאוד יכול להיות מסובך לזהות. כ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
5 - (ו -6), carboxy-2 ", 7'-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA)	מולקולרית בדיקות	C369	שליטה
carboxy-H 2 DCFDA	מולקולרית בדיקות	C400
Sulfanilamide	סיגמא	S9251-100 גרם
N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride	סיגמא	N9125-10G
ניטריט תקן	סיגמא	237,213, 100 גרם
GSH / GSSG זוהרים Assay	Promega	V6612	כדי לכמת חמצון, או חמצון מופחתת / מופחת גלוטתיון