Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Summary

הסחוסים Craniofacial לפתח בקשר הדוק עם רקמות אחרות וקשה לתפעל חיות לחיות. אנחנו משתמשים electroporation לספק כלים מולקולריים במהלך הצמיחה של השלד craniofacial תוך עקיפת תופעות העוברית המוקדמת. גישה זו תאפשר לנו לבחון ביעילות מולקולות מועמד In vivo.

Abstract

Electroporation היא שיטה יעילה של אספקת DNA ו מקרומולקולות טעונים אחרים לרקמות בנקודות זמן מדויק במקומות מדויקים. לדוגמה, electroporation שימש בהצלחה רבה ללמוד ההתפתחות העצבית ואת רשתית ב Xenopus, עוף עכבר ^1-10. עם זאת, חשוב לציין כי כל המחקרים הללו, החוקרים לא היו המיקוד הרקמות הרכות. כי אנו מעוניינים בפיתוח craniofacial, התאמנו שיטה למקד mesenchyme הפנים.

כאשר חיפשנו את הספרות, גילינו, להפתעתנו, דיווחים מעטים מאוד מוצלח של העברת גנים לתוך רקמת סחוס. רוב המחקרים הללו היו מחקרים ריפוי גנטי, כגון משלוח siRNA או החלבון לתוך שורות תאים chondrogenic, או במודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים ^11-13. במערכות אחרות, כגון עוף או עכבר, electroporation של mesenchyme הפנים כבר מאתגר (communicat אישייונים, מחלקת פיתוח Craniofacial, KCl). החוקרים שיערו כי electroporation לרקמות procartilaginous ו סחוסי ב Xenopus יכול לעבוד טוב יותר. במחקרים שלנו, אנו מראים כי העברת גנים לתוך סחוסים הפנים מתרחשת ביעילות בשלבים מוקדמים (28), כאשר primordium הפנים מורכבת עדיין של רקמות רכות לפני בידול הסחוס.

Xenopus היא מערכת החולייתנים נגיש מאוד לניתוח של פיתוח craniofacial. מבנים Craniofacial הם בקלות רבה יותר גלוי Xenopus מאשר כל מודל חוליות אחרים, בעיקר משום עוברי Xenopus הן מופרות באופן חיצוני, דבר המאפשר ניתוח בשלבים המוקדמים, והקלה על הדמיה ברזולוציה לחיות תא בודד, כמו גם שימוש חוזר של ¹⁴ אמהות. בין הדגמים חוליות פיתוח חיצונית, Xenopus שימושית יותר לניתוח craniofacial מאשר דג הזברה, כמו זחלים Xenopus הם גדולים יותר, קל יותר dissect, ובאזור הפנים פיתוח נגיש יותר מאשר באזור הדמיה המקבילה דגים. בנוסף, Xenopus היא אבולוציונית קרוב יותר לבני אדם מאשר דג הזברה (~ 100 מיליון שנה קרובה) ^15. לבסוף, בשלבים אלה, ראשנים Xenopus הם שקופים, והביטוי מקביל של חלבונים או מולקולות ניאון תאפשר ראיה קל של הסחוסים מתפתחות. אנו צופים כי גישה זו תאפשר לנו במהירות וביעילות מבחן מולקולות מועמד במערכת מודל vivo.

Protocol

חלק 1 א. ציוד

מיקרוסקופ: היקף סטריאו לנתח זקוף במטרה צריכת חשמל נמוכה

• מתח / Pulse Generator: BTX ECM 830 מערכת כיכר electroporation Wave
• פיפטה חולץ: P-87 micropipette פולר (החברה סאטר Instrument, CA)
• Manipulator: גס, או בשילוב גס קנס תלוי בהכנה.
• בעל micropipette: כלים המדע פיין
• אלקטרודה: תוצרת בית
• Electroporation קאמרית: תוצרת בית

בצורת אלקטרודות:

1. גזור 8 ס"מ של טוהר גבוהה 0.4 מ"מ תיל טונגסטן (גודפלו) ו להטביע את נקודת האמצע מזרק 1ml באמצעות מרק (אנו משתמשים Blu-Tack). השאירו 4 טונגסטן ס"מ חוט חשוף מקצה המזרק ואת קצה לכופף לצורה-L, 1 ס"מ מהקצה (איור 1A).
2. חיתוך קצה, כך בסופו של דבר באמצעים 0.5 מ"מ אורך. Tהטיפ שלו הוא הסופית אלקטרודה.
3. הפעלה מקבילה עודף תיל טונגסטן כדי מזרק ולהשתמש בו כדי לחבר את מחולל דופק אלקטרודה.
4. חזור על תהליך קבלת זוג אלקטרודות.
5. צרף אלקטרודות מחולל גל מרובע הדופק באמצעות כבלים DC.

Electroporation קאמרית

1. השורה התחתונה של צלחת 90 ​​מ"מ עם פלסטלינה ~ 5 רעיל מ"מ.
2. מלאו צלחת עם התקשורת electroporation.
3. שימוש מס '5 מלקחיים של שען לגלף היטב בצורת האות T (איור 2). גם ארוך צריך למדוד ~ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 10 מ"מ קצר ~ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 5 מ"מ. המנה electroporation ניתן לכבס ולעשות בהם שימוש חוזר.

חלק 1B. ריאגנטים

דנ"א או מקרומולקולות טעונה

• Micropipettes: 1 מ"מ רחב 4 "ארוך בורוסיליקט זכוכית נימים (WPI, TW100-F)
• תרבות התקשורת: רגיל אמפיבי מדיה (NAM)
• > 10 X במלאי: 1100 mM NaCl, 20KCl mM, 10 mM Ca (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 mM EDTA.
  • החיטוי ולאחסן ב 4 ° C.
  • 1 X NAM: מדולל מתוך המאגר 10x מניות, עם 0.1 מ"מ NaHCo ₃ ו - 0.2 mM Na ₃ PO _4.
• Xenopus laevis ראשנים, שלב 28

ה-DNA הכנה:

1. הכן פלסמידים ביטוי תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים.
2. Resuspend DNA לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl ב nuclease חינם H ₂ 0.

* יש לנו הצלחה עם וקטורים המכיל מקדם חזק CMV, כגון pCS2 + [16]. לניתוח השושלת, אנחנו בדרך כלל כוללים DNA קידוד חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP pCS2 +) בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl. [ריכוזי ה-DNA בין 0.1-3 מיקרוגרם / μl נבדקו גם. מצאנו כי ריכוזים מתחת 0.8 מיקרוגרם / μl תאים שכותרתו יעיל, בעוד ריכוזי DNA יותר מ 2 מיקרוגרם / & Mu; אני לא לשפר את יעילות electroporation].

Morpholino oligonucleotide הכנה:

(הערה:. MOS צריך להיות fluoresceinated (3'-carboxyfluorescein שונה) או טעונים אחרת)

1. Resuspend morpholino oligonucleotides (MOS) (Genetools, www.genetools.com ) בריכוז של 2 מ"מ ב nuclease חינם H ₂ 0.
2. Aliquot חום של פתרון המניה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
3. לדלל את הריכוז הסופי של mM 0.5 במים nuclease חינם.

* 0.1-1mm MO פתרונות נבדקו. 0.5 mM פתרונות MO היו מספיק electroporation של תאים mesenchymal רבים.

Micropipettes

1. הכן micropipettes מ בורוסיליקט זכוכית נימים (1 מ"מ רוחב, 4 "ארוך, WPI לא. TW100-F). השתמש חולץ מחט להכין micropipettes עם להתחדד ארוך 8-12 מ"מ טיפ נאה.
2. קראש קצה ~ 2 מ"ממקצה באמצעות מלקחיים, יצירת לשבור משוננים.

מדיה

1. התקשורת דגירה: הכן טרי 3 / 4 רגילה אמפיבי מדיה (NAM) ממלאי 1x. הוסף 0.025 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin.
2. התקשורת electroporation: כאמור לעיל, עם 0.1% בנזוקאין (סיגמא, 06950).

2. Electroporation

Micropipette ההתקנה

1. מלאו micropipette עם פתרון 1 ~ הזרקת μl.
2. Secure micropipette ב micromanipulator ומתחברים microinjector (Picospritzer II).
3. זווית micropipette ב 50 ° מן השולחן.
4. הגדרת הלחץ הזרקה ב 20 PSI.
5. כיול micropipette להזריק 30 nl לכל הדופק.

ראשן הכנה

1. הרדימי 28 הבמה הזחלים Xenopus ידי דוגרים בתקשורת electroporation במשך 5 דקות.
2. העברת הראשנים מרדים לתוך תא electroporation מלא התקשורת electroporation. מיקום העוברבתוך הארוך גם כך הראש נח צומת הטי עם הצד הגבי למטה בצד הגחון חשוף. הראש צריך להיות מוגבה מעט לעומת הזנב.
3. בעזרת מלקחיים, בעדינות מאובטח הראשן היטב עם הסובבים פלסטלינה. (הערה:.. אם הראשן אינו מאובטח, הוא עשוי להתעוות מגע אלקטרודה במהלך electroporation במקרה זה לבטל את ראשן כמו רקמות הפנים ייפגעו קשות)

Electroporation

1. הוספת טיפ micropipette האחורי מיד בלוטת מלט לתוך mesenchyme הפנים.
2. הזרק 30 פתרון nl לתוך mesenchyme.
3. Micropipette לסגת.
4. במהירות ליישר טיפים אלקטרודה במקביל הראש של העובר (איור 3).
5. החל 8 50 ms, קטניות 20mV רבועים.
6. לסגת אלקטרודות.
7. בעזרת מלקחיים ובזהירות לשחרר הראשן מבאר ולהעביר 3 / 4 NAM, 0.025 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin.
8. הראשנים ניתן מודגרות ב 3 / 4 NAM, 0.025 מ"ג / מ"ל ​​overnight, או יותר.
9. מסך עוברים electroporation יעיל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 24 שעות.

3. נציג תוצאות:

השימוש מולקולות ניאון מאפשר סינון קל של עוברים electroporated. איור 4 מראה טיפוסי של אצווה MO electroporated הראשנים ~ 12, 48 ו - 96 שעות לאחר electroporation, מודגרות על 14.5 ° C. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, MOS ניתן דמיינו מיד לאחר electroporation ו להימשך מספר ימים לאחר electroporation. מניסיוננו, הקרינה מתבטא בחולשה בשלב 46 (~ 5 ימים לאחר מכן). ב סחוסים, הקרינה פוחתת באופן דרמטי לאחר תחילת התמיינות (~ רח' 42), אולם MO הקרינה נמשכת חזק יותר סוגי תאים אחרים כגון האנדודרם בלוע. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה כי oligonucleotides משולבות רקמות craniofacial מספר כולל סחוס. Oligonucleotide פלואורסצנציה גלעתים קרובות להיות דמיינו ברקמות משני צדי הראש. זהו כנראה עקב דיפוזיה מהירה של הפתרון הזרקת ברחבי mesenchyme craniofacial משוחרר לפני electroporation.

איור 1 אלקטרודות ביתי. בצורת תיל טונגסטן מצורף מזרק 1 מ"ל באמצעות חומר רעיל או מרק. (א) אלקטרודה הסופית אמצעים 5 מ"מ. (ב) צרף זוג אלקטרודות, כך Termini לרוץ במקביל. אלקטרודות מחוברות על ידי גנרטור הדופק כבלים DC.

איור 2 קאמרית electroporation. (א) 90 מ"מ צלחת מרופדת פלסטלינה מלא מדיה תא T בצורת חרוט עם מלקחיים לא שען של 5. (ב) צד ארוך צעדים 2 מ"מ X 2 מ"מ X10 מ"מבעוד צעדים קצרים 2 מ"מ X 2 מ"מ X 5 מ"מ. ראש העובר מונח בצד, T-בצומת עד הגחון.

איור 3 הממחישות סכמטי הליך electroporation. 28 סנט הראשן ממוקם בתא electroporation, בצד הגחוני למעלה. Micropipette מוכנס לתוך הפנים בלוטת מלט הבסיסית mesenchyme. להזריק. Micropipette יוסר בצורת אלקטרודות מיושרים במקביל משני צדי הראש. החל eight 50 מילישניות, 20 mV פולסים מרובעים. לסגת אלקטרודות. לגדל ראשנים לשלבים הרצוי. Visualise MOS או ביטוי של GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

איור 4 ראשנים נציג 12 (א), 48 (ב) ו 96 (ג) שעות electroporation פוסט (שלבים 30, 34 ו 44 בהתאמה). ("-B") פלורסנט MO ניתן דמיינו בתוך mesenchyme craniofacial בבית צביes 30 ו 34. Fluorescence ניתן להבחין סחוסים בשלב 44 (ראש חץ, C'-C "). במעיים היא autofluorescent מאוד.

Discussion

בסרטון הזה, אנחנו הדגימו את ההיתכנות של משלוח electroporation בתיווך גנים לתוך mesenchyme הפנים של Xenopus ראשנים. בגישה זו, אנו יכולים לעקוף את השפעות ההתפתחות המוקדמים של מניפולציה תפקוד הגן מאפשר לנו למקד רקמות ספציפיות בנקודות זמן מאוחר יותר. המחקרים שלנו מראים כי באוכלוסיות הטרוגנית של תאים mesenchymal craniofacial יכול להיות מושפע, מאפשר לנו לבחון את שושלת היוחסין של תאים electroporated כמו גם דרישות אוטונומי התא חלבונים של עניין. בשילוב עם הדמיה לחיות, אנחנו יכולים להשתמש בגישה זו כדי לחקור תפקוד גנים, במשך הזמן, במהלך ההתפתחות craniofacial. שיטה זו מדגישה את הרומן נהילות של Xenopus לחקר organogenesis. אנו צופים כי בשיטה זו ניתן להתאים באופן כללי ללמוד המורפוגנזה והבחנה של רקמות אחרות.