ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

Summary

Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating שלהם במבחנה.

Abstract

הגנום של רטרווירוסים הוא עטוף capsid מוקף במעטפת השומנים. עבור lentiviruses, כגון HIV-1, הקליפה חרוטי capsid מורכב החלבון CA מסודרים כמו סריג של משושה. Capsid סגור על ידי 7 pentamers בסוף רחב 5 בקצה הצר של חרוט ^{1, 2.} עטוף במעטפת זו capsid הוא מורכב ribonucleoprotein ויראלי, ויחד הם מהווים את הליבה.

בעקבות איחוי של קרום ויראלי עם קרום התא היעד, HIV-1 הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה. Capsid אז מפרק שחרור CA חינם בצורה מסיסה ³ בתהליך המכונה uncoating. המיקום והעיתוי תאיים של uncoating-HIV-1 הם הבינו היטב. חומצה אמינית בודדת החלפות ב-CA אשר משנים את יציבות capsid גם לפגוע ביכולת של HIV-1 להדביק תאים ^4. זה מצביע על יציבות capsid הוא קריטי עבור הידבקות ב-HIV-1. HIV-1 uncoating כבר קשה ללמוד בשל היעדר זמינות של מבחני רגיש ואמין עבור תהליך זה. כאן אנו מתארים שיטה כמותית ללימוד uncoating במבחנה באמצעות ליבות מבודד HIV-1 חלקיקים זיהומיות. גישה כוללת הבידוד של ליבות על ידי שקיעה של virions מרוכזת באמצעות שכבה של חומר הניקוי לתוך מפל סוכרוז ליניארי, בקור. כדי לכמת uncoating, גרעינים המבודד מודגרת ב 37 מעלות במרווחים מתוזמנים שונים pelleted לאחר מכן על ידי ultracentrifugation. היקף uncoating מנותח על ידי לכימות שבריר של CA ב supernatant. גישה זו כבר מועסק על מנת לנתח את ההשפעות של מוטציות ויראליות על יציבות HIV-1 capsid ^{4, 5, 6.} זה צריך להיות שימושית גם עבור לומד את התפקיד של גורמים הסלולר uncoating-HIV-1.

Protocol

1. הפקה של HIV-1 חלקיקים

לפני שתמשיך, אתה חייב לקבל אישור ובצע את ההנחיות ממשרד biosafety של המוסד שלך לעבוד במתקן biosafety אישר ל-HIV זיהומיות. עליך להבטיח כי טיפול נאות אמצעי בטיחות הם אחריו במהלך העבודה במעבדה biosafety.

הפקה של HIV-1 החלקיקים מתבצע בדרך כלל על ידי transfection חולף של תאים 293T עם DNA-HIV-1 proviral בעזרת סידן פוספט transfection השיטה ^{7, 8.} כייל הנגיף גבוהה במניות גדל בתרבות של תאים T נגועים גם הם מתאימים.

1. 293T התרבות התאים השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS) שיושלם עם אנטיביוטיקה [פניצילין (100 IU / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל)], בעמ '37 ° C, CO 5% ₂ .
2. ניתוק תאים מנות כמעט ומחוברות באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA וזרעי 2x10 ⁶ 9 תאים מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ תרבות יום לפני transfection. Six Seed 100 מ"מ תרבות מנות לייצור virions. אם הכנה מרוכזת של ליבות נדרש, מנות יותר יכול להיות seeded עבור transfection.
3. ביום הבא, monolayers התא צריך להיות בערך 25% ומחוברות ומוכן transfection. במשך שש מנות של תאים להיות transfected, להביא 120 מיקרוגרם של ה-DNA proviral עד נפח של 2.7 מ"ל עם מים סטריליים. לתערובת זו להוסיף 0.3 מ"ל של 2.5 מ 'CaCl ₂ ו - 3 מ"ל של 2XBBS, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. אפשר לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10-20 דקות.
4. הוסף 1 מ"ל של dropwise את התערובת וכתוצאה מכך למרכז של כל מנה מתערבל תוך כדי לערבב בעדינות. מניחים את הכלים הלילה (~ 16 שעות) בקבוצת באינקובטור ב 35 ° C ו 3% CO _2.
5. לשאוב את המדיום תרבות בעדינות להוסיף 5 מ"ל PBS.
6. לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום חדש. התרבות התאים החממה ב 37 &מעלות: C ו 5% CO ₂ עבור 24-48 שעות נוספות.
7. אסוף את supernatant תרבות המכילה חלקיקים נגיפיים, להעביר אותו צינור מ"ל 50 צנטריפוגות חרוטי. מערבבים את supernatants מן המנות כל צנטריפוגה XG ב 1500 עבור 5 דקות לתאי גלולה ופסולת. סינון באמצעות supernatant 0.45 נקבוביות בגודל מיקרומטר מסננים מזרק. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי לצמצם את היווצרות תרסיס תוך כדי עבודה עם נגיף חי. זה כולל את השימוש של צינורות בצורת חרוט עם טבעות אטימה או מכסה דלי הרוטור במהלך השלב צנטריפוגה. אם זה לא אפשרי, כובעים את הבורג של צינורות צריך להיות עטוף parafilm.

2. ריכוז של HIV-1 virions ידי ultracentrifugation

1. מניחים את supernatant תרבות (30 מ"ל) ב צינור 38.5 polyallomer צנטריפוגות מ"ל (עבור רוטור SW32Ti Beckman או שווה ערך). בעדינות ביסוד supernatant וירוס עם פתרון המכיל 5 מ"ל סוכרוז 20% PBS באמצעות pipet 5 מ"ל.
2. צנטריפוגה במשך 3 שעות32,000 סל"ד ב 4 ° C (175,000 XG ב r _{מקסימום)} לחלקיקים גלולה וירוס.
3. הסר supernatant על ידי שאיפה, נזהרת שלא להפריע את הכדור בחלק התחתון של הצינור. הוסף 0.5 מ"ל של 1XSTE חיץ (10 mM טריס-HCl [pH 7.4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) אל הצינור מקום 4 ° C למשך שעה 1 כדי לשחרר את גלולה. שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ"ל pipet בעדינות מעלה ומטה כמה פעמים לנתק את הכדור מהחלק התחתון של הצינור. לאחר מכן, להעביר את גלולה התיר את צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל, לטפל כדי למנוע הקצפה. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות כדי לאפשר גושים קטנים של הווירוס להתפזר. במהלך תקופה זו, להכין את שיפוע סוכרוז כפי שמתואר בשלב 3.1.
4. בעדינות pipet ההשעיה וירוס מעלה ומטה מספר פעמים צנטריפוגות ב 8000 סל"ד (6,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס microfuge בקירור דקות 1 כדי להסיר גושים שיורית. שמור על קור המדגם במהלך תהליך זה.

3. סוכרוז שיפועצנטריפוגה כדי לבודד ליבות

HIV-1 ליבות מבודדים באמצעות "ספין-thru" שיטת ⁹ המהווה שינוי של השיטה המתוארת לעיל לטיהור של HIV-2 ליבות ^10.

1. הכן 12 מ"ל שיפוע ליניארי 30% עד 70% סוכרוז במאגר 1XSTE בתוך צינור 14.5 polyallomer צנטריפוגות מ"ל עבור SW32.1Ti הרוטור. כדי להכין את שיפוע, להשתמש שיפוע 20 מ"ל לשעבר: מקום 6 מ"ל של תמיסת סוכרוז 70% בצד הקרוב (קרוב ליציאת לשקע) ו 6 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30% בצד הרחוק. ודא כי בועות אוויר לא לכודים ערוץ המחבר את שני חדרים. השתמש Densi-Flow אוטומטי הדרגתי לשעבר המשאבה הדרגתי מלמטה למעלה של שפופרת המכילה 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 85% בתחתית. בעדינות במקום שיפוע ב 4 ° C עד מקורר (2-4 שעות).
2. שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ"ל בעדינות שכבת צבע עם 0.25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 15% STE המכיל 1% טריטון X-100.
3. בעדינות את שכבת עם 0.25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 7.5% ב STE שימוש רחב לשעמם 1 pipet קצה מ"ל. היזהרו שלא לערבב את השכבות.
4. בעדינות עם כיסוי ההשעיה 0.5 מ"ל וירוס משלב 2.4. צעד זה צריך להתבצע בזהירות, כדי למנוע כל הפרעה השיפוע ערבוב של שכבות סוכרוז מודגשים.
5. מניחים את צינורות בדלי SW32.1Ti מראש מקורר צנטריפוגות ב 32,000 סל"ד (187,000 XG ב r _{מקסימום)} למשך הלילה (16-20 שעות) בשעה 4 ° C. כדי למנוע הפסקה של צנטריפוגות, אל תתחיל צנטריפוגה עד ואקום בצנטריפוגה מגיע 250 מיקרומטר
6. איסוף שברים 1 מ"ל מלמעלה למטה של ​​שיפוע באמצעות fractionator אוטומטי Densi-Flow הדרגתי. מניחים את הצינורות על קרח מיד עם האוסף. מערבבים את התוכן של הצינורות על ידי כמה פעמים היפוך, ולסגת 50 μl של חלק עבור כל כימות של ELISA או assay להפוך פעילות transcriptase.

4. לוקליזציה של HIV-1 ליבותואחסון של ליבות

1. לפני ביצוע מבחני uncoating, חשוב כדי לקבוע אילו שברים שלמים המכילים HIV-1 ליבות. זה יכול להיקבע על ידי ELISA p24 או transcriptase הפוכה פעילות assay באמצעות 50 aliquots μl משלב 3.6.
2. ההתאוששות של CA הקשורים ליבות קשורה לעתים קרובות ליציבות של גרעינים. מדד הליבה הקשורים CA על ידי ELISA p24 ⁹ באמצעות מדגם של כל חלק. לחלופין, למדוד את פעילות transcriptase הפוכה של כל חלק. באמצעות שתי השיטות השיא צריך להיות סביב חלק 10.
3. בריכת שברים המכיל ליבות. אם ליבות אינם לשמש uncoating assay מיד, aliquot ליבות אספו לתוך 0.2-0.3 aliquots מ"ל, פלאש הקפאת N2 נוזלי חנות ב -80 ° C. גרעינים קפואים בדרך זו מתאימים assay uncoating. התשואה של CA הליבה הקשורים הוא בדרך כלל 1-2 מיקרוגרם למיליליטר של לכל p24 או כ -15% מכלל virion הקשוריםp24.

5. Assay קינטי של uncoating-HIV-1

1. הסכום של HIV-1 ליבות הנדרש לכל תגובה uncoating הוא כ 50 ננוגרם. כדי לבצע את assay ב uncoating חוץ גופית, predilute aliquot של ליבות עם נפח שווה של חיץ 1XSTE קר כדי להפחית את הצמיגות של ההשעיה כדי למזער שגיאות pipetting.
2. בנוסף לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ"ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA ב צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. אנחנו משלימים את המאגר STE עם BSA (10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי למזער את ספיחה של CA על הקירות של הצינור. מערבבים על ידי פעמים את הצינור היפוך מספר. אל המערבולת דגימות. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות במרווחים מתוזמנים (15, 30, 60 ו 120 דקות). צינורות צריך להיות שקוע באמבט מים לפחות עד לרמה של המדגם פנימי על מנת להבטיח אפילו התחממות.
3. במהלך הדגירה, לערבב בעדינות את תוכן הצינור מעת לעת (בדרך כלל 5 -10 דק ') על ידי מצליף את הצינורית. לשליטה דקה אפס, לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ"ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר לדגור על הקרח לכל אורך הניסוי (120 דקות). השליטה דקה אפס נותן את הערך uncoating הבסיס, משמש לקביעת עליית uncoating ליבות מודגרות ב 37 מעלות במרווחים בעיתוי שונה.
4. בתום תקופת הדגירה, לעצור את תהליך uncoating ידי הנחת צינורות קרח למשך 10 דקות.
5. צנטריפוגה צינורות ב 45,000 סל"ד (רוטור TLA-55: 125,000 XG ב r _{מקסימום)} במשך 20 דקות 4 ° C. זו תהיה גלולה ליבות שלם CA חינם שוחרר כתוצאה uncoating ליבות יישאר supernatant. הרוטור צריך להיות precooled ב 4 ° C לפני העמסת דגימות.
6. מעבירים את supernatant חדשים צינורות microfuge precooled רצוי בעזרת ג'ל טעינת טיפים המאוחסן בטמפרטורת החדר. שים לב גלולה לא יהיה גלוי לעין, כך לטפל w קיצונייםבשעה שהייתי pipetting את supernatant. Resuspend את כדורי ב 250 μl של diluent מדגם ELISA (0.5% טריטון X-100 ו - 5% התורם עגל בסרום PBS). כדי להבטיח פיזור יעיל של גלולה, מערבולת לאחר הוספת diluent מדגם ELISA. לכמת את התוכן CA של גלולה ו supernatant באמצעות ELISA p24 כפי שמתואר בסעיף הבא.
7. היקף uncoating מתקבל על ידי חישוב החלק היחסי של CA נוכח supernatant.

6. Assay עבור CA על ידי ELISA p24

1. רבים ערכות ELISA מסחרי זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכמת CA. כל שימוש מסחרי או "בתוך הבית" ELISA וכוללים סטנדרטים p24 כדי לקבוע את הליניאריות של assay. דילולים של דגימות צריך להיות assayed כדי להבטיח דיוק.
2. פיתחנו ELISA תוצרת בית שבו אנו משתמשים באופן שגרתי כדי assay עבור CA. ההליך מותאם מדוח הקודם ¹¹ ו מבוצע באמצעות גלאי ללכוד נוגדנים זמין מתרומת זרע NIHS מחקר מגיב תוכנית הפניה.

7. נציג תוצאות:

דוגמה מכך מן ELISA לקביעת שברים המכיל ליבה מוצג באיור 1. לאחר איסוף שברים (1 מ"ל כל אחד), 50 μl של כל חלק מן המדגם היה להשתמש בו כדי להפוך דילולים סדרתי ונותחו על ידי ELISA. P24 הכולל מתקבל על ידי הוספת ערכים במשך שתים עשרה שברים היה 14.5 מיקרוגרם. כפי שמוצג שברים דמות 8-10 ליבות הכיל. הערך p24 עבור הליבה המכילים שברים היה 2.17 מיקרוגרם. האחוז של הליבה הקשורים p24 (14.97%) נקבע על ידי לקיחת היחס בין ערך p24 עבור שברים הליבה (2.17 מיקרוגרם) לערך p24 הכולל (14.5 מיקרוגרם). חלק 1 או 2 תמיד מכילים כמות גבוהה של p24, זה מייצג CA חינם אשר אינו משויך ליבות. זה ואחריו הפחתה הדרגתית של ערכי p24 עם חלק אחד לאחר מכן, ולאחר מכן עלייה חדה ולבסוף ירידה חדה p24הערכים. אם טיפול נאות הוא נלקח בעת טעינת שיפוע אז בשיא הליבה הקשורים CA נמצא סביב חלק 10.

תוצאה אופיינית מתקבל על ידי assaying את הקינטיקה של uncoating של HIV-1 ליבות מוצג באיור 2. הגרף מראה גידול תלוי זמן ב uncoating של wild-type HIV-1 ליבות. אחוז uncoating ערך הושג על ידי חישוב שבריר של CA נוכח supernatant. בעזרת תרגול, assay הוא לשעתקו מאוד שימושי לקביעת יציבות ליבות ויראלי במבחנה. יש לציין כי שחזור של assay תלויה מאוד בטיפול נאות של הדגימות במהלך ההליך. מאז ליבות הם חום יציב, הדגימות יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך assay למעט בתקופת הדגירה.

איור 1 צפיפות שיווי משקל הדרגתי של צנטריפוגהHIV-1 ליבות. ההשעיה וירוס מרוכז היה מוחל על החלק העליון של מדרון 30-70% סוכרוז ליניארי ועליהן 1% Triton-X-100. לאחר צנטריפוגה ולינה XG 187,000 ו 4 ° C, 1 שברים מ"ל נאספו מלמעלה (שבר 1) לתחתית (שבר 12) ו - p24 היה לכמת ידי ELISA.

איור 2 כמובן זמן של uncoating HIV-1 במבחנה. מטוהרים HIV-1 ליבות היו בדילול וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחי הזמן המצוין. המדגם דקות אפס הודגר על הקרח לכל אורך הניסוי. לאחר דגירה, דגימות היו ultracentrifuged ב XG 125,000 למשך 20 דקות ב 4 ° C. Supernatant וכדוריות הופרדו ונותחו על ידי ELISA p24. היקף uncoating נקבע כמתואר בטקסט פרוטוקול. התגובה של כל uncoating בוצעה לשכפל, ברים שגיאה תוחלת בטווח של שני ערכים.

Discussion

השיטה המתוארת כאן כדי לטהר HIV-1 ליבות ללמוד uncoating במבחנה שימושי ללמוד את השלב הזה של מחזור HIV-1 החיים, בעיקר בשל חוסר זמינות של שיטה לנתח תוקף HIV-1 uncoating בתאי המטרה. אמנם שיטה זו משתמשת ultracentrifugation שיווי משקל לטהר ליבות, אחרים השתמשו pelleting ישיר לאחר תמוגה קצרה עם 1% טריטון ^X-...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוג	הערות (אופציונלי)
DMEM	Cellgro	10-013-CV
PBS	Cellgro	21-031-CV
Triton-X-100	Mallinckrodt בייקר Inc	9002-93-1
Tween 20	Acros	9005-64-5
0.25% טריפסין-EDTA	Cellgro	25-053-CI
2XBBS			הרכב: 50mm BES [p H 6.95], 280 mM NaCl ו - 1.5 mM Na 2 HPO 4. התאם את ה-pH 6.95בטמפרטורת החדר. סנן לעקר & חנות aliquots ב -20 ° C.
נוגדן ציפוי: נוגדן חד שבטי כדי p24 (183-H12-5C)	NIH האיידס מחקר תוכנית הפניה מגיב	3537
הנוגדן העיקרי: HIV-איג (המטופל hyperimmune בסרום אדם)	NIH מחקר האיידס ו מגיב הפניה תוכנית	3957
משני הנוגדנים: אנטי אנושי עיזים IgG, peroxidase מצומדות	לנקב	31130
HRP המצע	KPL Inc	50-76-11
Immulon 2HB 96 צלחות טוב	Thermo Scientific	3455
SW32Ti ו SW32.1 הרוטורים טי ו ultracentrifuge תואם	Beckman Coulter
TLA-55 הרוטור ultracentrifuge השולחן	Beckman Coulter
מהירות גבוהה microfuge צינורות	Beckman Coulter	326823, 358123, 357448
Auto-Densi צפיפות זרם שיפוע fractionator	Labconco קורפ	4517000
צבע לשעבר	הלשכה המרכזית לסטטיסטיקה מדעי ושות בע"מ	GM-20