JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

Abstract

בקעת חום וירוס (RVFV), מה שגורם קדחת מדממת, הפרעות נוירולוגיות או לעיוורון אצל בני אדם, שיעור ההפלות גבוה למום עוברי מעלי גירה 1, סווגה HHS / USDA חפיפה סוכן לבחור קבוצת סיכון 3 הפתוגן. היא שייכת Phlebovirus הסוג של Bunyaviridae המשפחה הוא אחד מחברי ארסית ביותר של משפחה זו. מספר מערכות גנטיקה הפוכה עבור זן MP-12 חיסון RVFV 2,3 וכן wild-type זנים RVFV 4-6, כולל ZH548 ו ZH501, פותחו מאז 2006. המתח-12 מגה פיקסל (שהיא קבוצת סיכון 2 הפתוגן ואת סוכן לא לבחור) הוא נחלש מאוד על ידי מוטציות במספר שלה-M ו-L-מגזרים, אך עדיין נושאת ארסית S-RNA קטע 3, אשר מקודד ארסיות תפקודית , גורם NSS. RMP12-C13type (C13type) נושאת 69% ב-מסגרת מחיקה של NSS ORF חסר כל הפונקציות NSS ידוע, ואילו זה משכפל effic כמוient כפי שעושה MP-12 VeroE6 תאים חסר סוג אני IFN. NSS משרה כיבוי שעתוק של המארח כולל אינטרפרון (IFN)-beta-mRNA 7,8 ומקדם השפלה של קינאז RNA תלויי פעמיים תקועים חלבון (PKR) ברמה שלאחר translational. 9,10 IFN-beta הוא transcriptionally שהוגברו על ידי גורם אינטרפרון רגולטוריות 3 (IRF-3), NF-kB ו activator חלבון-1 (AP-1), ואת הקישור של IFN-ביתא IFN-alpha/beta קולטן (IFNAR) מגרה את שעתוק של IFN-alpha גנים או גנים אינטרפרון גירה אחרים (ISGs) 11, אשר גורם לפעילות אנטי המארח, ואילו תעתיק מארח כולל דיכוי גנים IFN-ביתא על ידי NSS מונע upregulations הגן של ISGs אלה בתגובה שכפול נגיפי למרות IRF-3, NF-kB ו activator חלבון-1 (AP-1) יכול להיות מופעל על ידי RVFV7. . לפיכך, NSS היא יעד מצוין נוסף להחליש MP-12, כדי לשפר את התגובה החיסונית המולדת מארח ידי ביטול פונקציית IFN-beta דיכוי. כאןאנו מתארים פרוטוקול להפקת רקומביננטי MP-12-NSS קידוד מוטציה, ולספק דוגמה של שיטת ההקרנה לזהות מוטציות NSS חסרה הפונקציה לדכא IFN-beta סינתזת mRNA. בנוסף תפקיד חיוני שלה חסינות מולדת, סוג אני IFN חשוב ההבשלה של תאים דנדריטים ואת אינדוקציה של תגובה חיסונית אדפטיבית 12-14. לפיכך, NSS גרימת מוטציות מסוג אני IFN הם נחלש עוד יותר, אבל באותו זמן הם יעילים יותר בתגובות המערכת החיסונית מארח מגרה מאשר wild-type MP-12, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים עבור גישות החיסון.

Protocol

1. שחזור של רקומביננטי מוטציה-12 MP קידוד NSS (ים) DNAs פלסמיד 2

  1. התינוק מורחים אוגר כליה (BHK) / T7-9 תאים 15, אשר ביציבות להביע T7-RNA פולימראז, תוך 6 ס"מ כלים בינוני Essential Minimum (ממ) אלפא (Invitrogen, חתול # 32561037) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS ), פניצילין, סטרפטומיצין (פניצילין: 100 U / ml, סטרפטומיצין: 100 מיקרוגרם / מ"ל) (Invitrogen, חתול # 15140122), ו 600 מיקרוגרם / מ"ל ​​של hygromycin B (Cellgro, חתול # 30-240-CR).
    * היעילות של התאוששות ויראלי גבוה ב -6 ס"מ מנות מאשר 35 מ"מ הכלים. BHK/T7-9 תאים עם רמה נמוכה מעבר לתמיכה שיעור גבוה יותר של התאוששות. לחלופין, שורות תאים אחרים BHK כי פולימראז ביציבות להביע T7-RNA יכול לשמש 4,5,16,17.
  2. כאשר תאים הגיעו 70-80% confluency, להחליף את supernatant תרבות עם טרי ממ אלפא המכיל 10% FBS ו פניצילין-סטרפטומיצין (לא המכיל hygromycin B).

    תאים * יש transfecteד תוך שעה 1 לאחר החלפת בינוני, כדי למנוע אובדן של ביטוי RNA פולימראז T7.
  3. עבור התאוששות של RVFV, קבוצה של פלסמידים קידוד RNAs גנומית ויראלי לביטוי באורך מלא נגיפי RNA, ו - סט שני קידוד גנטי נגיפי לפתוח מסגרות קריאה לביטוי חלבונים נגיפיים (איורים 1 ו -2) נדרשים. הכינו תערובת של plasmids2 הבאה (איור 2) בצינור 1.5 מ"ל:
    1. pProT7-S (+) עם מוטציה (ים) בגן NSS (2 מ"ג): פלסמיד זה מקודד את אנטי ויראלית, תחושה (במובן חיובי) באורך מלא RVFV MP-12-S קטע מוקף האמרגן T7 ו הדלתא של וירוס הצהבת מסוג (HDV) ribozyme רצף.
    2. pProT7-M (+) (2 מ"ג): זהו פלסמיד המקודד את אנטי ויראלית, תחושה (במובן חיובי) באורך מלא RVFV MP-12 M-קטע מוקף האמרגן T7 ואת רצף ribozyme HDV.
    3. pProT7-L (+) (2 מ"ג): פלסמיד זה מקודד אנטי ויראלית, תחושה (במובן חיובי) באורך מלא RVFV MP-12-L-קטע flanked על ידי האמרגן T7 ואת רצף ribozyme HDV.
    4. pT7-IRES-VN (2 מ"ג): פלסמיד זה מקודד ה-MP-12 RVFV N לפתוח מסגרת הקריאה (ORF) במורד הזרם של האמרגן T7 לבין וירוס encephalomyocarditis (EMCV) ערך פנימי באתר הריבוזום (IRES).
    5. pT7-IRES-VL (1 מ"ג): פלסמיד זה מקודד את RVFV MP-12 L ORF במורד הזרם של האמרגן T7 ו IRES EMCV.
    6. pCAGGS-VG (1 מ"ג): פלסמיד זה מקודד RVFV MP-12 מ 'במורד הזרם ORF של האמרגן עוף ביתא אקטין.
      * תוספת של pT7-VN-IRES, pT7-IRES-VL ו-VG pCAGGS אינו חיוני עבור התאוששות של MP-12, אבל זה משפר את היעילות של הצלה 2. מחברים מנוסים הביטוי הירודה של Gn / GC באמצעות pT7-IRES פלסמיד, ככל הנראה בשל חוסר סריקה של דולף AUGs על ידי הריבוזומים. לכן, אנו נבנה pCAGGS-VG לביטוי Gn / GC כובע תלויי.

  4. הוסף 30 מ"ל של Transit-LT1 (Mirus, חתול # MIR2300) ל 385 מ"ל של Opti-ממ (Invitrogen, חתול # 31985070) בצינור 1.5 מ"ל, ובקצרה מערבולת.
  5. לאחר דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, לאט להוסיף את Opti-ממ המכילה ליפוזומים לתערובת פלסמיד משלב 1.3 ל, לערבב בעדינות על ידי pipetting ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. מוסיפים את תערובת של liposome ו פלסמידים עד בינוני התרבות של תאים BHK/T7-9 מירידה צעד 1.2 ידי ירידה (איור 3).
  7. דגירה התאים transfected ב 37 מעלות באינקובטור עם 5% CO 2 למשך 24 שעות, ולהחליף את supernatant תרבות עם טרי ממ אלפא המכיל 10% FBS ו פניצילין-סטרפטומיצין (לא המכיל hygromycin B).
  8. דגירה התאים ב 37 מעלות באינקובטור עם 5% CO 2 למשך 4 ימים נוספים (דגירה במשך 5 ימים בסך הכל), לאסוף את supernatants תרבות לשפופרת 15 מ"ל.

    * השפעת cytopathic (CPE) צפו כאן אינו משקף בהכרח תוצאה של התאוששות ויראלי מוצלח, כי transfectionגורם מוות של תאים המופיע דומה CPE הנגרמת על ידי שכפול נגיפי RNA או סינתזת חלבון נגיפי.
  9. צנטריפוגה supernatants XG ב 2200 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

    * מטרת צעד זה היא גלולה מטה פסולת הסלולר ממלאי ויראלי. דלי אירוסול צמודים צנטריפוגות מומלץ בטיחות מוגברת.
  10. מעבירים את supernatants לתוך הברגה כובע cryotubes 5 מ"ל, ולאחסן את המעבר 0 (P0) מניות וירוס ב -80 ° C לשימוש נוסף.

2. הגברה של הנגיף P0

  1. P0 דגימות בדרך כלל מכילות כייל הנגיף מספיק ניסויים הזרם 2. צעד הגברה ב VeroE6 תאים, שהוא שיבוט של קוף אפריקני ירוק כליה (Vero) תאים חסרי הגנים IFN-alpha/beta 18,19, מגביר כייל הנגיף עד לרמה מקסימלית. לחילופין, תאים אחרים מסוג חסר לי IFN תגובות כגון תאים Hec1B 20 או תאים MEF מ IFNAR1-נוקאאוט בעכברים 21 mighלא לשמש בשלב זה. מורחים VeroE6 תאים לתוך 10 ס"מ מנות במדיום שונה של Dulbecco חיוני מינימום (DMEM) (Invitrogen, חתול # 11965092) המכיל 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (פניצילין: 100 U / ml, סטרפטומיצין: 100 מ"ג / מ"ל), ו דגירה בשעה 37 ° C באינקובטור עם 5% CO 2 עד שהם מגיעים 80% confluency.
    * רקומביננטי MP-12 זנים קידוד NSS מוטציה לעתים קרובות אינם מצליחים לשכפל ביעילות סוג אני IFN-המוסמכת תאים.
  2. מערבבים 300 מ"ל של P0 דגימות עם 2.7 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו פניצילין-סטרפטומיצין. הסר בינוני תרבות מן VeroE6 תאים 2.1 צעד ולהחליף המדגם P0 בדילול מלא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באינקובטור עם 5% CO 2.
  3. הסר את inocula ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו פניצילין, סטרפטומיצין על כל מנה.
  4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 עד 4 ימים עד CPE של VeroE6 תאים מתברר.
    * הפרעה monolayer מתרחשת במהלך זיהום-12 מגה פיקסל, whilדואר רקומביננטי MP-12-NSS חסר, כגון rMP12-C13type (C13type) (איור 4), לא לשבש את monolayer, אבל מספר התאים המתים צפים מופיעים 2 עד 3 ימים לאחר ההדבקה.
  5. קציר supernatant ב 3-4 dpi, כמתואר בסעיפים 1.9) ו - 1.10), וכן לייעד את דגימות כמו E6P1.

3. טיטרציה של רקומביננטי MP-12 על ידי assay פלאק

  1. מורחים VeroE6 תאים לתוך 6-גם הצלחות.
    * ניתוח שכפל לפי המדגם אמין יותר מאשר ניתוח יחיד.
  2. כאשר תאים VeroE6 גדלו 80% confluency, להכין פי 10 דילולים הסידורי של דגימות הווירוס DMEM עם 10% FBS ו פניצילין, סטרפטומיצין עד 10-6 כדלקמן:
    • 10 μl של המדגם E6P1 + 990 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו פניצילין, סטרפטומיצין (10 -2 דילול)
    • 100 μl של המדגם -2 10 + 900 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו פניצילין, סטרפטומיצין (10 דילול -3)
    • 100μl של המדגם 10 -3 + 900 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו פניצילין, סטרפטומיצין (10 דילול -4)
    • 100 μl של המדגם 10 -4 + 900 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו פניצילין, סטרפטומיצין (05/10 דילול)
  3. לשאוב בינוני מהצלחת 6-הבאר משלב 3.1 ולהוסיף 400 μl של דילול כל (משלב 3.2) לתוך הבארות (איור 3).
  4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באינקובטור עם 5% CO 2.
  5. במהלך הדגירה, להכין שתי מבחנות 15 מ"ל עבור כיסוי-agar כדלקמן:
    Tube (לשמור על 42 ° C אמבט מים): 7 מ"ל של אגר אצילי 1.2% (VWR, חתול # 101170-362) במים
    Tube B (לשמור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים): 7 מ"ל של נשר השתנה בינוני (ממ 2x) (Invitrogen, חתול # 11935046) המכיל 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (פניצילין: 100 U / ml, סטרפטומיצין: 100 מיקרוגרם / מ"ל), ו -10% Tryptose פוספט מרק (biomedicals מגה פיקסל, חתול # 1682149).
  6. לאחר דגירה h 1, להסיר את נגיפיinocula, ומיד להוסיף 2 מ"ל לכל טוב של תערובת 01:01 של הצינור צינור B (משלב 3.5).
    * תשמרי על עצמך כדי להוסיף את שכבת מיד מתייבש בארות גורם למוות של תאים נגוע.
  7. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים באינקובטור עם 5% CO 2.
  8. הכן צינורית A ו-B הצינור שוב כמתואר בשלב 3.5. הכן גם 500 μl של הפתרון 0.33% אדום נייטרלי (סיגמא אולדריץ', חתול # N2889-100 מ"ל) לכל צלחת אשר נשמר גם ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  9. מערבבים צינור, צינור B ו 500 מ"ל (קונצרט כלשהו הסופי. 0.011%) של תמיסת אדום נייטרלי להוסיף 2 מ"ל של תערובת לכל טוב.
    * כמות פתרון אדום נייטרלי שיתווספו משתנה לפי הרבה של פתרון אדום נייטרלי, ואופטימיזציה הראשונית נדרשת. אחסון לטווח ארוך של פתרון 0.33% אדום ניטרלי גורם משקעים. במקרים כאלה, ניתן לזרז נמס לגמרי על ידי הדגירה 55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחריה רועד נמרצת. השימוש r נייטרלי זירזעורך תוצאות פתרון מכתים חלש של תאים, בעוד מחדש מומס כתמים אדומים נייטרלי פתרון התאים היטב.
  10. דגירה את הצלחת למשך 16 שעות (או לילה) בשעה 37 ° C באינקובטור עם 5% CO 2.
  11. ספירת הפלאק היטב את אשר מכיל 10-100 הפלאק לכל טוב. לחשב את מספר לוחית הקמת יחידות / מ"ל. לדוגמה, אם אנו צופים 28 הפלאק בארות מחוסן עם 10 דילולים -5, 28 (# של הפלאק) x (1 ml/0.4 מ"ל) x 10 5 (דילול) = 7.0 x 10 6 יחידות פלאק ויוצרים (pfu) / מ"ל (איורים 5).

4. הקרנת מוטנטים NSS חסר את הפונקציה מסוג אני IFN דיכוי

  1. מורחים C57/WT MEF תאים (InvivoGen, חתול # MEF-c57wt), אשר לקודד עובריים המופרשים phosphatase אלקליין (SEAP) ועין מתנהלת הגן על ידי NF-kB ו-IRF 07/03 (איור 6), תוך 12 גם הצלחות. התאים נשמרות DMEM עם 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (Penicillin: 100 U / ml, סטרפטומיצין: 100 מיקרוגרם / מ"ל), Blasticidin S (3 מ"ג / מ"ל), ו Zeocin (100 מיקרוגרם / מ"ל).
  2. כאשר תאים הופכים משנה ומחוברות (80%), תאים נגועים או מעושה נגוע MP-12 או MP-12 רקומביננטי NSS קידוד מוטציות ריבוי של זיהום (moi) של 3 או 0.1 (ראו סעיפים 2 ו 3, כמות inoculum כל צריך להיות 300 μl). בשלב זיהום h 1 הודעה, להסיר את inocula, ולהוסיף 1 מ"ל לכל היטב DMEM עם 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (פניצילין: 100 U / ml, סטרפטומיצין: 100 מיקרוגרם / מ"ל) (Blasticidin ו Zeocin לא מתווספים על זה זמן).
  3. ב 14 שעות שלאחר זיהום, לאסוף supernatants תרבות. הוסף 200 μl של QUANTI כחול (InvivoGen, חתול # נציג-qb1) וכן 50 μl של כל דגימה (בשלושה עותקים) בבארות של צלחת 96-היטב. חותם דגירה את הצלחת ב 37 ° C עבור 1 ח
    * שתי MP-12 ו רקומביננטי MP-12-NSS חסר בבירור לגרום לדיכוי מארח translational בתאים IFN-alpha/beta המוסמכות כולל 293 תאים, MRC-5 תאים העכבר embryonic (MEF) תאים פיברובלסטים 14 שעות לאחר ההדבקה הודעה בשיא moi. מצד שני, IFN-beta-mRNA או ISG56 mRNA מצטבר בשפע ב 7 עד 8 שעות שלאחר זיהום מסוג IFN-I לתאי המוסמכות. לפיכך, בחרנו 14 השעות שלאחר הזיהום לאסוף את supernatants לראות את הצטברות SEAP המושרה על ידי המערכת החיסונית הטבעית.
  4. קרא את ערכי OD ב 650 ננומטר באמצעות קורא צלחת (איור 7).
    * התוצאות עולות בקנה אחד עם הנתונים המתקבלים על ידי כתם הצפון באמצעות בדיקה רנ"א ספציפיים mRNA עכבר ISG56, אשר מציג את ויסות של mRNA ISG56 בהעדר ביטוי NSS (איור 8).
    * יצוין כי פעילות SEAP נקבעת על ידי שפע של חלבונים, אשר עשויים להיות מושפעים על ידי פעילות התרגום המארח. הרמה היחסית של SEAP לא יכול להיות גבוה בהשוואה לרמה מוגברת של mRNA SEAP כי לא יכול להיות מסונתז אפילו בנוכחות של mRNA SEAP אם התרגום הסלולר הוא suppressed. צפון כתם הוא assay פשוטה יותר דרך מדויקת יותר על מנת להעריך את כמות ה-mRNA הנגרמת על ידי חוסר של פונקציות NSS בתאים נגועים מ assay הכתב SEAP. עם זאת, מערכת הכתב SEAP היא מהירה יותר מאשר כתם הצפון שימושי ומכאן לסינון מהיר של מוטציות NSS פוטנציאל חסר שעתוק לארח פונקציה דיכוי.

5. נציג תוצאות:

מערכת גנטיקה הפוכה שנוצר באופן עקבי קיימא רקומביננטי MP-12 עם וירוסים titers גבוהה יותר מאשר 1 x 10 6 pfu / ml. וירוס C13type חסר פונקציות NSS נוצר פלאק עכור גדול, בעוד MP-12 נוצר הפלאק ברור בגדלים שונים 2 (איור 5). מוק תאים הנגועים C57/WT MEF או אלה נגועים עם MP-12 לא להעלות את רמת SEAP ב supernatant תרבות לעומת מדומה תאים הנגועים, בעוד supernatant התרבות של תאים C57/WT MEF נגוע C13type הכלול מוגבררמת SEAP ידי זיהום 14 שעות שלאחר (HPI) (איור 7). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם אלה שהושגו על ידי כתם הצפון באמצעות בדיקה רנ"א ספציפיים mRNA עכבר ISG56 (איור 8).

figure-protocol-13410
1. תרשים מבנה הגנום של RVFV
RVFV יש תחושה שלילית משולשת או ambisense RNA בגנום בשם-S, M-, ו-L-קטע. S-קטע המקודד בגנים N ו-NSS בצורה ambisense. N-mRNA מסונתז מתחושת ויראלית (במובן שלילי) S-במגזר, בעוד ה-mRNA NSS הוא מסונתז מתחושת-אנטי ויראלית (במובן חיובי) S-קטע. M-קטע מקודד M-mRNA יחיד מסנתז the78kD, NSm, Gn או חלבונים GC על ידי סריקה של דולף AUGs בבת 5'region של M-mRNA, ואחריו המחשוף שלהן שיתוף translational 22,23. L-קטע המקודד את החלבון L. שני חלבונים N ו-L חיוניים שעתוק שכפול נגיפי, תוך Gn ו-GC הם חלבונים נגיפיים המעטפה. NSS וחלבונים NSm הם חלבונים nonstructural, אשר אינם משולבים חלקיקי הנגיף.

figure-protocol-14189
באיור 2.. העיצוב של ה-DNA פלסמיד להתאוששות של זן רקומביננטי MP-12 RVFV
קידוד cDNA באורך מלא אנטי ויראלית, תחושה-S, M-, או L-קטע הם cloneddownstream של האמרגן T7 לבין הזרם של וירוס הפטיטיס דלתא (HDV) רצפים ribozyme, כאזור pProT7-S (+), pProT7-M (+), או pProT7-L (+), בהתאמה 2. T7 RNA פולימראז לידי ביטוי BHK/T7-9 תאים מעתיק את הקידוד RNA באורך מלא S-, M-, או L-קטע עם סיום מדויק הגנום "3. מסגרת קריאה פתוחה (ORF) של N או חלבונים L הם משובטים תחת encephalomyocarditis וירוס (EMCV) כניסה פנימית באתר הריבוזום (IRES), אשר מיועדות כ pT7-IRES-VN או pT7-IRES-VL, בהתאמה, כדי לאפשר את הסיר את המיכסה תמליל T7-RNA להיות מוכר על ידי הריבוזומים בכובע, באופן עצמאישקע בדרך. ORF M היא משובטים תחת האמרגן עוף ב-אקטין של pCAGGS פלסמיד 24, אשר יועד pCAGGS-VG, כדי לאפשר את הסינתזה של 78kD, NSm, Gn וחלבונים GC, אשר מופק על ידי סריקת AUGs שונים דולפים 23. שני N ו L חלבונים נדרשים ליזום שעתוק או שכפול רנ"א, בעוד pT7-IRES-VN pT7 ו-IRES-VL לא חיוני עבור התאוששות של רקומביננטי MP-12 2, ככל הנראה בשל הביטוי דולפים presumable של Pol- השנייה מונחה כתרים תעתיקי רנ"א קידוד N-ORF ו-L-ORF pProT7 מ-S (+) ו pProT7-L (+), בהתאמה.

figure-protocol-15498
באיור 3. השחזור של RVFV MP-12 מ-DNA פלסמיד
Transfection של BHK/T7-9 תאים עם pProT7-S (+), pProT7-M (+), pProT7-L (+), pT7-VN-IRES, pT7-IRES-VL ו-VG pCAGGS פלסמידים (תמונה 1 ) מייצר זיהומיות רקומביננטי RVFV MP-12 מתח supernatant תרבותs. Supernatant ב transfection 5 שלאחר יום נאסף ו passaged טרי לתוך התאים E6 Vero עבור הגברה ויראלי. בדרך כלל, יותר מ 1 x 10 6 pfu / מ"ל של הנגיף ניתן לשחזר על זיהום ימים 3-4 פוסט. הווירוס מוגבר (E6P1 וירוס) היא טיטרציה באמצעות assay פלאק עם Vero E6 תאים המשמשים לניתוח פנוטיפ ומחקרים immunogenicity.

figure-protocol-16202
איור 4. S-קטע של MP-12 ו-rMP12 C13type
השוואת MP-12 ו-rMP12 C13type (C13type) S-מגזרים. בהשוואה ל-NSS-12 של זן MP, ORF NSS של C13type נחתך על ידי 69%, והוא זהה לזה של זן מבודד טבעי 13 שיבוט 2,25.

figure-protocol-16569
איור 5. Assay רובד של MP-12 (NSS תפקודית) ו C13type (שאינם פונקציונליים NSS)
Monolayer של Vero E6 תאים בצלחת 6-באר משמש assay פלאק. אחרי 3 ימים דגירה עם כיסוי אגר 0.6%, כיסוי אגר נוספת שהכילה פתרון אדום ניטרלי הוא הוסיף. ואז, הפלאק נספרים על זיהום 4 יום פוסט. MP-12 צורות הפלאק ברור בגדלים שונים, בעוד C13type צורות פלאק עכור גדול (או מוקדים). גם עם 10-100 הפלאק יש להשתמש לספור.

figure-protocol-17109
איור 6. מסלול הפעלת מופרש אלקליין phosphatase (SEAP) הגן כתב בתאים C57/WT MEF
אינטרפרון בטא האמרגן כולל את רצפי הקישור של AP-1, NF-kB ו IRF-3. שכפול RVFV מפעיל AP-1, NF-kB ו-IRF 3 7,11. עם זאת, NSS לעכב את שחרורו של מורכבות repressor מן האמרגן IFN-beta גם לאחר הכריכה של אותם גורמי שעתוק, ובכך לדכא את הסינתזה של ה-mRNA IFN-beta 26. יתר על כן, NSS sequesters TFIIH p44 subunits8 והסימפונית מקדמת השפלה TFIIH של p62 27 יחידות משנה, ובכך גרימת דיכוי כללי תעתיק מארח כולל גן IFN-alpha ו גנים תחת האמרגן ISRE. מוטנטים NSS C13type או אחר שחסר IFN-beta פונקציה דיכוי לגרום IFN-beta סינתזה, אשר בתורו מפעיל את האמרגן IFN-alpha ו אינטרפרון רגיש אלמנט תגובה (ISRE) מקדם. IRF-7 הוא אז שהוגברו transcriptionally ידי גירוי IFN-alpha/beta ו שהוגברו עוד יותר על ידי IFN-alpha תמיכה של IRF-3 28,29. ב assay הזה, C57/WT תאים MEF לקודד phosphatase אלקליין מופרש (SEAP) בשעה במורד הזרם של רצף מחייב מלאכותית של NF-kB, IRF-3 ו-IRF 7. לפיכך, מוטנטים NSS חסר IFN-beta פונקציה דיכוי הפרשת upregulate SEAP אשר נמדד אז.

figure-protocol-18309
איור 7. אינדוקציה של SEAP ידי C13type
C57/WT תאים MEF (InvivoGen) היו לועגיםנגועים או נגוע MP-12 או rMP12-C13type (C13type) בשעה moi של 3 (פאנל משמאל) או 0.01 (פאנל מימין). Supernatants תרבות (50 μl) בשעה 14 HPI היו מעורבים עם 200 μl של QUANTI כחול (InvivoGen) המצע בצלחת 96 היטב את ערכי OD ב 650 ננומטר נמדדו לאחר דגירה h 1 ב 37 ° C על ידי הקורא צלחת. עליות היחסי של SEAP ללעוג תאים הנגועים מוצגים. הנתונים מייצגים את ממוצע + / - סטיית התקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים. Supernatant תרבות מן C13type תאים הנגועים מראה SEAP גדל, דבר המצביע על חוסר דיכוי שעתוק מארח ידי NSS.

figure-protocol-19043
איור 8. כתם הצפון עם DIG-RNA שכותרתו בדיקה
Wild-type עובריים בעכבר פיברובלסטים (MEF) היו תאים נגועים או מדומה נגוע MP-12 או rMP12-C13type (C13type) בשעה moi של 3. RNA סה"כ נאסף HPI 7 באמצעות Trizol (Invitrogen), ובצפון בהרבה בוצעה באמצעות digoxigenin שכותרתו בדיקה רנ"א ספציפיים mRNA עכבר אנדוגני ISG56 או MP-12-mRNA N / אנטי ויראלית תחושת S-קטע 2,30. לביצוע בדיקות של ה-mRNA עכבר אנדוגני ISG56 או RVFV N-mRNA / אנטי ויראלית תחושת S-פלח, שברי PCR מוגבר על ידי פריימר קבוצת KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG החטיבה) ו HindmISG56 (TAC AAA GCT תאת GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA ג"ג) עבור ה-mRNA ISG56 או KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA TCA CTA AGA GCT TGC G) HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT AAG TGT) עבור RVFV mRNA N / אנטי ויראלית תחושת S-פלח היו מתעכל עם KPN אני ו-III הינד, ו ligated pSPT18 לתוך פלסמיד (Roche. ואז בדיקות RNA שכותרתו עם digoxigenin היו מסונתז באמצעות DIG-RNA תיוג Kit (SP6/T7) (רוש, Cat # 1 175 025). הרמה rRNA -28 המדגם כל מוצג גם העמסה מלאה. Wild-MEF סוג תאים נגועים סינתזה C13type ISG56 mRNA המושרה, בעוד אלה נגועים עם MP-12 לא לעורר אותו, דבר המצביע על חוסר דיכוי מארח השעתוק C13type תאים הנגועים. מהנתונים עולה בקנה אחד עם אלה שהושגו על ידי assay SEAP באיור 6.

Discussion

הפוך גנטיקה מערכות RVFV פותחו על ידי מספר קבוצות על ידי ניצול האמרגן T7 2,4,5 או עכבר 3 או 4 pol האדם, אני מקדם. בכתב היד הזה, אנו מתארים פרוטוקול ליצור רקומביננטי MP-12 RVFV זנים באמצעות BHK/T7-9 תאים 15 כי פולימראז ביציבות להביע T7-RNA. את היעילות של התאוששות ויראל...

Disclosures

אין לנו שום דבר לגלות.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מספר גרנט 5 U54 AI057156-07 באמצעות המרכז האזורי המערבי של אקסלנס (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 מ - המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, וכן מימון פנימית מהמרכז Sealy לפיתוח חיסון באוניברסיטת סניף טקסס רפואי.

Materials

שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
בינוני Essential Minimum (ממ) אלפא Invitrogen 32561037
Dulbecco של מדיום שונה חיוני מינימום Invitrogen 11965092
השתנה הנשר בינוני (ממ 2x) Invitrogen 11935046
פניצילין, סטרפטומיצין Invitrogen 15140122
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR
Tryptose פוספט מרק MP biomedicals 1682149
נובל אגר VWR 101170-362
Transit-LT1 Mirus MIR2300
Opti-ממ Invitrogen 31985070
מכסה הדוק תרסיס Eppendorf C-2223-25
0.33% פתרון אדום נייטרלי סיגמא אולדריץ' N2889-100 מ"ל
C57/WT MEF תאים InvivoGen MEF-c57wt
Blasticidin S InvivoGen Ant-BL-1
Zeocin InvivoGen נמלים Zn-1
QUANTI-Blue InvivoGen נציג-qb1
BHK/T7-9 תאים 15 גיפא באוניברסיטה, יפן
Vero E6 תאים ATCC CRL-1586

References

  1. Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
  2. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  3. Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
  4. Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
  5. Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
  6. Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
  7. May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  8. Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
  9. Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
  10. Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
  11. Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
  12. Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
  13. Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
  14. Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
  15. Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
  16. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  17. Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
  18. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
  19. Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
  20. Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
  21. Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
  22. Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
  23. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  24. Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
  25. Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
  26. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  27. Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
  28. Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
  29. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
  30. Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
  31. Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
  32. Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

57NSSMP 12

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved