הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Summary

היקף חנות המופעל Ca ^{2 +} כניסה (SOCE) ניתן לנטר באמצעות ניאון Ca ^{2 +} אינדיקטורים. Mn ^{2 +} מרווה של SOCE מבחני אינדיקטורים כגון בתאים בתרבית לבין סיבי שריר השלד. הטכניקה מאפשרת רזולוציה במרחב ובזמן של SOCE ידי הדמיה confocal של סיבי שריר פשוטי עור מכני מתואר גם.

Abstract

החנות פעלה Ca ^{2 +} כניסה (SOCE), כינה מוקדם יותר קיבוליים Ca ^{2 +} כניסה, הוא מנגנון פיקוח הדוק על זרם של Ca ^{2 +} תאי אל תוך התאים לחדש reticulum endoplasmic מדולדל (ER) או reticulum sarcoplasmic (SR) ע"א ^{+ 2} חנויות ^1,2. מאז Ca ^{2 +} 2 הוא שליח בכל מקום, אין זה מפתיע לראות כי SOCE משחק תפקידים חשובים במגוון רחב של תהליכים תאיים, לרבות הפצת שעתוק הגן אפופטוזיס, ואת תנועתיות. בשל התרחשות רחב כמעט בכל סוגי תאים, כולל תאים אפיתל ועל שרירי השלד, מסלול זה זכה עניין רב ^3,4. עם זאת, ההטרוגניות של מאפיינים SOCE של סוגי תאים שונים הפונקציה הפיזיולוגית עדיין לא ברור ^5-7.

המאפיינים ערוץ תפקודיות של SOCE יכול להתגלות על ידי תיקון, מהדק מחקרים, בעוד גוף גדול של ידע על תימסלול זה כבר שנרכשו על ידי הקרינה מבוססי תאיים ע"א ^{2 +} מדידות בגלל הנוחות שלה היתכנות לסינון תפוקה גבוהה. מטרת דו"ח זה היא לסכם כמה הקרינה המבוססים על שיטות למדוד את הפעלת SOCE בתאים monolayer, תאים על תנאי סיבי שריר ^5,8-10. הנפוץ ביותר של שיטות אלו הקרינה היא ישירות לעקוב אחר הדינמיקה של Ca ^{2 +} תאיים באמצעות היחס בין F _340nm ו _380nm פריץ (510 ננומטר עבור אורך גל הפליטה) של Ca ^{2 +} ratiometric מדד פורעה-2. כדי לבודד את הפעילות של SOCE חד כיווני בין תאיים Ca ^{2 +} שחרור Ca ^{2 +} שחול, Mn ^{2 +} assay מרווה נעשה שימוש תכוף. Mn ^{2 +} ידוע להיות מסוגל לחדור לתוך התאים באמצעות SOCE כאשר הוא אטום על פני הממברנה תהליכים שחול או ספיגת ER ידי Ca ^{2 +} משאבות בשל השנינות שלה זיקה גבוהה מאודH-2 פורעה. כתוצאה מכך, מרווה של הקרינה-2 פורעה הנגרם על ידי כניסת תאי Mn ^{2 +} לתוך התאים מהווה מדידה של פעילות SOCE ^9. מדידת Ratiometric ואת ⁺² מבחני MN מרווה יכול להתבצע על spectrofluorometer קובט מבוסס במצב האוכלוסייה תא או מערכת המיקרוסקופ מבוסס לדמיין תאים בודדים. היתרון של מדידות תא בודד הוא כי תאים בודדים נתון מניפולציות גנטיות ניתן לבחור בעזרת ה-GFP או כתבים RFP, המאפשר לימודי תאים מהונדסים גנטית או מוטציה. המאפיינים של spatiotemporal SOCE בשריר השלד מתמחה מבנית ניתן להשיג סיבי שריר עור בו זמנית על ידי ניטור הקרינה של 2 נמוך זיקה Ca ^{2 +} אינדיקטורים ממוקדות תאים ספציפיים של סיבי השריר, כגון Fluo-5N ב SR ו Rhod למוצרי 5N ב tubules רוחבי ^9,11,12.

Protocol

1. תאיים Ca ^{2 +} מדידה עבור תאים בודדים

1. KYSE-150, אדם בתא קשקש קרצינומה של הוושט (ECSS) שורת תאים בתרבית באווירה 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס מעורבת בינונית RPMI 1640/Ham של F-12 (1:1) המכילה 5% בסרום שור עוברית.
2. KYSE-150 תאים transfected עם פלסמידים את אחד המכיל shRNA במיוחד נגד Orai1 או רצף מקושקשת. פלסמידים כלל גם קידוד גנטי חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) ככתב, אשר מונע על ידי האמרגן נפרד.
3. התאים גדלים זכוכית התחתונה מנות (1.5 לא מכסה זכוכית, MatTek, MA) למשך 48 שעות.
4. הסר בינוני לשטוף את התאים בתמיסת מלח מאוזנת (BSS) (140 mM NaCl, KCl 2.8 מ"מ, 2 מ"מ CaCl _2, 2 מ"מ MgCl _2, 10 HEPES מ"מ, ה-pH 7.2).
5. הוסף 1 מ"ל פתרון BSS המכיל 2 מיקרומטר פורעה-2 אסתר acetoxymethyl (בדיקות מולקולריות) לתוך צלחת ולעטוף את המנה כולה בנייר כסף כדי proteCT מן האור.
6. דגירה התאים דקות 40 על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשאיר אותם לתקופה נוספת 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הידרוליזה אסתר להסתיים. שוטפים את התאים עם BSS פעמיים.
7. הר את המנה על הבמה של מיקרוסקופ TE200 Nikon הפוכה, אשר מחובר PTI spectrofluorometer, עם אורכי גל עירור ב 350 ו 390 ננומטר ופליטות ב 510 ננומטר. אורכי הגל עירור המדויקים כדי לשמש יכול מעט להשתנות בהתאם האופטיקה של מערכת בנפרד. שני אורכי הגל עם היחס הטוב ביותר דינאמי נקבעים על ידי ספקטרום עירור סריקה של מלח פורעה-2 בפתרונות המכילים Ca ^{2 +} בטווח שבין 0 ל 39.8 מיקרומטר (או ריכוז גבוה יותר שבו פורעה-2 הקרינה רווי).
8. להקים מערכת זלוף הכבידה עם 4 פתרונות שונים BSS: CA ^{2 +} (2 מ"מ), EGTA (0.5 מ"מ), EGTA-TG (thapsigargin, 5 מיקרומטר), Ca ^{2 +-2-APB} (מעכב SOCE, 75 מיקרומטר). מבוקרת מחשב אוטומטיות perfusiמערכות על יכולות לשמש אותך גם.
9. בחר את התאים המבטאים RFP במצב להדמיה.
10. מקם את קצה הפתיחה של מערכת זלוף בהגדלה 10x עד קצה צודק מעל אזור העניין בזווית של 45 מעלות.
11. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ _{350nm 390nm} ו-F. יחס _(350nm F / F _390nm) מוצג בחלון 3. שנה את הפתרונות זלוף בסדר הבא: Ca ^{2 +,} EGTA, Ca ^{2 +,} EGTA-TG, Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +-2-APB.}

הפרוטוקול הנ"ל יכול להיות שונה עבור מדידה של Ca ^{2 +} תאיים במערכת ההשעיה התא.

12. תרבות KYSE-150 תאים בקבוק T25 עם מצב התרבות כנ"ל.
13. כאשר התאים מגיעים למפגש 90%, הסר בינוני לשטוף את התאים עם פתרון BSS.
14. הוסף 2.5 מ"ל פתרון BSS המכיל 2 מיקרומטר פורעה, 02:00 ו דגירההתאים ב 40 דקות 37 ° C ואחריו deesterification.
15. הסר BSS, להוסיף 2.5 מ"ל לתוך הבקבוק טריפסין ו דגירה על 37 ° C עד שהתאים לנתק. לאחר מכן הוסף 2.5 מ"ל התרבות בינוני כדי לעצור את trypsinization ו לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 סל"ד 5 דקות.
16. שוטפים את התאים עם המדיום התרבות פעם נוספת על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות גלולה של התאים לתוך פתרון BSS (ללא תוספת של 2 מ"מ CaCl _2, המכיל מגוון מיקרומטר Ca ^{2 +)} ולספור את מספר התאים באמצעות hematometer.
17. הוסף ~~~HEAD=NNS 10 ⁶ תאים לתוך קובט קוורץ (10 מ"מ, תאים Starna) ולמלא את עוצמת הקול עד 2 מ"ל עם BSS.
18. מניחים את קובט (ערבוב עם פס מגנטי) לתוך spectrofluorometer.
19. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ _{340nm 380nm} ו-F עם אורך גל הפליטה ב 510 ננומטר. פרוטוקול זה פועל: BSS, תוספת של 0.5 EGTA μl (0.25 מ 'מניות), תוספת של 1 thapsigargin μl(TG, המניה 10 מ"מ), תוספת של 4 μl Ca ^{2 +} (1 מ 'מניות).

2. Mn assay מרווה בתאים בתרבית

1. גל עירור לבצע סריקה של פורעה-2 בפתרונות שונים המכילים Ca ^{2 +} בריכוז הנע בין 0 עד 39.8 מיקרומטר כדי לקבוע את אורך הגל ריכוז Ca עצמאית כנקודת isosbestic. בדרך כלל, נקודת isosbestic נמצא או סביב 360 ננומטר.
2. KYSE-150 תאים בתרבית זכוכית התחתונה הכלים עמוסה פורעה-2 AM.
3. הגדרת מערכת טפטוף עם 5 אחר פתרונות BSS: Ca ^{2 +} (2 מ"מ), EGTA / TG (0.5 מ"מ ו 5 מיקרומטר, בהתאמה), Mn ^{2 +} (0.5 מ"מ, ללא תוספת של EGTA או Ca ^{2 +,} המכיל חינם Ca ^{2 +} בטווח מיקרומטר), Mn ^{2 +} / 2-APB (75 מיקרומטר), EGTA / טריטון X-100 (0.1%).
4. הר את המנה על הבמה של המיקרוסקופ ובחר "יחס עירור" מצב עם אורכי גל עירור ב 360 ננומטר ו -390 ננומטר פליטה ב 510ננומטר.
5. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ _360nm ו _390nm עם יחס F (F _360nm / F _390nm) מוצגת בחלון 3. פרוטוקול ריצה היא: Ca ^{2 +} 1 דקות כדי לייצב את הקרינה, Mn ^{2 +} למשך 30 שניות, EGTA / TG במשך 10 דקות, Mn ^{2 +} 2 דקות, EGTA-Triton X-100 (0.1%) עבור 1 דקות כדי לקבל את הקריאה ברקע. Mn ^{2 +} / 2-APB הפתרון יכול לשמש במקום Mn ^{2 +} לבחון את מרווה הקרינה בוטלה, המציינת כי הכניסה Mn ^{2 +} היא דרך מסלול SOCE.

3. Mn assay מרווה בתאי שריר

1. C2C12, קו myogenic העכבר התא, בתרבית על הזכוכית התחתונה מנות באווירה 5% CO ₂ ב 37 ° C במדיום DMEM המכילה 10% נסיוב שור עוברית, סרום סוס 10%.
2. לאחר שהתאים מגיעים למפגש, בינוני התרבות משתנה בינוני בידול (להסיר בסרום שור עוברית reducסרום דואר סוס ל -2.5%). את C2C12 myoblasts יהיה להתמיין myotubes לאחר 4 ימים.
3. טען C2C12 myotubes עם הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר פורעה-2 לפנות בוקר, כמתואר 1.4-1.6.
4. הוסף הריכוז הסופי של 20 N-בנזיל-P-טולואן מיקרומטר sulphonamide (BTS) לעכב התכווצויות שרירים, והממצאים תנועה הנגרמים על ידם לאפשר 15 דקות לפני ביצוע הניסוי.
5. הר את המנה על הבמה של המיקרוסקופ מחובר למכשיר PTI ולטעון את הפתרונות הבאים BSS למערכת טפטוף: 2 Ca ^{2 +} (2 מ"מ), 0 Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} (0.5 מ"מ); Mn ^{2 +} / TG (0.5 מ"מ, 20 מיקרומטר, בהתאמה).
6. להגדיר את המערכת זלוף כמתואר לעיל.
7. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ _360nm ו _390nm עם יחס F (F _360nm / F _390nm) מוצג בחלון 3. פרוטוקול זה פועל: 2 Ca ^{2 +} דקות 1, 0 Ca ^{2 +} דקות 1 עד FLush משם Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} 0.5 דקות, Mn ^{2 +} / TG עבור 10 דק ', ו Mn ^{2 +} / EGTA-Triton X-100 (0.1%).

4. SOCE נפתרה במרחב ובזמן בסיבי השריר עור

1. הכן את הפתרונות הבאים.
   מאגר שוה Tyrode: 140 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl _2, 2.5 מ"מ CaCl _2, pH 7.2, 290 mosm
   בינונית תרבות: DMEM עם סרום סוס 2% ו -1% פניצילין וסטרפטומיצין
   לשטוף פתרון # 1: 109.6 mM K-גלוטמט, 2 מ"מ EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl _2, 2 מ"מ ATP, קריאטין mM 6 פוספט (CP), 20 מ"מ N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic חומצה (BES)-KOH, pH 7.0
   לשטוף פתרון # 2: 140 מ"מ K-גלוטמט, 5 מ"מ EGTA-KOH, 6.5 מ"מ MgCl _2, 2 מ"מ ATP, CP 6 מ"מ, 20 מ"מ BES-KOH, pH 7.0
   הפשטה הפתרון: 140 מ"מ K-גלוטמט, 6.5 מ"מ MgCl _2, 2 מ"מ ATP, CP 6 מ"מ, 20 מ"מ BES-KOH, pH 7.0
   TT-Loadingהפתרון: 90.6 mM K-גלוטמט, 18 מ"מ Na-גלוטמט, 0.55 mM CaCl _2, 2 מ"מ EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl _2, 5.4 mM ATP, 15 מ"מ CP, 0.0025 מ"ג / מ"ל קריאטין קינאז (CK), 20 מ"מ BES-KOH, קרבוניל 5 מיקרומטר ציאניד P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7.0, 7.0 PCA
   SR פתרון טוען: 107.8 mM K-גלוטמט, 0.98 mM CaCl _2, 2 מ"מ EGTA-KOH, 6.6 mM MgCl _2, 5.4 mM ATP, 15 מ"מ CP, 0.0025 מ"ג / מ"ל CK, 20 מ"מ BES-KOH, 5 מיקרומטר FCCP, pH 7.0, 6.6 PCA
   SR פתרון ומכלה: 100 מ"מ K-גלוטמט, 40 מ"מ Na-גלוטמט, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-bis (O-aminophenoxy) אתאן-N, N, N ', סוג ב tetraacetic חומצה (BAPTA ), 0.35 mM MgCl _2, 0.5 מ"מ ATP, 1 mM CP, 20 מ"מ BES-KOH, 5 מיקרומטר FCCP, pH 7.0. 25 caffeine/20 mM מיקרומטר thapsigargin (TG) מתווספים לפני ניסויים.
2. לנתח מאריך digitorum (אדי) שריר longus, 1 להניח את העכברים ולסדר את הרגל במיקום לרוחב, ולאחר מכן להסיר את העור מאזור הקרסול עד הברך, לחתוךשכבות השרירים השטחיים של רקמות לחשוף את אדי, ולנתק את שני הגידים העליון והתחתון על מנת לשחרר את השרירים אדי שלם, חשוב לשמור על הגידים זמן רב ככל האפשר. אדי מועבר פתרון Tyrode המכיל 0 Ca ^{2 +} ו - 0.1 מ"מ EGTA למנוע התכווצויות.
3. תחת סטראו, להשתמש בשני פינצטה להחזיק גידים הכניסה נמוכות יותר ולפצל את השריר אדי לשתי חבילות. חזור על התהליך כדי לקבל 4 ואז 8 חבילות. זה קריטי, כי הגידים נשארים לכל אחת 8 חבילות בסוף התהליך. אם הם הולכים לאיבוד בין חבילות מסוימים, להתעלם מהם.
4. תחת סטראו, רצועת כל חבילה אדי הוא קיטר על הגידים בשני ומתח בזהירות עד 3 ~ 4 סיבי השריר מופרדים בודדים נותרים ללא שינוי עם גיד משני הצדדים.
5. שים 1 טיפה של Ca ^{2 +} חיץ tyrode חינם באמצע צלחת זכוכית התחתונה, להניח את רצועות אדי ישר על צלחת, להסיר במהירות ככל האפשר שלהפתרון, אז קלטת את שני הגידים באמצעות סקוץ' עמיד במים הקלטת, ולוודא את הקלטת הוא הדוק. שטפו את סיבי 1 עם פתרון 0 Ca ^{+ 2} ולאחר מכן מ"מ 2.5-CA ^{2 +} פתרון 2 פעמים. אם סיבים Hyper-חוזים הנזק לב, לבטל את סיב.
6. במידת הצורך, סיבים יכול להיות מתורבת של עד 96 שעות, ומאפשר מניפולציות גנטיות. שטפו את סיבי 3 פעמים עם המדיום תרבות שלמה להוסיף 2 בינוני מ"ל לתוך התבשיל, מקום 5% CO ₂ ו - 37 ° C חממה. לפני כל ניסוי, לבחון את סיבי השריר וזורקים אלו ללא striation ברור או עם סימנים של זיהום, או עם סימנים של נזק כגון התכווצות של קרום sarcolemmal. סיבים טובים להגיב לגירוי, KCl חשמל, גירוי קפאין.
7. סיבי שריר בודדים נשטפים 3 פעמים עם פתרון לשטוף # 1 ו שטוף פתרון תאיים כמו הפשטה עם 500 מיקרומטר Rhod-5N ו 0.5 מ"מ של CA ^{2 +} דקות 5.
8. באמצעות מחט טונגסטן מחובר בעל קוד אישי, מכנית העור סיבים תחת סטראו, המאפשר tubules רוחביים (TT) עד reseal באופן אוטומטי כדי ללכוד Rhod-5N מצומדות עם Ca ^{2 +} ב TT, לשטוף את סיבי עור פעמיים עם כביסה פתרון # 2. תהליך הפשטה מכני הוא אופטימלי כאשר פחות מ 25% של רוחב התא יוסר במהלך תהליך הפשטה.
9. כדי לטעון את SR, סיבי עור מודגרת פתרון הפשטה המכיל 20 מיקרומטר Fluo-5N הרכב עבור H 1 בטמפרטורת החדר, ואחריו שוטף נרחבים באמצעות פתרון הכביסה # 2, דגירה של 30 דק 'נוספות כדי לאפשר להשלים דה esterification של צבע.
10. אחרי 30 דקות, סיבי עור הם דמיינו תחת המטרה של 60x מיקרוסקופ confocal. תמונות הקרינה נרכשים באורכי גל של צבעים המתאימים (עירור ב 543 ננומטר ופליטות זמן רב יותר מאשר 570 ננומטר עבור Rhod-5N, עירור ב 488 ננומטר ופליטות ב 530-560 ננומטר עבור Fluo-5N). Regiתוספות של עניין (ROIs) נבחרו עבור כל צבע באזורים טעונים.
11. פרוטוקול הניסוי הוא כדלקמן: TT-loading פתרון פתרון של 120 SR-טוען, כי הפתרון של 120 SR-דלדול, על 400-750 של לכלות Ca SR ^{2 +} חנות. במהלך תהליך זה, שינויים בעוצמת Rhod 5N-TT (Ca ^{2 +)} ו-5N Fluo בעוצמה (SR Ca ^{2 +),} נרשם, יצירת כמובן זמן קביעת שינויים הקרינה היחסית בשוק TT ו-SR. משמעות הערכים של עוצמת הקרינה של סיבים מרובים מנותחים יותר. עוצמת העמסה מרבית בסוף TT / SR-loading מנורמל ל 100%.

5. נציג תוצאות

בדקנו את הפעילות SOCE ב KYSE-150 תאים באמצעות תאיים Ca ^{2 +} מדידה (איור 2.). באמצעות RFP ככתב, נוכל לבחור את תאים בודדים transfected עם shRNA פלסמיד המכיל ספציפית נגד orai1, הגן המקודד את ג SOCEhannel. לעומת תאים transfected עם פלסמידים המכילים לטפס shRNA (שחור זכר), דריסה של Orai1 תוצאות חלבון בפעילות SOCE ירד (סימן אדום).

SOCE ב KYSE-150 תאים אושר גם עם Mn ^{2 +} assay מרווה (איור 3.). גל עירור של 360 ננומטר מדווח נקודת isosbestic של פורעה-2, שם הקרינה אינה תלויה בריכוז ^{2 +} Ca. לאחר TG מדולדל לחלוטין ER Ca ^{2 +} חנויות, טפטוף של Mn ^{2 +} לירידה הקרינה משמעותית. הפעילות כוללת SOCE ניתן למדוד שיעור ירידה של עוצמת הקרינה פורעה 2-בשיפוע תלול יותר המציין SOCE פעיל יותר, בעוד משמעות שיפוע רדוד SOCE פעיל פחות. שיפוע ירידה הקרינה ב 2-APB תאים שטופלו נראה הרבה יותר רדוד, אשר ציין כי פעילות SOCE נחסם המתחם הזה. Mn^{2 +} שיעורי מרווה נקבעו מהרשומה של 10 שניות הראשונות, שבהם מרווה היה עדיין בטווח ליניארי ללא הרוויה.

דומה Mn ^{2 +} assay מרווה בוצעה שריר (איור 4.). במקרה זה Mn ^{2 +} יושמה יחד עם TG. בעוד TG היה מכלה את האישורים SR ^{+ 2} חנויות, במדרון מרווה הקרינה בהדרגה השתנה עד שהגיע בשיעור המקסימאלי. עקומת sigmoidal מציין הפעלה מדורגת של SOCE בתנאים ניסיוניים.

בריאים שלמים סיבי שריר בודד בתרבות הראה striation ברורה ואחידה, ללא סימנים של זיהומים, ואין סימנים של נזק הנגרם ע"י התכווצות. סיבים אלו היו מסוגלים להתכווץ בתגובה לגירוי חשמלי או פתרונות depolarizing. תחת הדמיה confocal, השמנה סיבים עור של Rhod-5N צבע בתא TT הראו דפוס אופייני כפיל יונקים (visualized בערוץ אדום). לאחר הטעינה של SR עם Fluo-5N בבוקר, דפוס אופייני SR מנוקד נראה (בערוץ ירוק). עם טפטוף של סיבי עור עם פתרון TT / SR טוען, עוצמת הקרינה של שניהם Rhod-5N ו Fluo-5N גדל, על זלוף פתרון דלדול SR, רמות הקרינה בתא SR ואת תא TT התחיל לרדת, המעיד על צימוד חזק בין SR Ca ^{2 +} דלדול החנות והפעלה SOCE, בהתאמה (איור 5.).

באיור 1. הפעלת חנות המופעל Ca ^{2 +} כניסה (SOCE). Orai1, נקבוביות ערוץ להרכיב יחידה, ממוקם על הממברנה (PM) ו STIM1, ² Ca ⁺ חיישן, ממוקם על reticulum endoplasmic או sarcoplasmic (ER / SR) ממברנות. כאשר ER / SR Ca ² חנויות ⁺ מופחתים או עקב חסימה של ER / SR Ca ^{2 +} משאבה (SERCא) או Ca ^{2 +} שחרור דרך קולטן ₃ IP או קולטן ryanodine, STIM1 מופעל. הופעל STIM1 מולקולות ליצור כתמים ולגרום צבירה של Orai1, אשר נוסף מוביל את ההפעלה של SOCE.

איור 2. מדידת Ca תוך תאי ^{2 +} ב KYSE-150 תאים. Exchange של פתרון תאיים בין 0 Ca ^{2 +} (0.5 מ"מ EGTA) עד 2 מ"מ Ca ^{2 +} לא לגרום כל שינוי תאיים Ca ^{2 +.} 5 מיקרומטר TG ב 0 Ca ^{2 +} פתרון אמבטיה המושרה פסיבית ER Ca ^{2 +} שחרור. לאחר ER Ca ^{2 +} חנויות היו מרוקנים (> 10 דקות), תוספת של תאי Ca ^{2 +} (2 מ"מ) מופעל מתמשכת תאיים Ca ^{2 +} דרך העלאת SOCE, אשר יכול להיחסם על ידי מעכבי SOCE, למשל SKF-96365 ו 2 - APB (הנתונים לא מראים). תאים transfected עם פלסמידים המכילים shRNA במיוחד נגדorai1 (אדום) הראו באופן משמעותי SOCE מופחת מאשר תאים transfected עם רצף לטפס (שחור).

איור 3. Mn ^{2 +} assay מרווה של SOCE ב KYSE-150 תאים. מרווה של הקרינה פורעה על ידי 2-Mn ^{2 +} (0.5 מ"מ) נמדד ב Ca ^{2 +} ללא תלות באורך גל עירור של פורעה-2 (360 ננומטר). התאים טופלו 5 מיקרומטר TG במשך 10 דקות כדי לרוקן לחלוטין את חדר המיון של CA ^{2 +} חנויות. שיפוע הדעיכה של הקרינה-2 פורעה על Mn ^{2 +} תוספת (קווי מקף, בתוך 10 שניות 1) ייצג את הפעלת SOCE, אשר באה לידי ביטוי כירידה אחוז הקרינה ליחידת זמן (הערך הראשוני כ% 100). אותות הקרינה הרווה מקסימאלי הוקמה בסוף הניסוי על ידי lysing את התאים עם 0.1% טריטון X-100 (כ% 0). תאים שטופלו 2-APB (75 מיקרומטר) הפגינו הרבה יותר רדוד, דבר המצביע על מדרון SOCE חוסמת מתחם זה KYSE-150 תאים.

באיור 4. הפעלה מדורגת של SOCE בתאי שריר שנחשפו על ידי Mn ^{2 +} assay מרווה. הפעלת SOCE יכול להירשם תוך TG היה ומכלה SR Ca ^{2 +} חנויות. יישום בו זמני של Mn ^{2 +} (0.5mm) ו TG (20 מיקרומטר) הנגרמת על ירידה מדורגת ו sigmoidal תאיים של מרווה פורעה-2 ⁺ הקרינה (קו כחול מקף להראות את נקודת מרווה המהיר ביותר), אשר היה שונה Mn הראשונית ² שיעור (קו כחול מקף). Mn ^{2 +} שיפוע מרווה נשאר כמעט זהה לרמת הבסיס בתאים שטופלו 2-APB (75 מיקרומטר), דבר המצביע על כך SOCE היה עצור.

איור 5. נפתרה במרחב ובזמן SOCE בסיבים שרירים עור. (א) Rhod-5N מלח נטען לתוך TT ו-5N Fluo AM נטען לתוך SR. (ב ') לאחר החלת Ca ^{2 +} פתרון דלדול, הקרינה הן TT ותאים SR ירד. אובדן Fluo-5N הקרינה עולה שוחרר במהירות SR Ca ^{2 +} תכנים אובדן Rhod-5N הקרינה הציע הפעלת SOCE.

Discussion

אף על פי אורכי גל עירור של Ca ^{2 +,} מחייב Ca ^{2 +} חינם פורעה-2 הם 340 ננומטר ו -380 ננומטר, בהתאמה, טווח דינמי היחס הטוב ביותר של פורעה-2 עבור Ca ^{2 +} מדידת ריכוז עלולה להתרחש באורכי גל אחרים מסוים מיקרוסקופ המערכת. שינויים כאלה הם בדרך כלל באורך גל עקב שינוי מסלול אופטי עם תוספת של רכיבים אופטיים שונים. במחקר זה, אורכי גל של עירור עבור פורעה-2 היו נחושים כמו 350 ננומטר ו -390 ננומטר על ידי ביצוע ניתוח ספקטרלי של הקרינה פורעה-2.

תאיים Ca ^{2 +} רמת בתוצאות cytosol ממאזן של מספר מקורות, כולל תאיים Ca ^{2 +} שחרור, תאי Ca ^{2 +} כניסה, כמו גם Ca ^{2 +} מנגנון הרחקה על ממברנת ER ו פלזמה. לבודד חד כיווני SOC בתיווך Ca ^{2 +} גל מ תאיים Ca ^{2 +} שחרור Ca ^{2 +} extrusion, Mn ^{2 +} assay מרווה ניתן להשתמש. Mn ^{2 +} ידוע להיות מסוגל לחדור לתוך התאים באמצעות SOCE אבל הוא אטום שחול פני הממברנה או ספיגת ER ידי Ca ^{2 +} משאבות. לכן, מרווה הקרינה מהווה מדידה של Mn ^{2 +} חד כיווני השטף לתאים האומד את מידת הפעלת SOCE. Mn ^{2 +} assay מרווה מתבצע בשלב isosbestic, באורך גל כזה פורעה-2 עוצמת הקרינה היא עצמאית של Ca ^{2 +} ריכוז. נקודת isosbestic עבור כל מערכת צריך להיקבע על ידי סריקת הספקטרום. לחלופין, Mn ^{2 +} מרווה ניתן להקליט על ידי הקרינה המתואם על כל שני אורכי הגל באופן כזה את הערך הסופי אינו תלוי Ca ^{2 +} ריכוז ^13.

כדי לקבל את המידע במרחב ובזמן הפעילות של SOCE על שרירי השלד, אנחנו עובדים בשיטה כפול צבע, המאפשר measureme בו זמניתNT הפעילות SOCE ו-SR Ca ^{2 +} תוכן עור יונקים בוגרים סיבי שריר אדי. מתאם בין שינויים SR Ca ^{2 +} פעילות התוכן SOCE ניתן להתוות כדי לציין את סף הרגישות של הפעלת SOCE דלדול של Ca SR ^{2 +} אחסון. פתרון TT-loading מותאם בנוסף לטעון את T-tubules עם Ca ^{2 +} ועל תחול של T-tubules והפתרון SR-loading נועד לקדם את מרבית SR Ca ^{2 +} ו טוען בנוסף לטעון את T-tubules עם ~~~HEAD=NNS 500 מיקרומטר Ca ^{2 +.} FCCP נכלל פתרון TT / SR-loading והפתרון SR-depleting לחסל את ההשפעות של המיטוכונדריה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
חם של F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
תחתית זכוכית מהודרת	MatTek	P35G-1.5-14-C
פורעה-2 בבוקר	Invitrogen (בדיקות מולקולריות)	F1221	-20 ° C, חותם חזק, מוגן מפני אור, התמוססו DMSO
Fluo-5N הרכב	Invitrogen (בדיקות מולקולריות)	F14204	-20 ° C, חותם חזק, מפני שאניight
Rhod-5N	Invitrogen (בדיקות מולקולריות)	R14207	-20 ° C, חותם חזק, מוגן מפני אור
קוורץ קובט	Starna תאים	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-בנזיל-P-טולואן sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase סוג אני	סיגמא	C0130