שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Summary

פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר תאים In vivo / לשעבר vivo באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד, על מנת לחקור galvanotaxis / electrotaxis ותגובות סלולריים אחרים לכוון הנוכחי (DC) שדות חשמליים (EPS).

Abstract

שדות חשמליים אנדוגני (EPS) להתרחש באופן טבעי in vivo ו לשחק תפקיד קריטי במהלך התפתחות רקמות / איברים והתחדשות, כולל זה של ^1,2 מערכת העצבים המרכזית. EFS אנדוגניים אלו מופקים על ידי רגולציה הסלולר התחבורה יונית בשילוב עם ההתנגדות החשמלית של תאים ורקמות. זה כבר דווח כי אפלייד EF הטיפול יכול לקדם תיקון התפקודי של פגיעות בעמוד השדרה אצל בעלי חיים ובני אדם ^3,4. בפרט, EF מכוונת נדידת תאים הודגמה במגוון רחב של סוגי תאים ^5,6, כולל ובתאים עצביים (NPCs) ^7,8. יישום ישיר (DC) EFS הנוכחי אינו טכניקה זמין בדרך כלל ברוב המעבדות. תיארנו פרוטוקולים מפורטים עבור היישום של EFS DC ל תאים בתרביות רקמה בעבר ^5,11. כאן אנו מציגים הפגנה וידאו של שיטות סטנדרטיות מבוסס על כוח שדה מחושב להקים 2Dד סביבות 3D עבור NPCs, ולחקור התגובות הסלולר לגירוי EF בצמיחה בשני תנאים בודדים תא 2 ד, ו פרוסה organotypic חוט השדרה ב-3D. Cordslice השדרה הוא רקמה הנמען האידיאלי ללימוד NPC לשעבר ב vivo התנהגויות, לאחר השתלה, כי הארגון רקמות cytoarchitectonic נשמר גם בתוך התרבויות הללו ^9,10. בנוסף, מודל זה vivo לשעבר גם מאפשר הליכים כי הם לא ריאלי מבחינה טכנית לעקוב אחר תאים in vivo באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד. חשוב באופן קריטי על מנת להעריך התנהגויות סלולריים בסביבה לא רק 2D, אלא גם במצב organotypic 3D אשר mimicks בסביבה vivo. מערכת זו תאפשר ברזולוציה גבוהה הדמיה באמצעות זכוכית המבוססים על מאכלים כיסוי ברקמות או איברים עם התרבות מעקב 3D של נדידת תאים אחת במבחנה לשעבר vivo והוא יכול להיות שלב ביניים לפני שעבר אל ב vivo פרדיגמות.

Protocol

1. אבי עצבית בתא בידוד

1. לנתח מוחות שלמים מ-E14 16 עכברים ומכניסים בינוני DMEM/F12 קר הבסיס. הסר את כל קרום המוח מתחת למיקרוסקופ אנטומית המוח להעביר לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ.
2. השתמש מלקחיים עדינים כדי לנתק באופן מכני המוח לרסיסים רקמות ולהעבירם צינור 15 מ"ל, ואז סרכזת דגימות בסל"ד 800 דקות 3 כדי להסיר שאריות.
3. הוסף DMEM/F12 bFGF המכיל ו EGF ו triturate עם פיפטה 1 מ"ל.
4. להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת התא לקבל השעיה תא בודד.
5. תאים הצלחת לתוך צלוחיות ב 2-5 x 10 ⁴ תאים למ"ל, ולאחר מכן לבצע בינוני מלא לשנות כל 3 ימים ומעבר התאים כל 6 ימים.
6. אחרי לפחות 5 קטעים, תקציר neurospheres לתאים בודדים באמצעות טריפסין ו EDTA ולגדול על חדרי electrotactic poly-D-lysine/laminin-coated (מוכן כמפורט להלן ב 2). השתמש בינוני הולך וגדל המכיל N2, תוספת,bFGF ו EGF כל הזמן כדי לשמור על המאפיינים של NPCs.

2. הכנת החדר electrotactic

1. הכן 22 x 11 מ"מ רצועות של זכוכית על ידי חלוקת autoclaved 22 x 22 מ"מ עובי מס '1 coverslips במחצית באמצעות עט היהלומים.
2. יצירת זכוכית חינם עומד גם ממדים פנימיים 22 x 10 מ"מ על ידי הדבקה 4 יחד אנכי עומד 22 x 11 מ"מ עם רצועות שומן ואקום גבוה סיליקון. אפשר בארות לחלוטין יבשים להקשות לילה.
3. למחרת, לצרף שני 22 x 11 מ"מ זכוכית רצועות, מקבילים זה לזה שעזב פער של 10 מ"מ, על בסיס הצלחת התרבות 100 מ"מ באמצעות גריז סיליקון. לאטום את האזור שבין רצועות אלה על ידי הנחת 22 x 22 מ"מ מכסה תלוש בסוף כל המצורפת בתחתית צלחת עם שמן משלושה צדדים, אבל לא כל כך קרוב למרכז.
4. מניחים את הכוס מוכן היטב בשלב 2.2 על העטיפה מחליק כך הקירות הפנימיים ליצור מקום מוקף עבור זריעהאת התאים על גבי החלק התחתון של הצלחת. מים הוכחה כל המפרקים עם שמן סיליקון. מעיל זה אזור מוגבל ברצף עם פולי-D-ליזין ואז laminin: להוסיף 1 מ"ל פולי-D-ליזין לחדר ולהשאיר 5 דקות כדי לאפשר פולי-D-ליזין להיקשר בתחתית הצלחת, לשטוף את החדר עם סטרילית PBS פעמיים, ואז לדלל laminin ב סטרילית PBS להניב 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולהשתמש בו כדי לכסות את תחתית הצלחת. השאירו בטמפרטורת החדר במשך הלילה.
5. למחרת, תאים הקציר ולהכין 1 מ"ל של תרחיף המכיל 1 x 104 תאים. הסר laminin מכוס טוב, זה מאפשר לאוורר יבש לחלוטין, ולהחליף עם 1 מ"ל של תרחיף תאים. מניחים את צלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 4 שעות כדי לאפשר המצורף.
6. לאחר התאים confluent מספיק להסיר את כל אמצעי מן החדר. מוציאים בזהירות את הכוס היטב. להקים גג מעל התאים על ידי הצמדת בקפידה, עם שמן סיליקון, autoclaved 22 x 22 מ"מ זכוכית coverslipגישור בין שתי 22 x 11 מ"מ רצועות. לכסות את התאים עם כמה טיפות של המדיום, כדי למנוע התייבשות.
7. ליצור מאגר בינוני בודד בכל צד של החדר על ידי יצירת שני האטומים למים מחסומים סיליקון גריז הפועלים מקצה אחד של מאכל ועד קצהו, על גג החדר. למלא את החדר עם מדיום חדש, על מנת להבטיח זרימה דרך מהמאגר 1 בינוני לאחר. להחזיר את התבשיל כדי בחממה במשך 12 שעות כדי לאפשר התאוששות התא.

3. היישום של שדה חשמלי לתא electrotactic

1. הכן את המכסה כדי לכסות את המנה באמצעות קידוח שני חורים, אחד ממוקם מעל כל המאגר של החדר ההגירה.
2. להחליף את כל אמצעי בתא עם המדיום תרבות המכיל 25 מ"מ חיץ HEPES ולהעביר את המנה למערכת טמפרטורה מבוקרת הדמיה. להגדיר את הפרמטרים של הניסוי מעידה, זמן רב בעמדה ההקלטה. יישר את החדר כך הקתודה לבין האנודה הםעל ימין ועל שמאל, בהתאמה, על מנת להבטיח כי וקטור EF פועל בצורה אופקית לראות את המיקרוסקופ והקליט במערכת הדמיה.
3. מלאו שתי כוסות עם הפתרון של שטיינברג (58 mM NaCl, KCl mM 0.67, 0.44 mM Ca (NO _{3) 2} 0.4 H ₂ 0, 1.3 mM MgSO ₄ 0.7 H ₂ 0 ו 4.6 mM Trizma בסיס, pH 7.4). חבר כוס נפרדת למאגר אחד בינוני באמצעות מוכנות מראש גשרים זכוכית (צינורות זכוכית ~~~HEAD=NNS 13 ס"מ ארוכים ~ 3 מ"מ קוטר, והתכופף לצורת פרסה על ידי חימום להבה בונזן), מלאים 2% (w / v) Steinberg's-אגר פתרון, עובר דרך החורים במכסה. להשלים את מעגל חשמלי על ידי הנחת Ag / AgCl אלקטרודות המחוברות לספק כוח DC לתוך הכוס כל פתרון של שטיינברג.
4. הגדרת חיוג המתח החשמלי בספק הכוח 0 ולעבור הלאה. למדוד את המתח על פני החדר electrotactic בזמן מפנה את החיוג מתח, באמצעות מד מתח, ולהתאים בהתאם לדרישות הניסוי.
5. התחל זמן לשגות הקלטה. לבצע שינוי בינוני להתאים מחדש את המתח, כנדרש, כל שעה. בינוני טרי, תרופות, או חומרים כימיים ניתן להוסיף את מאגרי כנדרש. כאשר מבצעים שינוי בינוני, שתי אפשרויות ניתן לראות להלן:
   1. אפשרות מס '1 - כדי להשהות את ההקלטה זמן לשגות באופן זמני, להסיר בזהירות גשרים זכוכית מחדר להימנע מביך מכסה כיסוי, השתמש עיקור פיפטה פסטר בעדינות להחליף את כל בינוני עם בינוני טרי לשים את הגשרים זכוכית בחזרה, ואז לחדש את ההקלטה.
   2. אפשרות מס '2 - לחילופין, בהתאמה אישית המכסה מכסה עם 4 חורים (2 ממוקם מעל כל המאגר של החדר הגירה) יכול לשמש גם לצורך שינוי בינוני. שניים חיבור גשרים זכוכית, השניים האחרים לשינוי בינוני. אפשרות 2 מאפשר הקלטה רציפה ללא הפרעות במהלך שינוי בינוני.

4. הכנת פרוסת חוט השדרה organotypic

1. לנתח lumbar מיתרי השדרה מתוך 2 בשבוע C57 BL / 6 עכברים.
2. פורסים מיתרי השדרה לתוך 500 מיקרומטר חלקים עבים עם המסוק רקמות McIlwain.
3. פרוסות נפרדות תחת מיקרוסקופ אנטומיים בחר פרוסות עם מבנה sagittal / צירית ללא פגע בעמוד השדרה.
4. צלחת פרוסות בצלחת פטרי 35 מ"מ המכילים 30 Matrigel μl ומניחים אותם קרוב למרכז ככל האפשר ולשמור אותם 5% CO ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות עד חלבונים Matrigel עצמית להרכיב לייצר סרט דק המכסה את פני השטח של הפרוסה חוט השדרה. חשוב מאוד לוודא כי Matrigel כבר התאספו לחלוטין, דגירה צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות אחר במידת הצורך.
5. הוסף 4-6 מ"ל DMEM/F-12 בינוני המכיל 25 HEPES mM חיץ% 15-20 העובר סרום עגלים בעדינות רבה כדי למנוע זרימת אמצעי ישירות על גבי פרוסה. להבטיח את הפרוסה לא שקוע לגמרי בכל מדיום, ומשאיר את פני השטח של explants חשוף היטבאת האוויר. שנה בינונית פעמיים בשבוע.

5. הזרקת Hoechst 33342 NPCs שכותרתו לתוך פרוסת חוט השדרה organotypic

1. מכינים את ההשעיה NPC ב 1 × 10 ⁶ תאים / μl.
2. מראש דגירה ההשעיה תא בינוני עם 5 מיקרומטר Hoechst 33342 למשך 30 דקות.
3. השתמש שפופרת זכוכית כדי microinject נימי 2 μl ההשעיה לתוך פרוסת חוט השדרה אט אט תחת מיקרוסקופ. ודא שפופרת זכוכית נימי עובר matrigel (חלק ורוד מתחת למיקרוסקופ) ולהגיע אל הצד הפנימי של פרוסת חוט השדרה (רקמה אפור תחת מיקרוסקופ), להישאר בתוך פרוסת חוט השדרה לפחות 30 שניות כדי להימנע מהשעיית תא לדרוס. שים את צלחת פטרי שמכילה פרוסת חוט השדרה לתוך אינקובטור (37 ° C 5% CO ₂₎ ולהשאיר אותה במשך הלילה.
4. למחרת, החל EF של mV 500 / מ"מ עד פרוסת חוט השדרה המכיל Hoechst 33,342 שכותרתו NPCs בחדר electrotactic (באמצעות השיטות המתוארות3).

6. נציג תוצאות

כאשר NPCs נחשפו למגוון של EFS פיזיולוגיים הם הראו נדידת תאים מכוונת מאוד לכיוון הקתודה (איור 1). תצפית זאת נעשתה גם ברמת תא בודד על פרוסת organotypic השדרה מודל כבל vivo לשעבר, חיקוי סביבת 3D בתנאים ב vivo (איור 2).

באיור 1. NPCs להראות הגירה ביים ב EFS. מחשבים הראו הגירה מכוונת מאוד לכיוון הקתודה בעת חשיפה EFS, קווים אדומים וחצים כחולים מייצגים מסלולים ואת כיוון התנועה (תא). B מראה נתיבי הנדידה של NPCs. בר: 50 מיקרומטר.

איור 2. NPCs המושתלים להראות הגירה מכוונת הקתודה ב פרוסת חוט השדרה organotypic . (א) שכותרתו NPCs עם Hoechst 33342 הושתלו פרוסת חוט השדרה organotypic בנקודת המוצא של הטיפול EF. NPCs היגרו directionally לכיוון הקתודה עבור 2.5 שעות, ובשלב הקוטביות EF התהפכה (ב '). שינוי הקוטביות EF מופעלות היפוך חד של electrotaxis לכיוון הקתודה חדש (C). (ד ') תמונה של NPCs המושתלים בתוך פרוסת חוט השדרה בסוף הקלטת זמן לשגות. (ה) שחזור 3D של NPCs המושתלים בתוך פרוסת חוט השדרה. סעיפים סריקה 3D היו 300 מיקרומטר עובי, החל מאמצע ועד למטה של ​​הפרוסה. קווים מקווקווים מציינים את המיקומים היחסיים של אותה אוכלוסיה של התאים המושתלים בראשית, היפוך, ונקודות קצה של הטיפול (EF - C, בהתאמה). ראשי החצים מצביעים על אוכלוסייה דומה של Hoechst 33342 NPCs המסומנים. בר: 50 מיקרומטר.

Discussion

הפרוטוקולים בהם אנו משתמשים מתבססים על מחקרים קודמים ^5,11. התנאים הנוכחיים באמצעות שיטות אלה, תרבות יציבה חשמלי יכול להישמר תוך יישום EF באמצעות גשרים אגר, הפתרון של שטיינברג, ו Ag / AgCl, אלקטרודות לתאי או פרוסות בתרבית תאים electrotactic אישית מעוצבת של ממדים סטנדרטיים ומ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
FGF-בסיסי אנושי רקומביננטי	Invitrogen	PHG0026	20 ng / mL
EGF רקומביננטי אנושי	Invitrogen	PHG0311	20 ng / mL
N2-מוסף (100x) נוזלי	Invitrogen	02048
DMEM/F12 בינוני (גלוקוז גבוהות)	Invitrogen	31330-095
פולי-D-ליזין	Millipore	A-003-E
טבעי העכבר Laminin	Invitrogen	23017-015
גורם הגדילה הפחית ממברנה מרתף מטריקס (Matrigel)	BD Biosciences	354230
HEPES חיץ	Gibco	15630
McIlwain המסוק רקמות	Mickle המעבדה להנדסת Co בע"מ	TC752-PD
Dow Corning גבוהה ואקום סיליקון גריז	Sigma-Aldrich	Z273554