A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
בפרוטוקול זה אנו משלבים RNAi בתיווך להשתקת גנים עם In vivo Assay diuresis ללמוד מציאה השפעות של גנים של עניין יש על הפרשת נוזל יתושים.
זה פרוטוקול וידאו מדגים טכניקה יעילה מציאה גן מסוים חרק ולנהל המבדק חדשנית למדוד את קצב הפרשת. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להשיג הבנה טובה יותר של תהליך diuresis ב חרקים שימושית במיוחד בחקר diuresis בדם, האכלה פרוקי רגליים כי הם מסוגלים לקחת כמויות עצומות של נוזל הדם בארוחה אחת.
מציאה זו RNAi בתיווך גנים בשילוב עם ב assay diuresis vivo פותחה על ידי המעבדה הנסן כדי לחקור את ההשפעות של מציאה RNAi בתיווך של גנים אקווה פורין על diuresis Aedes יתוש aegypti 1.
הפרוטוקול מוגדר ב-לשני חלקים: ההפגנה הראשונה מדגים כיצד לבנות מכשיר פשוט זריקה יתוש וכיצד להכין ולהזריק dsRNA לתוך בית החזה של יתושים על מציאה RNAi בתיווך גנים. הפגנה 2 מתארת כיצד לזהותוהפרשה שיעורי יתושים באמצעות המבדק ב vivo.
חלק א - RNAi בתיווך מציאה גן בוגר Aedes aegypti יתושים. לסקירה הניסוי ראו תרשים 1.
1. dsRNA סינתזה
2. הזרקת הכנה
3. לאסוף הרדימי יתושים
4. יתוש הזרקת
5. יתוש שחזור ואחסון
חלק ב '- ב assay diuresis vivo של מבוגרים Aedes aegypti יתושים
הערה: פרוטוקול פותחה על ידי המחברים ומשמש מציאה RNAi בתיווך של חלבונים אקווה פורין של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti 1. כדי למנוע השתנות בין יתושים בודדים, יתושים יש לנתח בקבוצות. מסיבות טכניות, אנו ממליצים על קבוצות של 5 יתושים בכל טיפול - יש כמות מוגבלת של זמן כדי לבצע את המדידה במשקל 1 לפני יתושים להתחיל להפריש שתן לאחר ההזרקה.
6. לאסוף הרדימי יתושים
7. משקל התחלתי מדידה
8. הזרקת הכנה
9. יתוש הזרקת
10. שקילה יתושים
11. מדידות משקל השני לאחר
הערה: מדידות משקל של היתושים צריך לקחת 30 דקות intervals, אבל זה יכול להיות מותאם במרווחים קצרים יותר או יותר, בהתאם שיעורי הפרשה.
12. קביעת שיעור הפרשה יתוש
13. נציג תוצאות
RNAi בתיווך מציאה גנים ב assay diuresis vivo כבר בשימוש על ידי המעבדה הנסן כדי לחקור את ההשפעות של aquaporins ב diuresis Aedes aegypti יתושים. שלושה aquaporins כי הם לידי ביטוי Aedes aegypti Malpighian tubules הופלו עם השפעה משמעותית על שיעורי והפרשה לעומת שליטה יתושים 1. איור 4 מראה תוצאות נציג של הניסוי שבו assay diuresis נעשה שימוש כדי להשוות בין שיעורי והפרשה Aedes aegypti ו Culex quinquefasciatus בטמפרטורות שונות.
באיור 1. תרשים זרימה של assay RNAi / diuresis. 5 קבוצות של 10 יתושים EAפרק מוזרקים עם dsRNA על גן ספציפי ועוד חמש קבוצות של עשרה יתושים מוזרקים עם שליטה dsRNA. קבוצה אחרת של יתושים מוזרק עם 200 מיקרומטר HgCl 2 ב PBS משמש כביקורת חיובית. יתושים אלה שקל לפני ההזרקה, ולאחר ההזרקה תוך שלושים דקות intervals במשך 3 שעות.
איור 2. מכשיר פשוט הזרקת מיקרו עבור מציאה RNAi בתיווך גנים ב assay diuresis vivo. א המחטים זכוכית נימי משמש להזרקה. משולש אפור מייצג את במרווחים מילימטר המשוכים על המחט כדי לציין את כמות הנוזל מוזרק לתוך יתושים. ב 1 מ"ל במזרק השתמשו כדי לבנות את ההזרקה מיקרו. המשולש הלבן מייצג את הרכזת המחט המשולש השחור מייצג את הבוכנה גומי הראש מחובר הבוכנה של המזרק. ג צינורות נהג לצרף את הפיה אלההזרקה. ד 1 מ"ל עצה הפנויה פיפטה (טיפ כחול) המשמש כשופר של המכשיר microinjection. א המכשיר microinjection המשלבת חלקים לספירה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 3. יתוש אופטימלית הזרקת באתר. א נקבה Aedes aegypti יתושים מוזרק באמצעות מחט זכוכית נימי בין קשקשים גדולים על החזה. הבר השחור מצביע על 1 מ"מ להשוואה גודל. -B ציור של החזה הנשי יתושים ואת כתמים לבנים מייצגים את הכף לבנות שלד יתושים. מחט הזריקה צריכה פירס יתוש בין הנקודות כדי למזער את שיעור התמותה במהלך ההזרקה.
באיור 4. ההשפעות של טמפרהture על Culex quinquefasciatus ו diuresis Aedes aegypti. assay diuresis בוצעה עם שני מינים של יתושים, Aedes aegypti ו Culex quinquefasciatus, בטמפרטורות שונות. שיעור הפרשת במהלך השעה הראשונה לאחר ההזרקה ניתנת אחוזים.
קבוצה | טרה (ז) | לא מוזרק (ז) | לאחר ההזרקה (ז) | 1h הודעה הזרקה (ז) | המשקל הממוצע (מ"ג) | הסכום הזריק (Μl) | הסכום מופרש (Μl) | % מופרש |
1 | 7.5938 | 7.6057 | 7.6104 | 7.6096 | 2.38 | 0.94 | 0.16 | 17.0 |
2 | 7.8252 | 7.8349 | 7.8415 | 7.8403 | 1.94 | 1.32 | 0.24 | 18.2 |
3 | 7.8896 | 7.9026 | 7.9077 | 7.906 | 2.6 | 1.02 | 0.34 | 33.3 |
1. לוח Aedes aegypti ב assay תוצאות ב vivo diuresis. הנתונים הגולמיים ב assay diuresis vivo הופיע עם Aedes aegypti נקבה יתושים ב 4 ° C.
פרוטוקול RNAi משמש פותחה במעבדה של אלכסנדר Raikhel באוניברסיטת קליפורניה בריברסייד 6,7, והוא דומה הפרוטוקול שפורסם על ידי Garver ו Dimopoulos 4. הגישה הניסיונית המוצגת פרוטוקול הווידאו הזאת יכולה לשמש כדי לחקור גנים המעורבים diuresis חרק בסביבה vivo. איברי ההפרשה של חרק?...
אין לנו מה למסור.
המחברים מודים ויקטוריה קרפנטר להערות ביקורתיות שלה של פרוטוקול זה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם מגיב או ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
MEGAscript T7 ערכת תפוקה גבוהה | Ambion, Inc | AM1334 | |
PBS חיץ | Sigma-Aldrich | P4417 | |
צינורות פלסטיק | הספק המקומי | PVC | |
1 מ"ל פלסטיק פיפטה עצה | VWR | 83007-376 | כחול עצה |
1 מ"ל במזרק | בקטון, דיקינסון החברה | 309602 | |
מספרים | הספק המקומי | ||
מחט מתכת | קרוליינה ביולוגיות | 654307 | גודל 5 |
לטוס כרית | Genesee מדעי | 789060 | |
סוללות w / אוסף aspirator בקבוקון | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
עצה מלקחיים עדינים | Precision של מכשירים בעולם | 14095 | |
זכוכית מחטים נימי | Precision של מכשירים בעולם | 1B200-6 | |
דיסקציה סטריאו מיקרוסקופ | Leica Microsystems | S6D | |
דיוק אנליטי איזון | Mettler טולדו | AB54S | |
סוכרוז | Sigma-Aldrich | 84097 | |
אחד ליטר בשעווה כוסות קרטון מסודרים | הספק המקומי | מרק כוסות שיוצרו | |
קווי רשת | הספק המקומי | זבוב פלסטיק גזה |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved