ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Summary

כאן אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס רק על זיהום התא, אשר משפר את יעילות הייצור parvovirus רקומביננטי ידי קיפול יותר מ 100 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. פרוטוקול זה מתבסס על שימוש adenovirus רומן 5 מבוסס עוזר המכיל סמנכ"ל parvovirus שעתוק יחידה (Ad-VP).

Abstract

Parvoviruses מכרסמים (PV) כגון עכברים H-1PV ו MVM, הם קטנים, בודדים icosahedral תקועים, נגיפי DNA. הגנום שלהם כוללת שני היזמים P4 ו p38 המסדירות את הביטוי של חלבונים בלתי מבניים (ns1 ו NS2) ו capsid (VP1 ו VP2) בהתאמה ^1. הם מושכים אליהם ריבית גבוהה כסוכנים נגד סרטן עבור יכולות oncolytic ו oncosuppressive שלהם בעת היותו פתוגניים לא עבור בני אדם ^2. Ns1 הוא מפעיל מרכזי של ³ cytotoxicity ויראלי. על מנת לשפר עוד יותר את פעילות antineoplastic הטבעיים, נגזרים מתוך וקטורים אלו נוצרו על ידי החלפת קידוד הגן החלבונים AAV עם transgene טיפולית (למשל ציטוטוקסיות פוליפפטיד, ציטוקינים chemokine, גן מדכא גידולים וכו ') ^4. את parvoviruses רקומביננטי (recPVs) וקטור שומרת לעצמה את ns1 / 2 רצפי קידוד והטלומרים הגנום PV אשר הדרושים הגברה DNA אריזה ויראלי. הייצור שלrecPVs מתרחשת רק בתאי היצרן (בדרך כלל HEK293T), על ידי שיתוף transfecting את התאים עם וקטור 2 (pCMV-VP) להביע את הקידוד הגנטי של חלבונים סמנכ"ל (איור 1) ^4. הווקטורים recPV שנוצר באופן זה הם שכפול פגום. למרות recPVs הוכיח בעל פעילות oncotoxic משופרות ביחס וירוסים הורים שממנו הם נוצרו, הייצור שלהם עדיין מהווה אתגר מרכזי מאוד מעכבת את השימוש של סוכנים אלה נגד סרטן יישומים קליניים.

מצאנו כי הכנסת וקטור Ad-5 המכיל נגזרת E2a, E4 (orf6) ואת רנ"א גנים נכי מלחמה (למשל pXX6 פלסמיד) אל HEK293T שיפור הייצור של recPVs על פי יותר מ 10 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. בהתבסס על ממצא זה, בנינו רומן Ad-VP-עוזר המכיל את המרכיבים הדרושים adenoviral גנטי כדי לשפר את הייצור recPVs כמו גם parvovirלנו סמנכ"ל הגן יחידה ^5. השימוש Ad-VP-עוזר, מאפשרת ייצור של מלבן הכונן באמצעות פרוטוקול זה מסתמך אך ורק על מדרגות זיהום ויראלי (בניגוד transfection הפלסמיד), מה שהופך את השימוש האפשרי של שורות תאים שקשה transfect (למשל NB324K) ( איור. 2). אנו מציגים שיטה משפר באופן משמעותי את כמות וירוס רקומביננטי המיוצר, הן צמצום זמן הייצור בעלויות, מבלי להשפיע על איכות המוצר הסופי ^5. בנוסף, ייצור בקנה מידה גדול של recPV (בתאים ההשעיה ו bioreactors) כיום להעלות על הדעת.

Protocol

שים לב במעבדה עם רמת בטיחות ביולוגית 2 נדרש לייצור parvoviruses רקומביננטי (recPV).

הפרוטוקול מחולק לשני חלקים עיקריים. חלק 1 (ייצור recPV דרך transfection) דרושה כדי לייצר את הכמות המינימלית של recPVs המשמש הבידוד בחלק השני של פרוטוקול (ייצור recPVs באמצעות זיהום). פעם כמות קטנה של recPVs מיוצר, את החלק הראשון של הפרוטוקול ניתן להשמיט, ואת parvovirus רקומביננטי יכול להיות מוגבר רק דרך זיהום מתן קידוד הגן החלבונים parvovirus קפסיד באמצעות עוזר adenovirus (ראה להלן).

1. הפקת recPVs באמצעות transfection

1.1 ה-DNA הנגיפי transfection

ניתן להשתמש בכל transfection הוקמה שיטת ה-DNA בחלק זה של פרוטוקול מבוסס גם על שומנים קטיוני או סידן פוספט. אנו משתמשים בדרך כלל Fugene HD מגיב transfection. כדי לשלוט ביעילות transfection, אנו ממליצים על transfecting צלחת נוספת עם חלבון משופר פלסמיד המבטא פלואורסצנטי ירוק (למשל pEGFP-N1, Clontech). Transfection נחשב יעיל אופטימלי לייצור וירוס, כאשר לפחות 50% מהאוכלוסייה תא EGFP תוצאות חיוביות 24 שעות לאחר transfection.

1. 1 יום קודם לכן, transfection זרע 2 מיליון תאים HEK293T בצלחת 10 ס"מ, כדי להשיג confluency הסלולר 50% לאחר יום של transfection. לגדל תאים 10 מ"ל של שינוי Dulbecco הנשרים בינוני (DMEM) עם תוספת של 10% עוברית שור סרום, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 מ"ל לכל U פניצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
2. להכין וירוס ההחלטות תערובת (01:02:01 יחס טוחנת) בצינור 1.5 מ"ל:
   1. 3 מיקרוגרם של recPV וקטור מחסה transgene עניין (EI phH-1-GFP ^6).
   2. 6 מיקרוגרם של וקטור pCMV / סמנכ"ל ⁵ מחסה capsid parvovirus יחידת הגן
   3. 8 מיקרוגרם Oו adenovirus המופק עוזר פלסמיד pXX6 ^7.
3. לדלל את תערובת פלסמידים עם סרום ללא בינוני עד (הריכוז הסופי של 20 ng / μl) 850 μl.
4. הוסף μl 42.5 Fugene HD (2.5:1 יחס Fugene μl: DNA מיקרוגרם). אין לגעת בצד של הצינור בעת הוספת Fugene עד בינוני.
5. מערבולת בעדינות במשך 5-10 שניות.
6. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
7. מוסיפים את תערובת transfection ירידה מבחינת אל התאים. לנער את הצלחת בעדינות כדי לפזר באופן שווה את התערובת לאורך.

1.2 וירוס הייצור

1. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עם לחות 92% ו 5% CO ₂ למשך 72 שעות לפני הקציר. במהלך תקופה זו parvovirus חלקיקים צאצאי נוצרים מן פלסמידים parvovirus.

1.3 וירוס קציר

1. בשכונה תרבות רקמות, לגרד את התאים בתוך המדיום שלהם, לשאוב ולהעביר את ההשעיה מן הצלחת אל 15מ"ל צינור פלסטיק.
2. בצנטריפוגה התחתית XG 250 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסרה של 95% supernatant.
4. מערבולת הצינור בעדינות resuspend גלולה לתוך supernatant הנותר (כ 0.5 מ"ל).
5. להקפיא את הצינור ב -80 ° C. אפשר לעצור את הייצור בשלב זה או להמשיך עם פרוטוקול.
6. להפשיר את ההשעיה ולהביא אותו בטמפרטורת החדר.
7. להקפיא את ההשעיה באמבט חנקן נוזלי ההפשרה במים חמים על 37 ° C. המערבולת צינורות בתוקף למשך 15 שניות וחזור על ההקפאה, ההפשרה נוספים מחזור פעמיים.
8. בצנטריפוגה צינורות ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
9. איסוף supernatant לתוך צינור חדש. צינור בשלב זה מכיל הכנה גולמי תמצית וירוס.
10. להמשיך עם טיטרציה וירוס (ראה להלן). עבור recPV נושאת את הגן GFP, ייצור טיפוסי צריך לתת 1-3 x 10 ⁷ יחידות זיהומיות ויראליות המתאימות על 1 -3 x ¹⁰ 10 הגנום הנגיפי המכיל חלקיקים.

1.4 וירוס אחסון

1. עבור אחסון לטווח ארוך להקפיא את הצינור המכיל את תמצית וירוס גולמי ב -80 ° C. ניתן להשתמש בתמציות נגיפיים גולמיים כמו הבידוד בחלק השני של הפרוטוקול.

2. הפקת recPVs באמצעות זיהום

לפני שמתחילים עם ייצור recPV באמצעות זיהום, לייצר ולטהר adenovirus 5 נושאת parvovirus סמנכ"ל הגן (Ad-סמנכ"ל עוזר, המתואר ⁵⁾ על פי תקן פרוטוקול ^8. זה גם הכרחי כדי לקבל כמות מזערית של recPVs הנושאים transgene עניין (למשל, המיוצר באמצעות transfection כמתואר לעיל).

בהמשך, אנו מתארים את הייצור recPV בבקבוק 175 ס"מ ² (T175) עיצוב. הגברה נוספת של מניות וירוס המיוצר באופן זה ניתן לבצע בתוך 10 multilayer תרבות בתאי CellSTACK (Corning)עם שינויים קלים של הפרוטוקול המוצע.

2.1 זיהום

1. 1 יום לפני, זיהום צלחת 10 מיליון תאים NB324K ב הבקבוק T175 להשיג confluency הסלולר 60-80% לאחר יום של זיהום. להכין בקבוק המכיל 2 את אותו מספר התאים כמו פקד (לא נגועים תאים). כל T175 צריך 20 מ"ל של מדיום חיוני מזערי (MEM) כמו נפח הסופי, בתוספת 5% העובר שור סרום, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100U לכל מ"ל ו - 100 מיקרוגרם Penicilin / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
2. למחרת בבוקר להכין תערובת הנגיף בצינור פלסטיק 2 מ"ל המורכב:
   1. Ad-VP-עוזר ⁵ ב ריבוי של זיהום (משרד הפנים, יחידות זיהומיות / נייד) = 10 (המקביל ל 1 x 10 ⁸ יחידות זיהומיות);
   2. recPVs על הפנים = 0.5 (המקביל ל 5 x 10 ⁶ יחידות זיהומיות). כדי להשלים 1.5 מ"ל עם MEM.
3. החל את התערובת כולה וירוס באחד בקבוק T175.
4. דגירהבקבוק של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, לחות 92%, 5% CO ₂ בעדינות רועד בכל 15 דקות.
5. דגירה של 20-24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, לחות 92%, 5% CO _2.
6. להחליף את המדיום התרבותי עם המדיום טרי.

2.2 וירוס הייצור

דגירה על צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס עם לחות 92% ו 5% CO ₂ למשך 48 שעות. כאינדיקציה הייצור ויראלי יעיל, סימנים ברורים של cytotoxicity צריך לשמור בבקבוק המכיל תאים נגועים ויראלי, החל 36-48 שעות לאחר הפגיעה.

2.3 וירוס קציר

1. בשכונה תרביות רקמה, לשאוב ולהעביר supernatant בינוני מן הבקבוק לתוך צינור מ"ל 50 צנטריפוגות.
2. שוטפים את התאים פעמיים עם 1.5 מ"ל PBS.
3. Trypsinize את התאים עם 1.5 מ"ל של 0.25% Trysin-EDTA. מוסיפים את ההשעיה התא עד בינוני להסירו.
4. בצנטריפוגה תאים supernatant XG ב 5000 על 5 דקות בכל מזג החדרature.
5. מחק supernatant.
6. הוסף 1 מ"ל של TE חיץ (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.7) אל תא גלולה ואת המערבולת בעדינות את הצינור כדי resuspend התאים.
7. להקפיא את ההשעיה התא באמבט חנקן נוזלי ההפשרה במים חמים על 37 ° C. המערבולת צינור במרץ עבור 15 שניות וחזור על מחזור להקפיא ההפשרה שלוש פעמים.
8. פנקו את ההשעיה תא עם 50 יח' / מ"ל ​​Benzonase nuclease למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לעכל את הגנום של תאים שאינם ארוזים DNAs ויראלי.
9. בצנטריפוגה התחתית XG 5000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
10. איסוף supernatant לתוך צינור חדש. Supernatant בשלב זה מכיל הכנה גולמי תמצית וירוס. התשואות אופייניים recPV-GFP המיוצר בעקבות פרוטוקול זה צריך להיות בטווח של 1-10 x 10 ⁸ יחידות זיהומיות ויראליות.

2.4 וירוס אחסון

1. עבור אחסון לטווח קצר (עד 2 חודשים), חנות וירוס ב 4 ° C.
2. עבור לוןגרם אחסון ארוך (יותר מ 2 חודשים), וירוס בחנות ב -80 ° C.

3. RecPV טיהור

1. לטיהור של recPVs מן lysates הגולמי, אנו ממליצים להפעיל שיפוע Iodixanol discontinous פי Zolotukhin et al. ^9. אנו ממליצים על שימוש מינימלי של 5 מ"ל של תמצית ויראלי גולמי (המתקבל הייצור חמש צלוחיות T175) לטיהור וירוס יעיל.

4. Parvovirus רקומביננטי טיטרציה

1. לבצע טיטרציה recPV כמתואר El-Andaloussi et al. ⁵

5. בקרת איכות

1. משתמשים בפרוטוקול תיאר באל-Andaloussi et al. ⁵ כדי לבדוק את הימצאותם של וירוסים לא רצויים שכפול המוסמכות (RCV) ביצוע assay פלאק parvovirus בתאים NB324K מחוון.

6. נציג תוצאות

דוגמה recPVs productioN דרך transfection בנוכחות או העדר אלמנטים הגנומי adenovirus מוצגת באיור 3. התאים היו transfected עם pCMV / סמנכ"ל (פלסמיד הנושא את הגן קידוד עבור קפסיד חלבונים parvovirus סמנכ"ל) יחד עם phH-1-GFP (recPV מטפחים את הגן GFP) או phH-1-בלוציפראז (recPV מטפחים את הגן בלוציפראז גחלילית) עם (+ pXX6) או בלי (-pXX6) pXX6 פלסמיד (נושאת adenovirus E2A, E4 (orf6) ו נכי מלחמה גנים RNA). נפח זהה של תמציות תאים הגולמי יושמו NB324K תאים התמרה GFP או מבחני לוציפראז בוצעו כפי שדווח ב-El Andaloussi et al. ^5. עלייה ברורה בייצור recPVs התקבל בנוכחות pXX6 עם הגדלת הייצור מ 0.3 יחידות GFP transductional (TU) / התא השיג על פי הפרוטוקולים המקובלים לתא כ 5 / ט"ו שהושג בעקבות השיטה שלנו (איור 3 א ', ב'). גידול משמעותי (כ 24 פי) של recPV productiעל נצפתה גם במקרה של phH-1-בלוציפראז (איור 3 ג). תוצאות אלו מצביעות על כך את החומר הגנטי המצוי pXX6 הוא מסוגל להגביר את ייצור parvovirus.

למשל נציג של ייצור recPVs באמצעות זיהום מוצג באיור 4. תאים NB324K היו לשתף נגוע recPVs שונים (כפי שצויין בתרשים) ו Ad-VP-עוזר (מחסה קידוד הגן סמנכ"ל חלבונים PV קפסיד). Ad-סמנכ"ל עוזר עוד יותר משופר ייצור recPV עד> 70 TU לכל seeded התא (איור 4 א) מבלי להגדיל את המופע של חלקיקים לא רצויים שכפול נגיפי המוסמכות (איור 4B).

באיור 1. וקטורים מבוסס על parvoviruses אוטונומיים. (א) למעלה: transgene מחליף חלק VP-קידוד גנים היא בשליטת היזם p38 ויראלי. הגנים של ns1 / 2 מחדשמזרקת והביטוי שלהם נשלטת על ידי האמרגן P4 ויראלי. הגנום וקטור מוקפת ITRS parvoviral, אשר מכילים CIS טווח האלמנטים הנדרשים לצורך שכפול ואריזה של הגנום רקומביננטי. למטה: פלסמיד שנשא VP-הגן מתחת או Heterologous (למשל CMV.), או עצמיים (למשל p38.) האמרגן (פיקסלים), מסופק טרנס במהלך הייצור parvovirus רקומביננטי כדי לפצות על ההפרעה של הגנים המבניים בגנום רקומביננטי. ITR, חזור מסוף הפוכה. איור מותאמת ⁴ (ב) צפו סכמטי של הפרוטוקול הקלאסי המשמש לייצור של recPVs. HEK293T תאים transfected זמני עם ה-DNA הנגיפי (וקטור פלסמידים עוזר) ואחרי שלושה ימים, התאים נאספים ווירוסים שנקטפו.

איור 2. הפקת recPVs עםעזרה של VP-Ad. (א) סכמטיים מפות של הגנום recPV ו Ad-VP. RecPV מכיל transgene Heterologous המחליף חלק באזור סמנכ"ל. Ad-סמנכ"ל מטפח את הגן parvovirus סמנכ"ל. (ב ') צפו סכמטי של פרוטוקול המתואר בכתב היד הזה. תאים NB324K הם שיתוף נגוע recPV ו Ad-סמנכ"ל וירוסים. לאחר שלושה ימים נקצרים התאים וחלקיקים recPV התאושש lysate התא.

איור 3. גירוי של ייצור recPV ידי adenovirus מבוססי פלסמידים pXX6. תאים HEK293T, שנזרעו ב -10 מנות ס"מ, היו transfected עם pCMV / סמנכ"ל בשילוב עם phH-1-GFP (A ו-B) או phH-1-בלוציפראז (C) לייצר recPVs. במקביל, התאים היו לשתף transfected עם adenovirus הנגזרות פלסמידים pXX6 עוזר או לא, כפי שצוין. שלושה ימים לאחר transfection, התאים נקצרו lysed על ידי שלושה מחזורים להקפיא ההפשרה. כמויות שוות של crudוירוס תמציות דואר יושמו NBK תאים החיווי, ואת מבחני התמרה בוצעו. (א) נציג micrographs מראה תאים GFP חיובית בתוך monolayers NB324K confluent. (ב ') כימות מבחני התמרה GFP לידי ביטוי יחידת התמרה (TU) לכל תא seeded (ג) כימות של הפעילות בלוציפראז כפי שבאה לידי ביטוי יחידות לוציפראז יחסית (RLU). Assay בלוציפראז בוצע כמתואר El-Andaloussi et al. ^5. עמודות מייצגים ערכים ממוצעים של 3 משכפל במוטות סטיית תקן. מספר על הטור pXX6 +, ב (B ו-C), מצביע על גידול של פי את titers וירוס recPV, שהושג בנוכחות pXX6 מול בלי.

באיור 4. גירוי של ייצור recPV באמצעות הווירוס Ad-סמנכ"ל רקומביננטי עוזר. (א) תאים NB324K, היו infecטד עם וירוס Ad-סמנכ"ל עוזר מטוהרים על הפנים של 10 (Ad-X יחידת / תא, טיטרציה עם Adeno-X ראפיד titer קיט) ולאחר מכן superinfected עם אחד parvovirus רקומביננטי הבאה Chi-HH-1-EGFP ¹¹ (0.1 TU / תאים) או H-1-GFP (0.5 TU / תא) ^5. יום אחד לאחר ההדבקה, בינוני חלו שינויים יומיים לאחר מכן, התאים נאספו באמצעות שלושה lysed הקפאת-and-ההפשרה מחזורים. תמציות תאים גולמי שימשו כדי לקבוע titers וירוס על ידי assay התמרה על פי El-Andaloussi et al. ^5. TU, יחידת התמרה. (ב ') קבוצות ויראלי מיוצר בנוכחות העדר מודעות, סמנכ"ל נותחו לתוכנם של חלקיקים נגיפיים (שכפול המוסמכות RCV) על ידי assay פלאק על תאים NB324K מחוון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הראינו כי הייצור recPV ניתן לשפר על ידי נוכחות של אלמנטים הגנומי adenoviral. הגדלנו את התשואות על ידי recPV פי יותר מ 10 (מתא 0.3-5 / TU) על ידי מתן מרכיב גנטי adenovirus דרך transfection ועל ידי יותר מ -100 לקפל שיתוף מדביק תאים עם AD-עוזר, סמנכ"ל בשילוב עם recPV ב לעומת פרוטוקולים קונבנציונאלי. פרוט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
DMEM	סיגמא	D5796
MEM	סיגמא	M4655
Foetal שור סרום	PAA	ת 15-101
L-גלוטמין	Gibco	25030-024
Fugene	רוש	047097050001
טריפסין-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase nuclease	סיגמא	E8263
Adeno-X ראפיד titer Kit	Clontech	632250