השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

Summary

אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.

Abstract

Progranulin (PGRN), הידוע גם בשם מבשר epithelin granulin (GEP), הוא גורם-593 חומצות אמיניות צמיחה autocrine. PGRN ידוע לשחק תפקיד קריטי במגוון של תהליכים פיזיולוגיים ומחלות, כולל העובר מוקדם, ריפוי פצעים ^1, דלקת ^{2, 3,} ו מארח הגנה ^4. PGRN גם פונקציות כגורם neurotrophic ^5, מוטציות בגן PGRN שגורם לאובדן חלקי של דמנציה לגרום חלבון PGRN frontotemporal ^{6, 7.} מחקרים אחרונים שלנו הביאו לבידודה של PGRN כמו וסת חשוב של התפתחות סחוס השפלה ^8-11. למרות PGRN, גילה כמעט לפני שני עשורים, משחק תפקידים מכריעים מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מרובים, מאמץ לנצל את הפעולות של PGRN ולהבין את המנגנונים המעורבים כבר הקשו באופן משמעותי על ידי חוסר היכולת שלנו לזהות את הקולטן שלו מחייב (ים). כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו מודיfied שמרים שני היברידית (MY2H) המבוססת על המערכת הנפוצה ביותר GAL4 2-היברידית מבוססת. בהשוואה למסך רגיל שמרים שני היברידית, MY2H דרמטי מקצרת את תהליך המסך מפחית את מספר שיבוטים חיובי כוזב. בנוסף, גישה זו היא לשחזור אמין, ויש לנו בהצלחה המועסקים במערכת זו לבודד את החלבונים המחייב של פיתיונות שונים, כולל יון ערוץ ^12, תאי חלבון מטריקס ^{10, 13, 14} ו - גורם גדילה. במאמר זה, אנו מתארים את הליך הניסוי MY2H בפירוט באמצעות PGRN כדוגמה שהוביל לזיהוי TNFR2 כמו הקולטן first PGRN הקשורים ידוע ^{14, 15.}

Protocol

1. רקע מידע

מערכת היברידית שני שמרים היא טכניקה גנטית רבת עוצמה בשימוש לגלות חלבונים אינטראקציות ^{16, 17.} כמה סוגים של 2-היברידית מערכות, כגון לכסה מערכות מבוססות, את מערכת גיוס Sos, חיידקים או יונקים מבוססי תאים 2-מכוניות היברידיות, הם זמינים מסחרית, מסמך זה מתמקד במיוחד שינויים של הנפוץ ביותר GAL4 מבוסס 2-היברידית שמרים המערכת. בקיצור, השיטה מתבססת על המאפיינים של החלבון שמרים GAL4 שמורכבת תחומים להפרדה אחראי הפעלת ה-DNA מחייבת תעתיק. חלבון הפיתיון מבוטא היתוך לתחום ה-DNA מחייבת GAL4 (DNA-BD), ואילו החלבונים טרף מבוטאות fusions לתחום GAL4 ההפעלה (AD). אינטראקציה בין הפיתיון היתוך חלבונים טרף מוביל הפעלות תעתיק של GAL4 מחייב לאתרים המכילים גנים כתב כי משולבים גרם שמריםenome. עקרון Y2H מודגם באיור. 1 את הליך הניסוי מסוכמת באיור. 2.

2. החומרים הדרושים ופתרונות

1. צמיחה בינונית YPD (תערובת של peptone, תמצית שמרים, דקסטרוז בפרופורציות אופטימלי לגידול רוב הזנים Saccharomyces cerevisiae).
2. בסיסי מינימלי SD (Minimal סינתטי מוגדר (SD) בסיסי כוללים חנקן בסיס שמרים, אמוניום סולפט, ומקור פחמן, דקסטרוז. (DO) תוספי נשירה ניתן להוסיף מאגר SD מינימלי לעשות בינוני סינתטי, מוגדר חסר שצוין חומרים מזינים).
3. Leu /-TRP נשירה (DO), תוספת (המכיל כל חומצת אמינו חיונית מלבד לאוצין ו טריפטופן)
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura נשירה (DO) מוסף (המכיל כל חומצת אמינו חיונית מלבד לאוצין, טריפטופן, היסטידין, ו אורציל)
5. מרק לוריא (LB) (Tryptone 10 g / L, תמצית שמרים 5 גרם / L, NaCl 5 g / L)
6. Xגל (5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) פתרון: מוכנים כמו 20 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות N, N-Dimethylformamide
7. TE 10X (100 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, autoclaved)
8. הרינג sonicated או זרע DNA סלמון, מבושל (10 מ"ג / מ"ל)
9. LiAc 10X (1 אצטט M ליתיום, autoclaved)
10. 50% PEG-3350 פתרון, לסנן, מעוקר
11. 3-אמינו-1, 2, 4-triazole (3AT)
12. Kanamycin
13. אמפיצילין
14. ELECTROMAX DH5α תאים
15. Z חיץ: 16.1 גרם Na2HPO4 7H2O (או 8.52 גרם נטול מים), 5.5 גרם NaH2PO4 H2O (או 4.8 ganhydrous), 0.75 גרם KCl, 0.246 גרם MgSO4 7H2O (או 0.12 גרם נטול מים), מומס 1 ליטר מים autoclaved, מזוקקים מותאם pH 7.0.

3. פיתיון דור (pDBLeu-PGRN)

שבר cDNA קידוד PGRN חסרה אות פפטיד (aa21-588) היה משובטים directionally אל I-לא סאל אני האתרים של וקטור pDBLeu (מערכת של שתי היברידית ProQuest, Invitrogen),שמירה על התרגום באותה מסגרת קריאה כמו דומיין GAL4 את ה-DNA Binding ליצור pDBLeu-PGRN.

1. להגביר את שבר cDNA של PGRN שתואר לעיל על ידי PCR באמצעות primers oligonucleotide שנועד להכיל אתרי הגבלה (סאל אני בבית 5'end ולא הייתי בבית 3'end) כדי לאפשר בתוך מסגרת היתוך.
2. ג'ל לטהר את מוצר ה-PCR, לעכל עם הגבלה endonucleases סאל ואני לא אני
   הכן את הווקטור DB pDBLeu ידי עיכול הגבלה כפול עם endonucleases הגבלה דומה.
3. ולקשור PGRN הגבלה שבר לתוך pDBLeu לינארית וקטור להפוך DH5α עם מבחר של LB + kanamycin במהירות של 25 מיקרוגרם / מ"ל.
4. בדוק את תיקון לבנות את ידי רצפי DNA.

4. שינוי בקנה מידה קטן של פיתיון פלסמיד

1. לחסן 5 מ"ל של YPD עם מושבה של Mav203 (Invitrogen), לנער בן לילה בשעה 30 ° C.
2. לדלל את התרבות לילה 50 מ"ל של YPD. לגדול תוספתitional 2-4 שעות.
3. גלולה התאים בסל"ד 3000 דקות 5 ב RT. Resuspend את הכדור ב 40 מ"ל מים מזוקקים autoclaved.
4. גלולה מחדש את התאים. Resuspend ב 2 מ"ל של תמיסת אני, דגירה ב 10 דקות RT.
   פתרון I: 0.5 מ"ל 10xLiAc, 0.5 מ"ל 10xTE, 4 מ"ל H ₂ O
5. לוותר על ה-DNA כדי צינורות: 2-3 μl של pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) ו 10 μl של ה-DNA מפוגל, טעון סלמון זרע (10μg/μl). הוסף תאים שמרים 100μl, ומערבבים היטב.
6. הוסף 700μl הפתרון השני, ומערבבים היטב. לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. פתרון שני: 0.2 מ"ל 10xLiAc, 0.2 מ"ל 10xTE, 1.6% 50 מ"ל PEG3350.
7. מחממים זעזוע 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
8. גלולה דקות 2. בטל supernatant. Resuspend גלולה ב 200 μl מים, autoclaved מזוקקים.
9. פלייט את ההשעיה על SD-Leu צלחות עם דילולים סדרתי. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.

5. פיתיון אימות

לפני ביצוע yeaרחוב מסך שני היברידית, מבחן pDBLeu-PGRN להפעלה עצמית לקבוע את רמות הביטוי הבסיסי של הגן HIS3 הכתב. בדיקה זו קובעת אם פיתיונות להפעיל שעתוק והאם עצמית ההפעלה ניתן לנטרל על ידי מעכבי. 3-אמינו-1, 2, 4-triazole (3-AT) הוא מעכב תחרותי של המוצר HIS3-הגן וניתן להשתמש בו כדי לכיל את רמת מינימום של הביטוי HIS3 הנדרש לצמיחה על היסטידין מחסר התקשורת.

1. המרה pDBLeu-PGRN לתוך זן שמרים Mav203, הצלחת השינוי על גבי SD-Leu צלחות דגירה של 48-72 שעות בקצב של 30 ° C.
2. תיקון מושבות מן התמורה כל באמצעות קיסמים autoclaved על SD-Leu-שלו צלחות המכילות 3-AT בריכוזים של 10 מ"מ, 25 מ"מ, 50 מ"מ, 75 מ"מ, 100 מ"מ. 3-AT הוא מעכב תחרותי של האנזים HIS3 ו פיתיונות רק כי התערוכה עצמית ההפעלה יוכלו לגדול בנוכחות של 3-AT.
3. פיתיון זנים הגדלים על צלחות containing 100 מ"מ 3-AT אינם מתאימים לשימוש מסך שני היברידית. עבור פיתיונות כי ניתן להשתמש, השתמש הנמוך ביותר 3-AT ריכוז מעכב גדילת התא. במקרים רבים, 25 מ"מ 3-AT משמש להקרנה.

6. ספריית cDNA ההקרנה

PDBLeu-PGRN הפלסמיד מוחדר MaV203 באמצעות שינוי בקנה מידה קטן, כפי שתואר לעיל. כדי להציג pPC86, ספריה (Invitrogen) לתוך MaV203 (pDBLeu-PGRN), ההליך המתואר להלן בדרך כלל נותן ~ 4 x 10 ⁴ מושבות עם 0.5 מיקרוגרם של ה-DNA ספריה פלסמיד. לפיכך, 2.5 x 10 ⁶ transformants שמרים ידרוש ~ 30.0 מיקרוגרם pPC86-DNA ספריית cDNA פלסמיד, 25 טרנספורמציות, וחמישים 10 ס"מ צלחות (SD-Leu-TRP-AT שלו עורה 3).

1. הכן את המספר המתאים של 3 SD-Leu-TRP שלו, עורה 10 ס"מ צלחות (50 עבור ההליך להלן). כמו כן להכין לפחות ארבעה 10 ס"מ SD-Leu-TRP צלחות להערכת מספר transformants.
2. המרה לתוך הספרייהMaV203 המכיל pDBLeu-PGRN פי הנוהל המתואר להלן.
   1. להשעות מושבות מבודדות כמה MaV203 (pDBLeu-PGRN) ב ~ מים 100μl, autoclaved מזוקקים ולהפיץ אותם על צלחת SD-Leu 10 ס"מ. חזור על התהליך עבור צלחת SD-Leu השני. דגירה הן הצלחות 18-24 שעות בקצב של 30 ° C.
   2. גרדו לחלוטין להשעות את התאים ב 10 מ"ל מים autoclaved, מזוקקים. הוספת נפח מספיק של השעיה תא 500 מ"ל של מדיום YPD נוזל בבקבוק לתת OD של ₆₀₀ ~ 0.1.
   3. ודא כי OD הוא ~ 0.1 לאחר חיסון.
   4. Shake ב 30 ° C עד ₆₀₀ OD מגיע ~ 0.4.
   5. הכן טריים:
      1. 110 מ"ל 1X TE / LiAc על ידי שילוב של 11 מ"ל TE 10X, 10X 11 LiAc מ"ל, ו - 88 מ"ל מים autoclaved.
      2. 16 מ"ל PEG / LiAc על ידי שילוב של 1.6 מ"ל TE 10X, 10X 1.6 LiAc מ"ל, ו - 12.8 מ"ל 50% PEG-3350.
   6. גלולה התאים 3000g ב 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. מחק tהוא supernatants בעדינות resuspend גלולה ידי pipetting מעלה ומטה 100 מ"ל מים, autoclaved מזוקקים בטמפרטורת החדר.
   8. צנטריפוגה ב 3000 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. בטל supernatant של תאים centrifuged ו resuspend התא גלולה ב 50 מ"ל פתרון TE / LiAc 1X.
   10. צנטריפוגה ב 3000 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   11. הסר את supernatants ו resuspend גלולה בנפח סופי של 2.5 מ"ל פתרון TE / LiAc 1X.
   12. בצעו 25 טרנספורמציות. שלב 2.5 תאים מ"ל, 125 μl (10μg/μl) מפוגל, טעון זרע DNA סלמון, ו -30 מיקרוגרם ספריית cDNA. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. הוסף 15 מ"ל PEG / LiAc פתרון ומערבבים בעדינות. Aliquot תוך 25 autoclaved 1.5-מ"ל צינורות microcentrifuge μl של 700 כל אחד.
   13. דגירה למשך 30 דקות בתוך אמבטיה במים 30 מעלות צלזיוס.
   14. מחממים בהלם במשך 15 דקות בתוך אמבטיה במים 42 מעלות צלזיוס.
   15. צנטריפוגה ב g 6000 1 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את סופרצף. בעדינות resuspend כל גלולה ב 400 μl מים, autoclaved מזוקקים ידי pipetting למעלה ולמטה.
3. צלחת את התערובת 200 μl טרנספורמציה מן התמורה על כל אחת 10 ס"מ SD-Leu-TRP-AT שלו עורה 3 (3AT ריכוז: 25 מ"מ) באמצעות צלחות בר להתפשט, אז 25 autoclaved 1.5-מ"ל צינורות microcentrifuge יכול לעשות 50 צלחות (SD-Leu-TRP שלו AT-3 עורה).
4. צלחות דגירה של 5-10 ימים על 30 ° C.
5. כדי להעריך את יעילות הטרנספורמציה של התגובה, דילולים הסידורי של תגובה אחת (1:40, 1:400 ו 1:4000) הם מצופה בצלחת SD-Leu-TRP. לאחר דוגרים במשך 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס, מספר מושבות נספר את המספר הכולל של transformants מחושב.

7. X-gal assay

1. העברת מושבות לצלחת YPD; לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. המקום מעוגלות קרום Nitrocellulose על הצלחת YPD; לוודא שאין בועות בין הממברנה ואת צלחת YPD. אחרי 1-2 דקות, MAke בטוח מושבות כל מועברים ממברנות (נייר nitrocellulose).
3. הנח את הצד המושבה קרום למעלה בסירה עשה עם נייר אלומיניום.
4. שים את הממברנה לתוך חנקן נוזלי, להמתין עשרים שניות, ו לצלול לתוך חנקן נוזלי במשך כמה דקות.
5. קח את קרום להפשיר.
6. בינתיים מערבבים את מגיב הבאים:
   1.5ml Z חיץ
   20μl X-gal (20 מ"ג / מ"ל)
7. Drop Z חיץ / X-gal בצלחת פטרי, מקום whatman נייר על גבי זה.
8. בזהירות במקום נייר nitrocellulose על גבי נייר whatman.
9. לדגור על ° 37 עד מושבות כחול להופיע.

8. Retransformation assay

חלבונים Prey היתוך (AD-Y) מבודד ההקרנה ספריית צריך לשמור את האינטראקציה עם חלבון הפיתיון היתוך (DB-X) כדי לעורר את הגנים הדו"ח, ואת retransformation של שיבוטים טרף הפיתיון לבנות לתוך שמרים יכולים להמשיך לחסל חיוביות שגויות ולאפשר להוסיףitional ניתוח.

1. לבודד פלסמיד דנ"א מתוך זני שמרים פוטנציאל המכילים חלבונים אינטראקציה.
2. Transform-DNA לתוך החיידק DH5α תאים, הצלחת טרנספורמציות על LB 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​צלחות אמפיצילין סלקטיבי לבודד את ספריה pPC86-cDNA, ו דגירה לילה בשעה 37 ° C.
3. פיק מספר מושבות מן הצלחת להכניס LB 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​מרק אמפיצילין.
4. הכן miniprep דנ"א לבחון ידי ניתוח הגבלה כפול עם סאל ואני לא אני
5. עמית להפוך את הטרף הפיתיון הפלסמיד ואת הפלסמיד לתוך MaV203, את הצלחת השינוי תערובות על SC-Leu-TRP צלחות דגירה של 2-3 ימים לכל 30 ° C.
6. ולבחור שלוש מושבות שונה צלחת SC-Leu-TRP, בצע X-gal Assay.

9. סידור ביואינפורמטיקה ניתוח

רצף ה-DNA פלסמיד זה היה מבודד סביר שיבוטים חיובי נכון, להשוות בין רצפים אלה לאלה GenBank באמצעות BLAתוכנית ST, ולזהות אלו שני היברידית clones שמתאימים גנים ידועים. רצף נתונים הראה כי שניים מתוך 12 חיוביות שהושגו היו מעל שטח פני התא TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; ההצטרפות # NM_130426). בנוסף, האינטראקציה בין PGRN ו TNFR אומתה באמצעות חלבונים שונים מבחני האינטראקציה, כולל במבחנה assay-Solid שלב מחייב, Co-immunoprecipitation, Surface ניתוח plasmon תהודה, ואת זרימת cytometry assay ^14.

10. נציג תוצאות

תרשים זרימה של ההקרנה מתואר באיור. 3. בדרך כלל 5-10 מועמדים לשבט חיובית תושג בשלב זה. אנחנו בתחילה מבודדים 54 מועמדים לשבט חיובי בין 2,500,000 transformants הוקרן עם הפיתיון PGRN. מועמדים לשבט חיובית אומתו לאחר מכן על ידי ביצוע X-gal assay. בדרך כלל, כ 50% שיבוטים חיובי כוזב מוסרים באמצעות assay X-gal. השגנו 23 שיבוט חיובית כנה ates בשלב זה הפיתיון PGRN (איור 4). Retransformation של שיבוטים טרף לבנות הפיתיון לתוך שמרים נוספת לחסל חיוביות שגויות ו שיבוטים עדיין להפעיל את הגנים עיתונאי סביר החיוביים מייצגים את האמת. בדרך כלל, כ 50% חיובי מועמדים לשבט יוסרו. אנחנו בסופו של דבר מבודד 12 שיבוטים חיובי כי אינטראקציה עם PGRN בשמרים.

באיור 1. עקרון שמרים מערכת של שתי היברידיות

באיור 2. צינור של זיהוי שותפים חלבון מחייב שימוש בשני היברידית מערכת שמרים

באיור 3. תרשים זרימה של שמרים ההקרנה שתי היברידית הספרייה.rge.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה בגודל מלא של תמונה זו.

איור 4. בטא Galactosidase assay מועמדים לשבט חיובית. , שיבוטים חיובי המתקבל מסך ספריה הועברו צלחת YPD וטופחו על 30 מעלות צלזיוס במשך הלילה, B, כל מושבות בצלחת YPD הועברו ממברנות nitrocellulose ו בטא galactosidase assay ביצע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שני היברידית ההקרנה שמרים הוכיחה להיות כלי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון ^{16, 17.} לעומת גישות אחרות לזיהוי חלבונים מחייב שותפים, כגון שיתוף טיהור חלבון שבבי ביוכימיים, שמרים שני מערכת היברידית היא גישה גנטי רגיש, שניתן להשתמש בהם להקרנה מספרים גבוהים מאוד של קידוד ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
ProQuest שני היברידית מערכת	Invitrogen	10835
YPD בינוני צמיחה	Clontech	630409
YPD בינוני אגר	Clontech	630410
מאגר מינימלי SD אגר	Clontech	630412
Leu-DO מוסף	Clontech	630414
-Leu/-Trp DO מוסף	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO מוסף	Clontech	630425
3-אמינו-1-,2,4 triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
מרק לוריא (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
סלמון sonicated זרע DNA	Stratagene	201190
אמפיצילין	AMRESCO	0339
Kanamycin סולפט	Invitrogen	11815-024
יעילות Subcloning ™ DH5α ™ תאים המוסמכת	Invitrogen	18265-017
Trizma ® בסיס	Sigma-Aldrich	T6066
ליתיום אצטט	Sigma-Aldrich	L4158
Ethylenediaminetetraacetic חומצה	Sigma-Aldrich	ED
Nitrocellulose ממברנה	Bio-Rad	162-0115
10 ס"מ צלחת פטרי	ITI מדעי	CT-903
אינקובטור (30 ° C)	ATR (Ecotron)