בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Summary

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

Abstract

תאים דנדריטים ריאות (DC) לשחק תפקיד מהותי חישה הפולש ^1,2 פתוגנים כמו גם בשליטה על התגובות tolerogenic ³ בדרכי הנשימה. לפחות שלושה תת העיקרי של התאים הדנדריטים ריאות תוארו בעכברים: DC קונבנציונלי (CDC) ^4, plasmacytoid DC (PDC) ⁵ ו IFN-בהפקת הרוצח DC (IKDC) ^6,7. משנה ה-CDC היא משנה DC הבולטים הריאה ^8.

סמן משותף ידוע לזהות תת DC היא CD11c, סוג אני הטרנסממברני integrin (β2) אשר באה לידי ביטוי גם על מונוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים חלק מתאי B ^9. ברקמות מסוימות, באמצעות CD11c כסמן העכבר לזהות DC תקף, כמו הטחול, שם רוב התאים ⁺ CD11c לייצג את קבוצת המשנה CDC המבטא רמות גבוהות של הגדולים מורכבים histocompatibility מחלקה II (MHC-II). עם זאת, הריאה היא רקמה הטרוגנית יותר להיות שםצד תת DC, יש אחוז גבוה של האוכלוסייה תא ברורים המבטא רמות גבוהות של CD11c התקף רמות נמוכות של MHC-II. בהתבסס על האפיון שלה בעיקר על ביטויו של F4/80, סמן macrophage הטחול, ^היי CD11c MHC-II תא ^lo האוכלוסייה ריאות זוהה מקרופאגים ריאתי 10 ולאחרונה, כמבשר פוטנציאל DC ^11.

בניגוד עכבר PDC, ללמוד את התפקיד הספציפי של ה-CDC בתגובה החיסונית ריאתי הוגבל בשל היעדר של סמן מסוים שיכול לעזור בבידוד של תאים אלה. לכן, בעבודה זו אנו מתארים הליך לבודד מטוהרים עכבר ריאות CDC. הבידוד של ריאתי תת DC מייצג כלי מאוד שימושי כדי לקבל תובנות לתוך הפונקציה של תאים אלה בתגובה פתוגנים בדרכי הנשימה, כמו גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את התגובה החיסונית לארח בריאה.

Protocol

1. ריאות זלוף ההשעיה תא בודד

1. להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של תערובת ההרדמה קטאמין / xylazine (ב mg / עכבר 1.8 קטמין, xylazine 0.19) ו exsanguination דרך וריד הירך
2. לחשוף את חלל בית החזה על ידי חיתוך משיכתו בעדינות בחזרה את העור החיצוני של הצפק. המשך כדי לפתוח את הסרעפת על ידי חיתוך החזה כדי לחשוף גם את הלב והריאות.
3. Perfuse בעדינות את הריאות באמצעות מזרק 5 מ"ל מלאים EDTA-HBSS (1mm EDTA סידן / מגנזיום ללא HBSS). חבר מחט 25 G ו להכניס מחט לתוך החדר הימני. כדי למנוע דליפה במהלך ההזרקה, לאבטח את הרקמה myocardiac סביב המחט באמצעות מלקחיים. בעדינות להזריק פתרון תוך שמירה על לחץ קבוע. זלוף מדויק תגרום לאינפלציה ריאה ושינוי צבע ורוד / לבן.
4. הסר ניקוז בלוטות הלימפה כדי לבטל כל אפשרות של זיהום מן הרקמה הזאת.
5. לגבותרקמת הריאה, להעביר בצלחת פטרי על קרח, לקצוץ אותו לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח.
6. העברת רקמה מעוגנת לתוך צינור gentleMACS C המכיל 5 מ"ל / ריאות של פתרון העיכול collagenase (collagenase סוג 1A 0.5 מ"ג / מ"ל ​​בתוספת סוג IV שור הלבלב DNase 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב HBSS המכיל 5% FBS, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל).
7. השתמש dissociator gentleMACS לקבל השעיה תא בודד. בחר תוכנית: m_lung_01. דגירה מדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Shake צינור כל 5 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. המשך m_lung_02 התוכנית.
8. העברת מדגם צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. לאחר שלב זה, לשמור את כל ריאגנטים centrifugations ב 4 ° C כדי למנוע ירידה כדאיות התא.
9. בטל supernatant ו lyse הנותרים כדוריות דם אדומות על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ lysing ACK דקה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 13 תאיםמ"ל של BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C.
10. בטל supernatant, תאים הכולל resuspend ב 5 מ"ל של BSA PBS/0.5% קר לעבור יסודית רשת ניילון 100 מיקרומטר.
11. קבע את מספר הסלולרי סך באמצעות trypan צבע כחול הדרה.

2. בידוד מגנטי והעשרה CD11c ⁺ תאים

1. צנטריפוגה ההשעיה תא בודד במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant.
2. Resuspend תא גלולה ב 400 μl של חיץ ההפרדה (PBS, BSA 0.5%, ו - 2 mM EDTA) לכל 10 ⁸ תאים בסך הכל. בלוק Fc בתיווך נוגדנים נוקבים מחייב באמצעות anti-CD16/CD32 נוגדן (0.5μg / 10 ⁶ תאים) במשך 30 דקות ב 4 ° C.
3. שטפו תאים עם 10 מ"ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C. Resuspend תאים μl 400 של חיץ ההפרדה.
4. הוסף 100 μl של microbeads CD11c לכל 10 ⁸ תאים בסך הכל. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר (2-8 מעלות צלזיוס).
5. שטפו תאים עם 10 מ"ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant.
6. Resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של חיץ ההפרדה קר.
7. בצעו הפרדה מגנטי באמצעות מפריד Pro autoMACS ^TM ידי בחירת posseld התוכנית. אסוף את חלק חיובי (0.5 מ"ל).

3. הדנדריטים בתא בידוד קונבנציונלי (CDC)

1. דגירה מועשר CD11c ההשעיה התא חיובי עם אנטי CD11c PE-Cy7 ו anti-IA/IE (MHC-II), FITC נוגדנים במשך 30 דקות 4 ° C. ריכוז מיטבי של נוגדנים הוא 0.5 מיקרוגרם / 10 ⁶ תאים.
2. שטפו תאים עם BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. תאים Resuspend ב 0.5 מ"ל של BSA PBS/0.5% ולהעביר אותם דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר.
3. המשךלמיין את התאים באמצעות סדרן תא FACS Aria במצב טוהר. הוסף 100 μl של BSA PBS/0.5% ל צינורות לאיסוף כדי למנוע נזק של תאים מטוהרים. שמור את התאים בטמפרטורה בקירור לאורך כל תהליך מיון התא.

4. פרוטוקול חלופי לקבלת ההשעיה תא בודד והעשרה CD11c + תאים

1. בשנת החלפת dissociator gentleMACS, רקמת הריאה מעוגנת משלב 1.5 ניתן להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת collagenase לכל ריאה דגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C. וורטקס תאים כל 15 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. לשבש את הרקמה על ידי העברת מדגם 6-8 פעמים פנימה והחוצה דרך מזרק 3 מ"ל קשור מחט G 20. הימנע עושה בועות בתהליך, אחרת הכדאיות התא יהיה בסכנה. לאחר ההשעיה תא בודד מתקבל, המשך לשלב 1.8.
2. בשנת החלפת ^TM AutoMACSPro separaטור, בידוד מגנטי להעשרת התאים CD11c, יכולה גם להתבצע על ידי העברת מתלה התא באופן ידני באמצעות שתי עמודות MACS. בחירת העמודות המתאימות ישתנה בהתאם לגודל המדגם.

5. נציג תוצאות:

ריאות CDC מזוהים CD11c ^היי / MHC-II האוכלוסייה ^היי התא. כפי שמוצג באיור. 1, ה-CDC מהווים אחוז קטן יותר של 1.4% לעומת כ ברקמות אחרות כגון הטחול (4.8%). עם זאת, בניגוד טחול, ריאות תאים CD11c חיובית לבטא כמויות שונות של MHC-II, כולל האוכלוסייה תא שונה מזו של ה-CDC. לאחר הכנה מתא בודד, התשואה של התא לתאי ריאה הכולל היה כ 3.0-3.8 x 10 ⁷ תאים / ריאות עם הכדאיות של 60-70% ממנה קצת מעל 1% מיוצג משנה CDC. אחוז זה עלה לאחר בידוד המגנטי CD11c שבו הריאות CDC הכולל היה מוגדל כ 10 times (> 16%) מן הכנה המקורי (איור 2A). עם זאת, תאים CD11c לבטא כמויות נמוכות של MHC-II (CD11c ^היי / MHC-II ^והנה, מקרופאגים) ייצג האוכלוסייה גבוה תא מזהם (> 70%) אשר היה מעורב עם תת הריאה ה-CDC. כפי שמוצג באיור. 2B, תאים אלה בוטלו לאחר שלב המיון, כאשר תא טוהר CDC הגיע> 96%. התשואה הרגילים של ה-CDC לאחר ההליך כולו היה 5 x 10 ⁴ תאים / ריאות. Microphotographs להראות מאפיינים מורפולוגיים של ה-CDC כמו תאים מעוגלים עם דנדריטים טיפוסי (הפאנל העליון). מצד שני, המיוצג על CD11c ^היי / MHC-II ^lo תת שונים מורפולוגית שמראה בליטות הסלולר האופייניים של מקרופאגים (MΦ, הפאנל התחתון) ^12.

1. איור דיפרנציאלי DC תדירות הריאות והטחול העכבר. ריאותרקמת טחול nd מ C57BL / 6 עכברים נאספו שטופלו collagenase. בעקבות עיכול collagenase, התאים היו מוכתמות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תזרים נציג מגרשים cytometry להראות אחוזי ה-CDC (CD11c ^היי / MHC-II ^היי) בתוך הריאות והטחול.

באיור 2. בידוד של ה-CDC מן הריאות העכבר. ריאה עכבר תא בודד ההשעיה סומן עם אנטי CD11c microbeads ויעברו מפריד תא אוטומטי.) נציג העלילה מראה את האחוזים של ה-CDC (CD11c ^היי / MHC-II ^היי) ו המקרופאגים (MΦ, CD11c ^היי / MHC-II ^LO) אוכלוסיות לאחר העשרה CD11c. מכתים נוסף של השבר בעקבות מועשר באמצעות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תאים חיובית כפולה מוינו ונותחו על ידי cytometry הזרימה. אלמורפולוגיה לזהות שלהם, התאים היו cytospun ומוכתמת עם צביעה שונה רייט Giemsa. B) מגרשים נציג להראות אחוזי ה-CDC MΦ לאחר מיון התא. Microphotographs להראות תמונה מייצגת של הריאה-CDC MΦ ריאות. בר סולם = 20 מיקרומטר.

Discussion

בידוד ריאתי עכבר DC היא טכניקה חשובה לחקר מגוון רחב של גירויים בדרכי הנשימה. תהליך קבלת תאים אלה כולל שלבים קריטיים למנוע אובדן של תאים, כמו גם כדאיות התא וטוהר. המרוססת הריאה לפני איסוף יעזור לחסל את כל התאים הפריפריה כמו גם לצמצם את זיהום אריתרוציטים. השימוש ניתוק או?...

Materials

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
Lysing ACK חיץ	Invitrogen	D6-0005DG
אנטי עכבר CD11c (HL3)	BD Pharmingen	5580979	PE-Cy7 מצומדות
אנטי עכבר IA / IE (269)	BD-Pharmingen	553623	מצומדות FITC
Collangenase סוג 1A	סיגמא	9891-500mg
תא strainers	BD פלקון	352340, 352360
CD11c (N418) microbeads	Miltenyi	130-052-001
אני DNase	סיגמא	D5025-150KU
האנק של פתרון מאוזן מלח	Invitrogen	14170
Hepes פתרון חיץ	Invitrogen	15630
צלחות פטרי 60 מ"מ	BD פלקון	351016
GentleMACS ™ C צינורות	Miltenyi	130-093-237
Dissociator MACS עדין	Miltentyi	130-093-235
AutoMACS-Pro ™	Miltenyi	130-092-545
FASCS Aria	BD