ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Summary

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

Abstract

רבים מחלות עיניים תורשתיות הרסנית לגרום לעיוורון מתקדם ובלתי הפיך, משום שבני אדם לא יכולים להתחדש גוסס או חולה הנוירונים ברשתית. לעומת זאת, דג הזברה הרשתית מבוגר בעל יכולת חזקים כדי להתחדש באופן ספונטני כל הכיתה עצבי הולך לאיבוד במגוון רחב של דגמים שונים לנזק ברשתית, כולל לנקב רשתית, אבלציה כימית, חום גבוה ומרוכז, וטיפול אור חזק ^1-8. המעבדה שלנו מאופיין בהרחבה התחדשות של photoreceptors בעקבות טיפול קבוע אור עז נוירונים ברשתית הפנימי לאחר intravitreal ouabain זריקה ^{2, 5, 9.} בכל המקרים, תושב גליה מולר להזין מחדש את מחזור התא לייצר אבות העצבית, אשר ממשיכים להתרבות ולהעביר את שכבת הרשתית תקין, שבו הם להתמיין הנוירונים לקוי.

אנו מאופיינים חמישה שלבים שונים במהלך רגנרציה של אור Damaהרשתית GED שהיו מודגשת על ידי התגובות הסלולר ספציפיים. זיהינו מספר גנים הביע דיפרנציאלי בכל שלב של התחדשות רשתית על ידי ניתוח ה-mRNA microarray ^10. רבים מן הגנים האלה הם גם קריטי להתפתחות העין. כדי לבדוק את תפקידו של גן כל מועמד / חלבון במהלך רגנרציה רשתית, עלינו לפתח שיטה תנאי להגביל את הביטוי של החלבון מועמד רק בזמנים במהלך רגנרציה של הרשתית מבוגר.

Oligos Morpholino נמצאים בשימוש נרחב ללמוד אובדן תפקוד של חלבונים ספציפיים במהלך הפיתוח של דג הזברה, Xenopus, אפרוח, עכבר, וגידולים xenografts אנושי ^11-14. אלה basepair שונה oligos עם רצף RNA משלים או לחסום את שחבור או התרגום של רנ"א היעד. Morpholinos יציבים בתא והוא יכול לחסל או "מציאה" חלבון ביטוי במשך שלושה עד חמישה ימים ^12.

כאן,אנו מתארים שיטה יעילה ביטוי חלבון מטרה מציאה ברשתית דג הזברה מבוגר. שיטה זו מעסיקה lissamine-tagged morpholinos antisense כי הם שהוחדר לתוך הזגוגית של העין דג הזברה מבוגר. בעזרת מלקחיים אלקטרודה, morpholino הוא electroporated מכן לתוך כל סוגי התאים של הרשתית הגב מרכזי. Lissamine מספק את האחראי על morpholino עבור electroporation וניתן דמיינו להעריך את הנוכחות של morpholino בתאי הרשתית.

מציאה מותנה ברשתית יכול לשמש כדי לבחון את התפקיד של חלבונים מסוימים בזמנים שונים במהלך רגנרציה. בנוסף, גישה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של חלבונים ספציפיים ברשתית ניזוק, בתהליכים כגון התמרה חזותית עיבוד חזותי נוירונים מסדר שני.

Protocol

1. Morpholino הכנה:

1. כל oligos morpholino צריכה להיות אישית מעוצבת והורה דרך GeneTools (Philomath, OR). אנו משתמשים באופן חיובי טעון lissamine-tagged morpholinos לכונן morpholinos electroporated לכיוון האלקטרודה השלילית. ניסינו, ללא הצלחה, יעד שלילי טעון והעמסת-tagged morpholinos אל האלקטרודה החיובית באמצעות טכניקה זו. מדולל 300 nmol של morpholino לתוך 100 μl מים nuclease ללא להניב פתרון 3 מ"מ. Aliquot morpholino לתוך פרפין אטום צינורות מרובים microcentrifuge. אחסן הרחק אור בטמפרטורת החדר.
2. קבע את ריכוז morpholino על ידי דילול 5 μl של morpholino (או מים המשמשים לדלל את morpholino כמו ריק) ב 95 μl של 0.1 N HCl. קבע את אורך הגל ספקטרופוטומטר (λ) עד 265 ננומטר. חשב את קבוע morpholino באמצעות המשוואה הבאה:
   
   משקל קבוע = מולקולרית מיוחדת morpholin שלךo X 1000/molar ספיגת.
   
3. תוכלו למצוא את משקל מולקולרי ונתונים על ספיגת טוחנת את גיליון "אוליגו מאפיינים" מסופק עם כל morpholino. נתח את ריק כדי לוודא קריאה בסיסית לקחת קריאות של כל morpholino בדילול מלא. הכפל את ספיגת ב 265 ננומטר של כל morpholino נקבע על ידי קבוע שלה על ידי פקטור התימהול כדי לקבל את ריכוז ng / μl. מחלקים את המספר הזה על ידי משקל מולקולרי כדי לקבוע את הריכוז מ"מ. לדלל את morpholino, במידת הצורך, כדי ריכוז בעבודה.

2. הסרת השכבה הקרנית החיצונית:

1. הרדימי 6-12 מבוגר בן חודש דג הזברה ב Tricaine או 2-phenoxyethanol על 1.0 מ"ג / מ"ל ​​מים טנק דג הזברה.
2. לעטוף דג הזברה תוך לחלח פיסת מגבת נייר, המכסה את הזימים, אבל משאיר בעין חשופה. דג עטוף ממוקם תחת stereoscope ואת ההגדלה הוא גדל עד קוטר של העין ממלא כשליש שלשדה הראייה (איור 1).
3. שימוש דומון # 5 פינצטה, לתפוס את הקרנית החיצונית ליד הסדק אופטיים. רקמה זו היא בצבע אדום מסומן "OC" באיור 1. יש בליטה קלה או שפתיים מסומנים בחץ שכותרתו "CL". משוך בזווית נמוכה (כלומר 10 מעלות) על פני העין להסיר את הקרנית החיצונית. עם תרגול, זה יכול להסתיים בתנועה אחת. אם להחליק פינצטה, לתפוס מחדש את רקמת ושוב למשוך בזווית נמוכה עד הוסרו. קרנית היטב המצורפת יכולה לגרום לעין להיעקר מהשקע כאשר שלף. אתה יכול לשמור את העין מן המועתקת ידי מייצבת עם קבוצה נוספת של פינצטה.

3. חיתוך הקרנית הזרקת morpholino:

1. מיד לאחר הסרת הקרנית החיצונית, לעשות חתך קטן בקרנית היכן התלמיד עונה על קשתית (איור 2). הדבר נעשה באמצעות להב ספיר אזמל (ראו חומרים).
2. טען 0.5 μl של הפתרון mM morpholino 3.0 לתוך Hamiltעל מזרק מצויד במד 33 נשלף, בוטה לקצה המחט (ראו חומרים). פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר בתוך הקו. בזהירות להכניס את המחט אל תוך הזגוגית דרך חתך (איור 2). אל תכניס את המחט עמוק מדי או שאתה תהיה לנקב את הרשתית או לעקור את העדשה.
3. לאט לאט להזריק את הפתרון morpholino לחלל vitreal. בהתאם לגיל של הדג, המרחב vitreal תקיים ~ 0.5 μl. אתה צריך לדמיין זגוגי צבוע דולף מתוך החתך כפי שהוא שנעקרו על ידי הפתרון morpholino. עד להזריק כמות קטנה של דליפות morpholino פתרון מתוך החתך. אתה צריך בבירור לדמיין את morpholino lissamine-tagged בתוך העין.
4. בעקבות הזריקה, להחזיר את הדגים לאקווריום להתאושש. בדרך כלל אנחנו רק להזריק את עינו השמאלית, תוך שימוש בעין ימין כפקד uninjected, אבל electroporation של שתי העיניים אפשרי.

4. Electroporation:

1. הבאהזרקה של דגים כ 10, מחדש להרדים דגים מוזרק ועוטפים אותו בחתיכת לחלח של מגבת נייר, רק מכסה את הזימים, אבל משאיר בעין חשופה. מעבירים את הדג בצלחת פטרי. לבשי כפפות לטקס או דומה, כדי למנוע חשיפה ההרדמה. בעוד מחזיק בעדינות את הדגים אל החלק התחתון של התבשיל, למלא את הצלחת עם הרדמה (איור 3, פאנל משמאל).
2. 3 מ"מ בקוטר צלחת פלטינה אלקטרודה (ראו חומרים) localizes פולסים electroporation למחצית בקירוב של הרשתית. אנחנו בדרך כלל המטרה הרשתית הגבי. לחץ בעדינות את האלקטרודה החיובית כלפי מטה על מחצית הגחון של העין. עם הקרנית החיצונית מוסרת, העין בקלות לסובב, חושף את החלק הגבי של העין.
3. אמנם עדיין לוחצת על הצד הגחוני של העין, במקום אלקטרודה שלילית ליד (~ 1-2 מ"מ) חצי הגב החשוף של העין. היזהר שלא לגעת אלקטרודה שלילית ישירות לעין, אשר תגרום נזקהרשתית הגבי. ברגע שאתה לקבוע את המרחק הראוי בין האלקטרודות, השתמש בורג התאמה על ידית של אלקטרודות, כדי לשמר את התפשטות כאשר electroporating. דבר זה שומר את האלקטרודה השלילית המרחק האופטימלי של גלגל העין, כאשר האלקטרודה החיובית נלחץ מטה בעמדה.
4. Electroporate את העין באמצעות Electroporator CUY21 Square Wave (ראו חומרים). הפרמטרים electroporation יש להגדיר שני ברציפות של 50 msec קטניות, ב V 75 עם הפסקה 1-sec בין פולסים.
5. חזור דגים לאקווריום. אנחנו בדרך כלל מתחילים פרוטוקול שלנו ניוון אור המושרה קבוע ברשתית מיד לאחר electroporation.

5. נציג תוצאות:

1. במשך 3-5 ימים לאחר electroporation (בהתאם ליציבות morpholino), את התווית lissamine ניתן דמיינו בכל שכבות הרשתית ברשתית מחולק (איור 4). זו משמשת אישור נוכחות שלשכותרתו morpholino.
2. אנחנו יכולים להשיג מציאה חלבון מלא עד 3-5 ימים לאחר electroporation, בהתאם ליעילות של morpholino (איור 5). בדרך כלל, במהלך לימודי טיפול באור, אנחנו הקציר עיניים 3 או 4 ימים לאחר electroporation morpholino. הדבר נעשה על ידי הסרת העין כולה עם מלקחיים דומון # 5B עם קצוות מעוגלים (איור 6; חומרים) ועיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה ^15. כמו עם טכניקה כל מציאה, הפגנה של מציאה יעיל יש להראות על מנת לאמת את הפנוטיפ. לכן, אנו ממליצים antisera השגת חלבון העניין שלך. לחלופין, אם הנוגדן אינו זמין ואת morpholino מופנה גם את acceptor אחוי או אתר התורמות mRNA מראש, זה יחסום שחבור יעיל של ה-mRNA. במקרה זה, ניתן להשתמש הפוכה transcriptase-PCR כדי להגביר את רצפי איגוף ב RNA morphant ולקבוע את היעילות של חסימת splic נורמלידפוס ing.
3. כאשר הרשתית הם מחולק מן האף אל הזמני על הציר הגבי הגחון, את הקופסאות הכחולות מוצל (איור 6) מייצג את אזורים של הרשתית אשר ניזוקים לרוב מהאירוע electroporation עצמו. תיבת ורוד מוצל מייצג את האזור כי הוא ממוקד מבוא morpholino לתאי הרשתית על ידי electroporation.

באיור 1. סכמטי המתאר את הסרת שכבות האפיתל של הקרנית. הלוח השמאלי מציג את המאפיינים המבניים העיקריים של העין, כולל העדשה (L), הזגוגית (Vit), הרשתית (R), את הקרנית החיצונית (OC), את הקרנית הפנימית (IC), ואת בליטה קרנית ( CL). האוריינטציה של העין מוצג בפינה הימנית התחתונה של הפאנל הראשון מסומן קדמית (A), אחורי (P), הגבי (ד), ועל הגחון (V). צבע אדום מעיד על הקרנית החיצונית מוסר. הפאן השני אל מראה כיצד מלקחיים המשמשים לתפוס את הבליטה הקרנית למשוך את הקרנית החיצונית על פני העין בזווית נמוכה (לוח ג'). הפאנל הימני מראה כיצד זוג נוסף של מלקחיים ניתן להשתמש בעין יציב תוך משיכת הקרנית.

באיור 2. סכמטי של המעורבים הזריקה intravitreal של morpholino. חתך קטן עשה בעין היכן התלמיד עונה על איריס (פאנל משמאל). הפער שנוצר צריך להיות גדול מספיק עבור 33 מחט מד, אשר מתמלא הפתרון morpholino, להיות מוכנס (פאנל באמצע). לאט לאט להזריק 0.5 μl של פתרון לתוך הזגוגית (פאנל מימין). אתה צריך לדמיין כמות קטנה של פתרון vitreal לצאת החתך כמו הזגוגית מוחלפת בחלקה על ידי עם lissamine-tagged morpholino (פאנל מימין).

ig3.jpg "/>
באיור 3. סכמטי של ההליך electroporation בכלל. הדגים בהרדמה, אשר הוזרקו intravitreally עם morpholino, עטוף בעדינות במגבת נייר לחה (פאנל משמאל). מגבת נייר יש לכסות את הזימים, אך לא לחסום את העין (פאנל באמצע). לחץ בעדינות את האלקטרודה החיובית על החלק הגחוני של העין, מה שמאפשר חצי הגבי של העין כדי לסובב מתוך השקע. מניחים את האלקטרודה השלילית כ ​​1 מ"מ מהמחצית הגבי של העין ולהתחיל את electroporation (פאנל מימין).

איור 4. תמונה Confocal השוואת הרשתית electroporated ללא intravitreally הזרקת lissamine-tagged morpholino (א), וכן ברשתית מוזרק intravitreally ו electroporated עם lissamine-tagged morpholino (B). התווית lissamine נמצא בכל שכבות הרשתית סוגי תאים. ROS, מוט החיצונימגזרים; שכבת ONL, הגרעין החיצונית, שכבת INL, הגרעין הפנימי; GCL, תא שכבה גנגליון.

איור 5. תמונות Confocal השוואת immunolocalization PCNA ב הרשתיות electroporated עם morpholino שליטה (פאנלים משמאל) הרשתיות electroporated עם morpholino אנטי PCNA (לוחות מימין) לפני מותו אור המושרה תא photoreceptor. Dark המותאמות דג הזברה לבקן מבוגר הושמו אור חזק מתמיד 1, 2, או 3 ימים לאחר electroporation של morpholino. Morpholino השליטה לא להדחיק ביטוי PCNA גוברת אור פגומים הרשתיות. אנטי PCNA morpholino ביעילות הפילו הביטוי PCNA חלבון דרך שלושה ימים של נזק קבוע אור חזק.

סכמטי באיור 6. (פאנל משמאל) מראה enucleation של העין עבור processing ו cryosectioning, אשר נעשית לאורך הציר הגבי הגחון. תיבת מוצל ורוד (פאנל מימין) מראה את האזור ברשתית עם הסכום הגדול ביותר של חלבון מציאה באמצעות טכניקה זו. תיבות מוצלות כחול מייצגים אזורים שנפגעו לרוב על ידי האירוע electroporation. האוריינטציה של העין מתויג קדמית (A), אחורי (P), הגבי (ד), ועל הגחון (V).

Discussion

לאחרונה, שני ניתוחים microarray בדקו את ביטוי הגנים השינויים שחלו במהלך רגנרציה של הרשתית או אור פגום או תיקון רשתית בניתוח נכרת ^{10, 16.} שני המחקרים גילה גנים רבים אשר הציג שינויים משמעותיים הביטוי, או להגדיל או להקטין, כי סביר נדרשים עבור אירועים שונים המתרחשים במהלך התחדשות הרשתית, כגון כניסה מחדש של גליה מולר לתוך מחזור התא, המשך התפשטות והגירה של אבות העצבית על השכבה הרשתית פגום, ואת הבידול של אבות העצבית לסוג התא לתקן את עצבי. אמנם השוואה ישירה של שתי קבוצות microarray נתונים לגלות גנים מועמדים שעשויים להיות מעורבים האירועים הללו הסלולר, בסופו של דבר הגנים הללו החלבונים המקודדים שלהם חייבים להיבדק כדי לקבוע אם הם נחוצים התחדשות הנוירונים. כאן, אנו מתארים גישה חזקה אובדן-of-פונקציה conditionally מציאה חלבונים עניין ברשתית דג הזברה מבוגר. טכניקה זו שימשה ללמוד שני חלבונים תאיים ו תאיים, וכן מולקולות איתות, גורמי שעתוק וחלבונים הדרושים שכפול הדנ"א ^17-19. לכן, שיטה זו סייעה רבות להבנת המנגנון המולקולרי שבבסיס התחדשות הרשתית הבוגרת דג הזברה.

בדקנו פרמטרים electroporation מרובים (, מתח מספר פולסים, זמן בין הפולסים), לפני פרוטוקול מוצלח הושג. בדו"ח הקודם של electroporating morpholinos לתוך סנפיר הזנב דג הזברה התחדשות בשימוש 10 פולסים במתח נמוך (15 V) ^20. מכיוון הרשתית דג הזברה מבוגר מוקף שכבות תאים מרובים אינו נגיש בקלות אלקטרודות פינצטה, הפרמטרים המשמשים סנפיר צלחו בשעה ביעילות electroporating morpholinos לתוך הרשתית מבוגר. לעומת זאת, מתח גבוה (100 V) לעיתים קרובות מילulted מוות לדגים. לאחרונה, 5 פולסים של 80 V תוארה electroporate פלסמיד דנ"א לתוך הרשתית עכבר שזה עתה נולד גור ^21. מצאנו כי מעט פחות אינטנסיבי 2 פעימות של 75 הביא V ב electroporation מוצלח של morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה מבוגרים עם הישרדות של 100% מהדגים טופלו. בנוסף, גילינו כי הסרת החיצונית ביותר (או החיצונית ביותר) מרכיב של הקרנית בצורה ניכרת את יעילות electroporation. הגדלת מספר פעימות עשוי לבטל את הצורך הסרה של רקמה זו, אך עלולים גם הם לגרום נזק לרקמות גדולה יותר. מחקרים מקיפים הראו כי שליטה בפרמטרים הללו לא גרמו למוות משמעותי כל תא ברשתית או לשנות את התגובות הסלולר ספציפיים שנצפה במהלך photoreceptor התחדשות ^19. Gain-of-לתפקד בלימודים אינם אפשריים כיום באמצעות טכניקה זו in vivo, בשל חוסר היכולת שלנו באופן עקבי electroporate חומצות ריבונוקלאית גדול לתוך כל retinal תאים. עם זאת, ההצלחה של electroporating פלסמידים לתוך הרשתית עכבר in vivo ו הרשתית דג הזברה ב explants מציע זה עדיין אפשרות של דג הזברה ^{21, 22.}

אחד היתרונות של טכניקה זו היא electroporation נראה ביעילות להציג את morpholino לתוך כל סוגי תאים ברשתית. עם זאת, חולשה פוטנציאלית היה electroporation ביעילות סיפק את morpholino לתוך רק באזורים ברשתית הגב מרכזי. אירוע electroporation second לקראת המחצית הגחון של תוצאות הרשתית בשנת מיקוד טוב כל השכבות, אבל לעתים קרובות גורם לנזק. זו מגבלה מרחבית סביר נבעה הצורה והמיקום של האלקטרודות. השימוש אישית מעוצבת בצורת כוס אלקטרודות שניתן להציב סביב העין עשוי לשפר את החולשה הזאת. זו מגבלה המרחבי של מסירת morpholino מגביל את השימוש בטכניקה זו מונע את השימוש של suc assayh כמו ניתוח ERG כי ידרוש הערכה גלובלית של הרשתית. יצוין כי כמו כל ניסוי morpholino, רצוי לאשר את התוצאות באמצעות שנייה, שאינן חופפות morpholino ל-mRNA היעד. במקרים מסוימים, ניתן גם electroporate two morpholinos שונים בו זמנית מציאה את הביטוי של שני חלבונים שונים. הראינו את זה על ידי דריסה ביטוי הן את Pax6a וחלבונים Pax6b, בנפרד או ביחד ^18.

למרות שאנו הדגימו את השימוש בטכניקה זו עם מודל נזק האור שלנו, זה יכול להיות בשימוש סביר ללמוד התחדשות במודלים של נזק אחר ^2-8 או להשתמש כדי לבחון את תפקודם של חלבונים פגומים ברשתית. לדוגמה, electroporation של morpholinos יכול לשמש מציאה הביטוי של ערוצים ספציפיים או התמרה מולקולות איתות בתוך הגנגליון או תאים amacrine ולאחר מכן ללמוד את הפונקציה של אותות אלההמסלולים בעיבוד חזותי. עם זאת, כפי morpholinos רק להשפיע על התרגום של חלבון חדש, אפשר היה לחכות עד מחזור חלבון אנדוגני מתרחשת לפני assay ניתן לבצעו. תלוי ביציבות של החלבון, שיכול לנוע בין ¹⁸ שעות עד ימים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
CUY21-EDIT או CUY21-SC Square גל electroporator	Protech הבינלאומי	CUY21EDIT או CUY21SC	יחידות שניהם עובדים עבור פרוטוקול זה
3 מ"מ קוטר ההנעה אלקטרודות	Protech הבינלאומי	CUY 650-P3
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino צריכים להיות מותאמים אישית שנועדו חלבון העניין שלך
2-Phenoxyethanol	סיגמא	77861-1L	הרדמה: 1:1000 לדלל במים מערכת דגים ההליך, 1:500 עבור המתת חסד
דומון # 5 פינצטה	העולם מכשירים Precision	14095	כל # 5 פינצטה עם העבודה
דומון # פינצטה 5B עם טיפים זוויתי	העולם מכשירים Precision	500234	משמש המתת חסד העין enucleate הבאה
ספיר להב, קצה כפול רומח, 1 מ"מ רחב, עם ידית סכין ספיר	העולם מכשירים Precision	Blade: 500314 לטפל: 500317
המילטון עם מזרק נשלף 33 מד בוטה סוף מחט	המילטון החברה	מזרק: 87930 מחט: 7762-06	הסר את מחט המזרק שמגיע עם ולהחליפו 33-מד בוטה קצה מחט