אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים

Summary

טכניקת קלם הותאמה לנתח מורפולוגיה ultrastructural של קרומים, האברונים, ומבני subcellular מושפעים מולקולות microinjected. שיטה זו משלבת טכניקות רבות העצמה של המיקרומניפולציה / microinjection, מיקרוסקופיה confocal ניאון, וכן במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאפשר מילימטר לרזולוציה רבה ננומטר. טכניקה זו היא נוחה למגוון רחב של יישומים.

Abstract

תא האיקריוטים מסתמך על מורכב, פיקוח הדוק, ותאים כפותים קרום תפקודי שונים שישמרו קוטביות צורך ביוכימי לתפקוד תאי תקין. הבנה כיצד אנזימים, חלבונים ורכיבי cytoskeletal למשול ולשמור על פרדה ביוכימי זה היא אפוא בעלת חשיבות עליונה. השימוש במולקולות מתויגות fluorescently למקם ו / או תאים subcellular יפריעו הניבו שפע של ידע וההבנה מתקדמות של רגולציה הסלולרית שלנו. שיטות הדמיה כגון מיקרוסקופיה confocal ניאון ולהפוך את בירור עמדתו של מולקולה מתויגת fluorescently קטנה פשוטה יחסית, עם זאת הרזולוציה של מבנים קטנים מאוד מוגבלת ^1.

מצד השני, מיקרוסקופי אלקטרונים חשף פרטים של מורפולוגיה subcellular ברזולוציה גבוהה מאוד, אבל אופי סטטי עושה את זה קשה למדוד פרו דינמי מאודcesses עם דיוק ^2,3. לפיכך, שילוב של מיקרוסקופ אור במיקרוסקופ אלקטרונים שלו המדגם, אור גומל כינה ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ^4,5, מעניק את היתרונות הכפולים של הדמית ניאון ultrafast עם הרזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה אלקטרונית ^6. טכניקה רבה עצמה זו יושמה כדי ללמוד על היבטים רבים של ביולוגיה של תא ^5,7. מאז הקמתה, הליך זה גדל יכולתנו להבחין ארכיטקטורות ומורפולוגיות subcellular ברזולוציה גבוהה.

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לביצוע microinjection המהיר ובעקבות קלם (1 איור). הליך קלם microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את הכמויות ספציפיות של מולקולות קטנות ו / או חלבונים ישירות לתוך הציטופלסמה תא האיקריוטים ולחקור את ההשפעות ממילימטר לרזולוציה רב ננומטר (איור 2). הטכניקה מתבססת על microinjectingתאים גדלו על coverslips הליזר החרוט זכוכית gridded מודבק בתחתית של מנות תא חיים והדמיה עם שניהם מיקרוסקופיה ניאון ואלקטרון confocal. לוקליזציה של התא (הים) של עניין היא בנחייתם של דפוס הרשת, המועבר בקלות, יחד עם התאים של עניין, לשרף EPON משמש לקיבוע של דגימות וחתך לפני הניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים (3 איור). כיסוי של הניאון וEM תמונות מאפשר למשתמש לקבוע את לוקליזציה subcellular כמו גם שינויים מורפולוגיים ו / או ultrastructural הנגרמים על ידי מולקולת microinjected ריבית (איור 4). טכניקה זו היא נוחה לנקודתי זמן שנעו בין 5 ≤ של עד כמה שעות, בהתאם לאופי של מדגם microinjected.

Protocol

1. תרבות של תאי יונקים

1. כליות חולדה רגילות (NRK), הונצחו סרטן צוואר רחם (הלה), או שורות תאים אחרות מתאימות יונקים מתורבתים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, על coverslips gridded זכוכית המודבקת photoetched לחיות מנות סלולריות (ראה טבלת מס '1 לכל מגיב או מנגנון השתמש בפרוטוקול זה) בDMEM + 10% FBS ו 1% עט / דלקת. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי לשמור על סביבת סטרילית בעבודה עם תאי יונקים בתרבית.
2. בהתאם לקו זמן הניסוי שלך (0-5 שעות לעומת הזרקת הודעת ימים 1-2) confluency של תאים צריך להיות מותאם ל~ ~ 50% או 25%, בהתאמה.

2. Microinjection

1. הכן את החלבון רצוי, ה-DNA, או מולקולות קטנות בבחירה של חיצך, בהתאם amenability לתרבות התאית, לנפח סופי של μl ~ 50. צבעי ניאון אינרטי כמו טקסס אדומה או כחול אשדכלולים כדי לסמן את תאי microinjected; בחירה של צבע וזריקת חללית ניאון צריכה עירור שאינם חופף ואורכי גל פליטה. הריכוז של המולקולה של העניין הדרוש לmicroinjection צריך להיקבע באופן אמפירי, ואת צבעי ניאון המעקב משמשים בדרך כלל ב0.5-1.0 מ"ג / מ"ל. בדרך כלל, rhodamine או fluorophore אחר מצורף קוולנטית למולקולה של ריבית באמצעות ערכה מסחרית שלך, אך שיטות אחרות לזיהוי ניתן להשתמש בהתאם לרגישות. לקבלת מידע נוסף, ראה שיקולים קריטיים בהמשך.
2. סנן injectant (~ 50 μl) דרך מסנן 0.22 מיקרומטר צנטריפוגלי. מסננים צנטריפוגליות עדיפים על ואקום ו / או סינון המזרק שקשר כרכים מתים.
3. כדי להפיק את מחט microinjection, pipettes הזכוכית ורוסיליקט הם משכו באמצעות בmicropipette חולץ הנחיות יצרנים באים Flaming-Brown. לחלופין, microinjectionמחטים ניתן לרכוש מספקים כולל אפנדורף שהופך את מחטי microinjection femtotip.
4. זהירות פיפטה μl 4 של injectant לסוף בלי ההפרעה של מחט microinjection באמצעות 20 Femtotips Eppendorf. ודא שלא נמצאות בתוך בועות מחט microinjection משך. טען מחט microinjection לתוך זרוע micromanipulator של אפנדורף FemptoJet Injectman המחובר למיקרוסקופ הפוך. לסקירה טובה של הליך microinjection, הקורא מופנה ליומן קודם של מאמר ניסויים דמיינו ^8.
5. הנח צלחת תא חייה עם coverslip gridded ותאים בתרבית לבעל התבשיל של מיקרוסקופ Zeiss ההפוך. מצא את גידול תאים בתוך רשת photoetched ולציין את מזהת אלפאנומרי רשתות, זה יהיה בשימוש בכל השלבים הבאים. באופן אידיאלי, לאתר תאים במרכז coverslip כשלבים באים יגבילו העברת דגימה בקצוות של coverslip.
6. זרוע ידנית נמוכה הזרקה למקום על coverslip, ובאמצעות ג'ויסטיק micromanipulator ופקדים, מחט זריקה יותר למטה עד שהקצה נוגע בעדינות את פני השטח של התאים בתרבית ולהגביל 'העיתונות כדי למנוע תנועה של מחט מעבר לנקודה זו וכך שבר שביר משך זכוכית ורוסיליקט. כל ההיבטים האחרים של microinjection תא מבוצעים לפי הוראות שימוש InjectMan FemtoJet אפנדורף. טכניקת microinjection שמשה לאחרונה להבין חלבונים מופרשים ארסיים בודדים מ ⁹ חיידקים.
7. Microinject כל תא אחר ברשת שנבחרה. עם התאים גדלו ב ~ 50% confluency, ניתן לצפות ~ 80 תאים ^ל2 רשת מיקרומטר 600 (דוגמה באיור. 3A). לפיכך, על בדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרונים, יהיה n של ~ ניסיוני 30-40 ותאי בקרה.
8. הנח צלחת חייה תאים בחזרה לתוך תא תרבות חממה ליונקים רצוייםזמן כפי שהוכתב על ידי ההתקנה הניסיונית. לחלופין, אפשר להמשיך ישירות מmicroinjection לניתוח מיקרוסקופיה זמן לשגות להמתין להופעה של מבני subcellular מסוימים של עניין לפני הקיבעון.

3. מיקרוסקופיה פלורסנט

1. אם תרצה, לבצע מדידות קרינה חיות תאים זמן לשגות של תאי microinjected, לאחר ש, החלף את התקשורת עם glutaraldehyde 2.5% בחיץ 0.1 מ 'cacodylate (pH 7.4) ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. עם זאת, אם מדידות לחיות סלולריות אינן נדרשות, להשליך תקשורת צמיחת תאים ולתקן את התאים עם 5 המ"ל פורמלדהיד 3.7% ב1xPBS בטמפרטורת חדר במשך 10 דקות. השלך מקבע ולהחליף עם 5 1xPBS מ"ל, המשך לשלב 3.2. הערה: זה קריטי שלא להוסיף glutaraldehyde עד לאחר מיקרוסקופ פלואורסצנטי הושלם.
2. הנח את הצלחת חייה תאים עם coverslip gridded photoetched במיקרוסקופ פלואורסצנטי (confocal אינו נדרש לthiצעד הים) ולאסוף שדה בהיר 5-10 ותמונות ניאון של הרשת המתאימה כדי לתעד את הסידור של התאים (איור 4 א). לזהות תאים אלה שכבר microinjected באמצעות אורכי גל העירור ופליטה של צבע הזרקת אינרטי (איור 4 ב). זה חשוב כדי להשיג תמונות בהגדלה שונה (לדוגמא 10x ו65x) כדי להקל על זיהוי של תאי microinjected בשלבים הבאים כרוכים במיקרוסקופ אלקטרונים.
3. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal, לאסוף Z-מחסנית של תאי microinjected בתוך הרשת זיהתה בשלב 2.5 לעיל. הגדלה גבוהה (100x) היא זקוקות על מנת לתאם עם תמונות ניאון מבני subcellular שירצה לזהות במיקרוסקופ אלקטרונים.
4. את coverslips יוסר מתחתית כלי התא החיים עם נוזל הסרת coverslip זמין מסחרי והניח בצד את התא בצלחת תרבית תאי בתולה המכילה 5 מ"ל1xPBS. אז coverslip מעובד למיקרוסקופ אלקטרונים כמפורט להלן.

4. מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

1. החלף חיץ 1xPBS עם המ"ל glutaraldehyde 2 2.5% בחיץ 0.1 מ 'cacodylate (pH 7.4) ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. דגירה ארוכה יותר, בעוד שאין צורך, תסייע בתחזוקה של מבני subcellular. הערה: פורמלדהיד לבדו אינו מספיק לניתוח מקבע EM.
2. הסרת תאים לקביעה וכתם בתוספת המ"ל 1% tetroxide 2 אוסמיום במאגר cacodylate 0.1 מ 'למשך 30 דקות ואחרי 3 כביסות עם חיץ cacodylate ולבסוף להחליף את כל החיץ עם DDH ₂ O.
3. בעקבות פרוטוקולי EM סטנדרטיים, מייבש את המדגם בסדרה מדורגת (70% עד 100%) של אתנול. הכן את שרף EPON וcoverslip מקום תא בצד על גבי צינור שרף מלא EPON. אפשר פילמור ל24 שעות ב 60 ° C. על ידי צבת coverslip gridded photoetched תא בצד לעשותwn על שרף EPON, שני התאים של עניין, כמו גם את דפוס הרשת מועבר לשרף EPON במהלך פילמור (דוגמה באיור. 3B).
4. הסר coverslips משרף EPON ידי טבילה במהירות לתוך חנקן נוזלי ו / או מים רותחים. בדוק את פני השטח של השרף בהיקף נתיחת משקפת כדי לאתר את הרשת של עניין (הערה: להג הרשת יעביר כתמונת ראי). שימוש בסכין גילוח או אזמל סטרילי, לקצץ בלוק EPON למטה כך שרק הרשת של ריבית היא בשיאו של גוש שרף EPON.
5. שימוש ultramicrotome, לרכוש חלקים סידוריים של הבלוק הגזוז בעובי הרצוי (~ 70 ננומטר עובי עבור TEM הקונבנציונלי ו~ 250 ננומטר עובי לטומוגרפית TEM). לעומת זאת סעיפים עם תצטט uranyl וציטראט עופרת בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.

5. אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים

1. מקם מחדש את התאים של ענייןמיקרוסקופ האלקטרונים באמצעות תמונות שהתקבל בשלבים מוקדמים יותר. תאי microinjected רגע של עניין אותרו, להשתמש בתמונות ניאון confocal ברזולוציה גבוהה לזיהוי אזורים בתוך התא, שהיו בעלי עניין. תמונה אלה ברזולוציה גבוהה באמצעות TEM. השתמשו באתרים כמו פריפריה ותא מעטפת הגרעין כדי לקבוע איזו תמונת הניאון Z-מחסנית מתאימה לEM לחתוך.
2. השימוש בתוכנת ההדמיה של הבחירה שלך (לדוגמה: תמונת J, Adobe Photoshop, וכו '), לצמצם את האטימות של תמונת הניאון עד 50% ולהצליב אותו על התמונה שבה הוא TEM קורלציה. ישר את התמונות על ידי התאמת סולם (זוכר להגביל פרופורציות) והסיבוב של תמונת confocal כדי להתאים את תמונת TEM. התאמות קנס לעומת זאת, חדות, וכו 'בתמונת הניאון עשויות לסייע ביישור. הערה: יש לנו מצאנו כי heterochromatin, מעטפת הגרעין, ופריפרית התא לייצג ציוני דרך מצוינים כדי לסייעבכיוון של שתי תמונות.

6. שיקולים קריטיים

1. כדי לסייע במידה רבה באיתור המולקולה הקטנה המוזרקת, ניאון תג כגון rhodamine או fluorescein יכול להיות מחובר קוולנטית באמצעות ערכות זמינות מסחרי. מידע נוסף שנרכש על ידי ביטוי חלבון פלורסנט סמן subcellular לוקליזציה לפני microinjection ectopically. לפיכך, בחירה של fluorophores ולצבוע מעקב microinjection אינרטי היא חשובה.
2. בחר תאים לmicroinjection שדבקו בסמוך למרכז של coverslip ולהימנע מבחירת רשת קרובה לקצה. זה יציג את ההסתברות הגדולה כי התאים של עניין מועברים לשרף EPON משמש למיקרוסקופ אלקטרונים.
3. Confluency של תאייחשוב, כמו צלחת confluent מלאה תעשה זיהוי של תאי microinjected במיקרוסקופ האלקטרונים הקשים מאוד. במקום זאת, תאי זרע כך שהם מגיעים ~ 50% confluency ביום ניסוי קצר, או ~ 25% confluency ביום ארוך יותר (1-2 היום) הניסוי. השתמש במיקום וצורה של התאים, כמו גם "חלל הריק כציוני דרך כדי לכוון את תמונת מיקרוסקופ האלקטרונים.
4. עובי פרוסה אופטי confocal צריך להיות מכוון לצרכי הניסוי ולכן צריך להיקבע באופן אמפירי ^10.
5. פורמלדהיד וglutaraldehyde fixatives צריך להיות בציון הגבוה ביותר הזמין. פורמלדהיד יהיה לתקן את התאים, ובכל זאת לשמר את מאפייני הקרינה של שני חלבונים ומולקולות ניאון קטנות (דוגמת rhodamine או FITC). עם זאת, זה לא לשמר את המבנים כדי לאפשר רזולוציה גבוהה EM. Glutaraldehyde משמר קרומים ומבני subcellular לרמה גבוהה לEM analyאחותי, אבל באופן משמעותי לעכב פלואורסצנטי. לכן, קיבעון שני השלבים הוא קריטי עבור שניהם פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה EM. צעד קיבעון פורמלדהיד ניתן להשמיט אם ביצוע מדידות חית תאים, כפי שניתן לבצע קיבוע סופי על ידי טיפול glutaraldehyde.

7. נציג תוצאות

הליך זה מאפשר את היכולת לספק מולקולה של עניין ישירות לתוך הציטופלסמה הסלולרי האיקריוטים ולפקח הלוקליזציה שלה ו / או השפעות על ארכיטקטורה תאית וorganeller ממילימטר לרזולוציה רב ננומטר. איור סכמטי של ההתקנה והליך הניסוי מוצג באיור 2. טכניקה זו מסתמכת על microinjection של תאים שגודלו בליזר coverslip זכוכית חרוטה gridded (איור 3 א), שאחרי מיקרוסקופיה confocal, הוא מסוגל להעביר גם את התאים של עניין, כמו גם לדפוס רשת EPON השרף (איור3 ב ').

הליך קלם microinjection אופייני מניב תמונות פלואורסצנציה וmicrographs אלקטרונים, שכאשר קורלציה, מאפשרים גם לוקליזציה subcellular וניתוח ultrastructural. תאים גדלים על coverslip gridded זכוכית photoetched הם microinjected עם מולקולה של עניין לאחר שתמונות שדה בהירות מתקבלות (איור 4 א). לצבוע מעקב אינרטי משולב להבחין תאי microinjected מתאים שאינם microinjected (איור 4 ב). Z-ערימות confocal מתקבלות באמצעות fluorophore או מזהים אחרים שצורפו למולקולה הקטנה microinjected עניין (האיור 4C). המדגם קבוע עם glutaraldehyde ומעובד למיקרוסקופ אלקטרונים. micrographs אלקטרונים מתקבלים וכיסה על גבי התאים שאליו הם מתאימים (האיור 4D). אזורי מחסה אותות ניאון נבדקים בפירוט רב יותר בהגדלה גבוהה יותר (האיור 4E ).

איור 1. ציר זמן של הליך קלם microinjection. בהתאם להגדרה הניסיונית, microinjection ומדידות קרינה יכולים להתבצע באותו היום. הכנת הדגימה למיקרוסקופ אלקטרונים היא זמן רב ביותר בשל צעדי incubations ארוכים ויימשך 2-3 ימים. ניתוח TEM וcorrelating אותות קרינה עם תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים ניתן לבצע ביום אחד.

איור 2 איור כללי של הליך קלם microinjection שלב 1:.. אתר תאים גדלים על coverslip gridded זכוכית החרוטה בליזר וmicroinject מולקולה של עניין שלב 2:.. לכידת שני תמונות שדה מוארות וערימות z ניאון confocal של תאי microinjected השלב 3: להכיןcoverslip לא.מ. ניתוח ולהטביע בשרף EPON. שימוש בדפוס רשת הועבר, לקצץ לחסום כאלה שתאים של עניין הם בשיא שלב 4:. חותך חלקים סדרתיים עם ultramicrotome שלב 5:. מתאם בין תמונות ניאון עם EM תמונות.

. איור 3 דפוס רשת מאפשר זיהוי של תאים של עניין לוח מתאר microinjection של תאים גדלו ל ~ 50% confluency;. לציין את הרשת מזהה AK. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. לוח ב 'מציג את דפוס הרשת הועבר מcoverslip על גבי בלוק שרף EPON polymerized שיהיה מחולקים סדרו לאחר שמערכת העניין מזוהית במיקרוסקופ נתיחה. לוח C מראה דפוס הרשת הועבר בהכנה לחתך . שימו לב שלהג הרשת הועבר הוא בכיוון הפוך ברחוב השרף; scalבר הדואר הוא 1200 מיקרומטר.

.. איור 4 תוצאות נציג מהאור גומל microinjection במיקרוסקופ אלקטרוני לוח תערוכות מיקרוסקופ השדה הבהיר של תאי NRK גוברים על coverslip gridded זכוכית חרוטה בליזר; חצים מצביעים על שני תאים שדמיינו ידי קלם בתקליטור לוחות לוח ב 'מציג את הקרינה. של צבע מעקב אינרטי, במקרה זה אשד כחול, המשמש לזיהוי תאים שmicroinjected. לוח C מראה את השכבה של שדה בהיר וחתימת הקרינה של מולקולת rhodamine שכותרת קטנה. שני התאים המוצגים כאן מסומנים על ידי חיצים בפנלים D & B. לוח מייצג קלם של שדה בהיר, מיקרוסקופיה ניאון ואלקטרונים;. ראש החץ מצביע puncta ניאון צלם בהגדלה גבוהה יותר בדואר לוח ברי סולם הם כfolשפל: פנלים & B, 100 מיקרומטר; C & D, 50 מיקרומטר, E, 100 ננומטר.

Discussion

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת העברה הישירה של חלבונים מטוהרים, חומצות גרעין, או מולקולות קטנות לציטופלסמה האיקריוטים ומאפשרת ניתוח אולטרה ברזולוציה גבוהה באמצעות המתאם של מיקרוסקופיה ניאון ואלקטרון. השימוש בשיטה זו הוא פשוט אך חזק וניתן לבצעו בבית עם מתקנים רבים קיימים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Coverslip Photoetched ופלייט Live-תא	מאטק	P35G-2-14-CGRD
טקסס האדומה	Invitrogen	D3329
מפל הכחול	Invitrogen	D7132
Rhodamine התיוג Kit	Thermo Scientific	53002
יחידת הסינון צנטריפוגלי מיקרומטר 0.22	Millipore	UFC30GV00
פיפטות הזכוכית ורוסיליקט	סאטר מכשירים	BF100-50-10
Micropipette פולר	סאטר מכשירים	דגם P-97	השתמש בתכנית המס '4 לאחר ביצוע בדיקת רמפה
מערכת microinjection FemtoJet	אפנדורף	Injectman NI2
נוזל להסרת coverslip	מאטק	PDCF 30 OS
מיקרוסקופ אלקטרוני ההילוכים Technai	פיי	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	ליקה	EM UC6