ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

Summary

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו מגדירים ברחם העברת גנים הטכניקה המורכבת משלושה שלבים: laparotomy העכבר הגחון, microinjection transuterine, ו In vivo Electroporation. אנו משתמשים במיקרוסקופ וידאו דיגיטלי להדגים טכניקות קריטיים העוברית ניסיוניים.

Abstract

האוזן הפנימית יונקים יש 6 epithelia חושית ייחודית: 3 cristae ב ampullae של תעלות בצורת חצי עיגול, maculae ב utricle ו שקיק, ואת האיבר של קורטי ב שבלול מפותל. Cristae ו maculae מכילים תאים שיער וסטיבולריות כי transduce גירויים מכניים כדי subserve תחושה מיוחדת של איזון, בעוד שיער השמיעה התאים איבר של קורטי הם מתמרים העיקריות לשמוע ^1. גורל התא הפירוט epithelia אלה המורפוגנזה חושית של התעלות ושל בצורת חצי עיגול שבלול להתקיים בשבוע השני של ההריון של העכבר הושלמו בעיקר לפני הלידה ^2,3. מחקרים התפתחותיים של האוזן הפנימית העכבר נעשות באופן שגרתי על ידי איסוף עוברים מהונדס בשלבים עובריים או לאחר לידה שונים כדי לקבל תובנה על הבסיס המולקולרי של הסלולרי ו / או פנוטיפים מורפולוגי ^4,5. אנו משערים כי העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח הפנימי ברחם < / Em> בהקשר של רווח והפסד של תפקודי מחקרים מייצג גישה חינם ל transgenesis העכבר המסורתי לחקירה של המנגנונים הגנטיים העומדים בבסיס האוזן יונקים הפיתוח הפנימי ^6.

פרדיגמה ניסויית לנהל misexpression מחקרים גנים באוזן העכבר פיתוח פנימי הוכיח כאן פותר לשלושה שלבים כלליים: 1) laparotomy הגחון; 2) microinjection transuterine, ו 3) ב electroporation vivo. Laparotomy הגחון הוא ההישרדות העכבר טכניקה כירורגית המאפשר החצנה של הרחם כדי לקבל גישה ניסויית על העוברים המושתלים ^7. Microinjection Transuterine הוא השימוש, micropipettes משופעים זכוכית נימי להציג את הביטוי הפלסמיד לתוך לומן של שלפוחית ​​otocyst otic או. בחי electroporation הוא יישום של גל מרובע, קטניות השוטפות הניתנות באופן ישיר לנהוג ביטוי הפלסמיד לתוך ^8-10 ובתאים.

התחת = "jove_content"> אנחנו קודם לכן תיאר את electroporation מבוססת טכניקת העברת גנים כלל הערות מפורטות על כל צעד של פרוטוקול ^11. טכניקות עכבר העוברית הניסוי יכול להיות קשה ללמוד פרוזה תמונות סטילס בלבד. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את 3 השלבים בהליך העברת גנים. הכי קריטי, אנחנו לפרוס מיקרוסקופיה וידאו דיגיטלי להראות בדיוק איך: 1) לזהות את האוריינטציה העובר ברחם; 2) לארגון מחדש של עוברים למיקוד זריקות כדי otocyst; 3) microinject DNA מעורבב עם פתרון צבע נותב אל otocyst על ימים עובריים 11.5 12.5: 4) electroporate otocyst מוזרק, ו 5) עוברים תווית electroporated לבחירה לאחר הלידה בלידה. אנו מספקים דוגמאות מייצגות של האוזניים הפנימיות transfected בהצלחה: מדריך מצולם על הסיבות השכיחות ביותר של Mistargeting otocyst, לדון כיצד ניתן למנוע טעויות מתודולוגיות משותפות וכן הנחיות לכתיבת הנוכחיים ברחם גרםטיפול בבעלי חיים מז העברת הפרוטוקול.

Protocol

1. הגחון laparotomy

1. להרדים סכר אשר עוברים נמצאים היום העוברית 11.5 (E11.5: בצהרי היום תוסף הנרתיק הוא מזוהה היום 0.5 של ההתפתחות העוברית) בזריקה intraperitoneal של פתרון pentobarbital נתרן הרדמה (7.5 μL לכל גרם משקל גוף). עבודה ההרדמה: 180 μL של 50 מ"ג / מ"ל ​​נתרן פתרון pentobarbital: 100 μL של אתנול מוחלט; 320 μL של 65 מ"ג / מ"ל ​​מגנזיום סולפט מימית (מודולציה הטון הרחם), ו 400 μL של פרופילן גליקול (בליל רכב עם מימית ואורגנית רכיבים).
2. להעריך את השלמות של הרדמה על ידי ביצוע בדיקות גירויים רעילים: לסחוט כפה, קמצוץ הזנב, והוא כהרף בתגובה למגע הלחי vibrissae. החל משחת עיניים סטרילית את קרניות.
3. לגלח את הפרווה מאזור הבטן suprapubic אל כלוב הצלעות עם המזמרה ולהב בסדר (אוסטר # 40 להב). לחטא את הבטן עם אתנול 70%, יוד povidone 10% (בבטאדין),ND אתנול 70%, ברצף. במקום העכבר הבטן בצד על וילון סטרילית ולאחר מכן הגדר על כרית חימום או צלחת חמה (37 מעלות צלזיוס) במשך 2-5 דקות.
4. לחתוך את העור בטן קו האמצע הגחון עם הכדור שקצהו מספריים. להרחיב את החתך של 10-14 מ"מ. זהה את Linea alba, avascular, רקמת חיבור פס לבן לאורך קו האמצע הגחון של דופן הבטן. לחרות Linea alba עם הכדור היטה מספריים ולהרחיב מ"מ 10-14 החתך. מיד להשקות את הבטן עם prewarmed (37 ° C) פתרון של לקטט רינגר.
5. מחצינים את שתי קרני הרחם עם מלקחיים הטבעת בלי הפעלת לחץ מופרז על אתרי ההשתלה. להשקות את קרני הרחם מוחצנים עם פתרון, prewarmed לקטט רינגר.

2. Transuterine Microinjection

1. לפברק עבה קירות, זכוכית בורוסיליקט נימי microinjection פיפטה עם המאפיינים הבאים: 12-16 μמ 'קוטר חיצוני ו שפוע 20 מעלות. על חולץ P-97 פיפטה סאטר עם נימה קופסה קטנה, השתמש בתוכנית הבאה: חום = מבחן כבש בתוספת 3 יחידות, לחץ = 200; למשוך = 0; מהירות = 46; זמן = 100). עם beveler סאטר BV-10, השתמש בדיסק 104C (זהב) שוחקים עבור בטפי להחדרת נוזלים בקוטר גדול. הביטוי Resuspend פלסמיד ב מיקרוגרם μL 3-4 / ב סידן פוספט חינם שנאגרו מלוחים (pH 7.2-7.4). הוסף ירוק מהיר גבישי מערבולת ריכוז ה-DNA, בעדינות למשך 30 שניות, מסתובבים גרם 10,000 למשך 10 שניות. כמות מינימום של ירוק מהיר נדרש חזותית לעקוב אחר היעילות של הזרקת נקבע באופן אמפירי. לגבות את פיפטה beveled עם ה-DNA / פתרון ירוק ומהירה. חבר את הצינורית microinjection טעון לבעל פיפטה של ​​לחץ ההזרקה (Picospritzer באמצעות> חנקן טהור 99% כגז מקור).
2. Transilluminate הרחם בעוצמה נמוכה, אור הלוגן לדמיין את העובר בתוך אתר ההשתלה שלה. זהה את ביהטינג לב, שלפוחית ​​המוח, ניצנים הגפיים, החדר המתהווה 4 של ^ה למוח האחורי, והעין. להשקות את הרחם כל 2 דקות עם prewarmed, לקטט הפתרון של רינגר לשמור על הידרציה. להפעיל לחץ עדין על הרחם לארגון מחדש של העובר ולזהות את ציוני דרך אנטומיים שצוין לעיל.
3. אוריינט העובר לזהות את הווריד ראש העיקרית אשר הקדמי ואת האחורי האגף סניפים בשטח mesenchymal שבו otocyst מתגורר. Otocyst נכונה לא ניתן לראות על ידי שקוף של הרחם. Otocyst ממוקם באמצע הדרך בין הענפים הקדמי וגם האחורי של עורק הראש העיקרי שבו, יחד עם המטען הראשי של הווריד, יוצרים את הצורה של הזקפים או עמודי השער במגרש הכדורגל האמריקאי. Otocyst הוא באמצע הדרך בין הניצבים.
4. הכנס פיפטה הזרקת דרך הרחם במסלול בקנה אחד עם מיקום משוער של otocyst. הדופק microinjector פעם אחת לאחר שעברו דרך uterלנו לדמיין את צבע נותב ואת המיקום המשוער של קצה פיפטה. לקדם את פיפטה בשליטת מיקרומטר והדופק שוב כדי להעריך לעומק. לקדם את פיפטה לתוך mesenchyme ראש הדופק לרוחב שוב ושוב. מיקוד otocyst מוצלח יגלה את הצורה של צינור קוני endolymphatic dorsally ו צדפות קרב הצורה של הכניסה. לשחרר את הלחץ על הרחם, הסר פיפטה מעובר / רחם בתנועה אחת, ומיד להשקות את הרחם עם prewarmed, לקטט בתמיסת רינגר.

3. ב electroporation vivo

1. להשקות את הרחם בתמיסת רינגר של לקטט. פתרון רינגר לקטט של יישומי טרי יש כמה חשמלית את המשוט בסגנון אלקטרודות אל הרחם. להרטיב את פני השטח של אלקטרודות טונגסטן עם לקטט רינגר של. מרכז otocyst מוזרק בדרך של האלקטרודות. בעדינות לדחוס את הרחם עם הרשות הפלסטינית electroporationddles. הקתודה היא במגע עם דופן הרחם לרוחב כדי otocyst הזריק האנודה נמצא בקשר עם דופן הרחם סמוך otocyst uninjected. לעורר גל מרובע הדופק הרכבת עם הבורר דוושת רגל על ​​electroporator. פרמטרים electroporation הם: 5, 50 msec פעימות ב 43 וולט בכל הדופק ואת עיכוב 950 msec interpulse. מיד להשקות את הרחם לאחר הרכבת הדופק מועבר. הרשומה הנוכחית נמסר רקמות: 60-100 mAmps די transfect אבות אפיתל otic. מזריקים ו electroporate 4-6, עוברים E11.5 לכל הסכר.
2. בצע microinjection 2, transuterine עצמאית של מימית ניאון dextran (Alexa פלואוריד 488 אם הביטוי פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי אדום או אלכס פלואוריד 594 אם הביטוי פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק) אל החדר 4 ^ה של עוברים אלה שאוזניו הפנימי הם מוזרק בצורה מדויקת לפחות 60 mAmps של זרם לכל הדופק היה דהlivered במהלך electroporation. Dextran ניאון יהיה להבחין בלידה בשנים למוח האחורי ולאפשר מבחר גורים אשר האוזניים הפנימי שניצלו אותם במהלך embryogenesis (ראה 3.5).
3. להשקות את קרני הרחם עם לקטט רינגר של. הכנס מחדש את קרני הרחם לתוך חלל הבטן. לרוקן את חלל הרחם עם 2-4 מ"ל של פתרון, prewarmed לקטט רינגר ולאפשר גלישה לניקוז מחוץ לאתר את החתך על וילון סטרילית. החלף כורכת חומר יבש סטרילית. לתפור את דופן הבטן עם מחט ללא חיתוך ו תפר 6-0 resorbable. אנחנו מעדיפים לתפור ריצה, נעילת כל בגד אחר, על הקיר הן לעור הבטן.
4. לייבש פרווה של האימהות ולנהל שאינם סטרואידים נגד דלקת כגון Meloxicam בזריקה תת עורית. להחזיר את הסכר לכלוב התאוששות prewarmed על וילון סטרילית. לנטר ולהקליט הנשימה של סכרים, אתר patency החתך, והנרתיק להזרמת דם. הדימום הוא דלקת מפרקים שגרוניתמחדש, אבל אם ההווה ללא הפוגה, להרדים את הסכר בזמן שהיא עדיין תחת הרדמה. שים לב פעם שהיא חוזר להכרה ומנסה ambulate. להחזיר את הסכר למושבה העכבר כאשר היא מראה סימנים של אכילה ושתייה החלה לקנן לבנות. בדרך כלל, זה קורה תוך 12 שעות.
5. בעת הלידה (יום לאחר הלידה 0), קבע פלאש באזור למוח האחורי של כל גור באפריון לזהות dextran ניאון באמצעות מיקרוסקופ לנתח stereofluorescence עם GFP או טקסס האדום מסנן על פי הצורך. חזור אל הסכר מניקות רק את הגורים המוצגים תיוג למוח האחורי.

4. נציג תוצאות

באיור 1. בתיווך electroporation גן העברה שבלול המתפתח. Otocyst E11.5 הזריקו חלבון פלסמיד ביטוי משופרת קידוד פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ו electroporated (הדופק traבכל הפרמטרים: 5, 43 וולט פולסים של 50 אלפיות השניה / 950 דופק איחור msec interpulse). א) האוזן הפנימית נציג מיום הלידה 6 (P6) גור, אשר הוזרק otocyst ו electroporated ב E11.5 הוכחת ביטוי EGFP מהבסיס דרך בתורו באמצע שבלול. קיר לרוחב של שבלול הוסר בתורו איפקס התיכון בלבד. אבות E11.5 שיוצרים איפקס לא transfected. ב) הר שלם immunostaining של שבלול ב (א) עם סמן את התא שיער, 7 א שרירן (Myo7a), עולה כי הביטוי EGFP בעקבות המסלול של האיבר של קורטי ו מותאמת גסה את האפיתל שיער תא נושאת חושית. ג) האוזן הפנימית נציג מעובר E18.5 אשר otocyst שהוזרק ו electroporated ב E11.5. הקרנת לייזר confocal מדגים ביטוי EGFP ב Myo7a חיובי תאים שיער חושיות. D) הקרנת לייזר confocal של האפיתל חושית שבלול מאיבר E18.5 של קורטי המציין EGFP expression בתאי השיער הפנימיים (IHC), בתאי השיער החיצוניים (OHC), תאים phalangial הפנימיים (IPC), תאים עמודים (PC), ותאים של Deiters (DC). בר לגודל (ב ') חל על (א').

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח פנימי: האוזן הפנימית העכבר מתפתחת placode otic בשבוע הראשון של פיתוח postimplantation ^12,13. ביום העוברית 9.5 (E9.5), placode יש invaginated ו morphed לתוך שלפוחית ​​מלא נוזלים הנקרא otocyst ^2. מבשרי Otic ב שלפוחית ​​להצמיח תאים תחושתיים nonsensory בתוך האוז?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
מקרה עיקור Micro	ROBOZ	RS-9900a	8X8.5X1.25 אינץ'
הכדור שקצהו מספריים	מדע כלים עדינים	14109-09
טבעת מלקחיים	מדע כלים עדינים	11106-09	4.8mm ID/6mm OD
Adson מלקחיים רקמות	מדע כלים עדינים	11027-12
מחט הנהג	מדע כלים עדינים	12502-12
מזרק אלרגיה מגש	בקטון Dickison	305536
תפר 6-0	Syneture	GL-889	0.7 תפר העיכול מדד
לקטט רינגר של הזרקת USP	בקסטר	2B2323
מהיר ירוק	סיגמא אולדריץ'	F7258
ההתכה של זכוכית בורו נימי	הרווארד Apparatus	30-0053
נתרן נמבוטל פתרון	תשואות פרמצבטיקה בע"מ	NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O	פישר סיינטיפיק	M63-500
פרופילן גליקול	פישר סיינטיפיק	P355-1
אתנול	סיגמא אולדריץ'	E7023-500
Meloxicam	Boehringer Ingeheim	נדא 141-219
Micropipette פולר	סאטר מכשירים	P-97	FB255B נימה התיבה, להתייעץ עם ספר מתכונים פיפטה ממכשירים סאטר
Microelectrode Beveler	סאטר מכשירים	BV-10	הדיסק beveling 104C עבור בטפי להחדרת נוזלים גדולות; עיין במדריך של הבעלים של beveling התיאוריה
Micropipette בעל	וורנר מכשירים	MP-S15T	על פיפטה 1.5mm קוטר חיצוני ויציאת לחץ נקבה צינורות Picospritzer.
פינצטה בסגנון האלקטרודה	PROTECH בינלאומי בע"מ	CUY650P5	5 מ"מ קוטר חיצוני
כיכר גל Electroporator	PROTECH בינלאומי בע"מ	CUY21EDIT	Footpedal המומלצת
PICOSPRITZER III	פארקר Hannifin	051-0500-900	Footpedal המומלצת
שליטה ידנית micromanipulator	הרווארד Apparatus	640056
למינרית אופקי תזרים נקי הספסל	Envirco		שינויים מותאמים אישית ל 630-10554 LF. ראה מידע משלים סכמטי מכסה המנוע.
לייקה stereofluorescence לנתח microcope עם מנוע Lumencor אור סולה	Bartels, המוצק Lumencor	MZ10F עם מנוע Lumencor אור סולה	Footpedals למקד את MZ10F וכדי לעורר את המנוע אור סולה מומלצים
Alexa פלואוריד 594 dextran	Invitrogen	D22913	מימית 10mg/ml,
Alexa פלואוריד 488 dextran	Invitrogen	D22910	מימית 10mg/ml,
Enviro-DRI	שפרד פאפ מיוחדיםERS		www.ssponline.com