לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Summary

הפרופיל של metabolomic Mycobacterium tuberculosis נקבע לאחר צמיחה בתרבויות ציר מרק. תנאים יכולים להיות מגוונים כדי לבדוק את ההשפעות של תוספי תזונה, חמצון, וסוכנים נגד שחפת על הפרופיל המטבולי של מיקרואורגניזם זה. נוהל להכנת תמצית היא ישים עבור שניהם 1D ¹ H ו2D ¹ H- ¹³ C ניתוחי NMR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis הוא אחד גורמים עיקריים לתמותה בבני אדם בקנה מידה גלובלי. ההופעה של שניהם רבים-(MDR) ונרחבים-(XDR) זנים עמידים לתרופות מאיימת להרוס את תהליך בקרת מחלות נוכחיות. לפיכך, יש צורך דחוף לפתח תרופות וחיסונים שיעילים יותר מאלה הזמינים כיום. הגנום של מ ' שחפת ידועה כבר יותר מ 10 שנים, עדיין קיימים פערים בידע חשוב של תפקוד גן והחיוניות שלנו. מחקרים רבים בשימוש מאז ניתוח ביטוי גנים בשתי רמות transcriptomic וproteomic כדי לקבוע את ההשפעות של תרופות, חמצון, ותנאי גידול על הדפוסים הגלובליים של ביטוי גנים. סופו של דבר, התשובה הסופית של שינויים אלה בא לידי ביטוי בהרכב המטבולי של החיידק כולל כמה אלף כימיקלי משקל מולקולריים קטנים. השוואה בין פרופילים מטבוליים מהסוג פרוע וזנים מוטנטים, גם ללא טיפול או treated עם תרופה מסוימת, יכול למעשה מאפשר זיהוי המטרה, ועלול להוביל להתפתחות של מעכבים חדשים עם פעילות אנטי שחפת. כמו כן, את ההשפעות של שני תנאים או יותר על metabolome יכולות גם להיות מוערכות. תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא טכנולוגיה רבה עצמה המשמשת לזיהוי ולכמת ביניים מטבוליים. בפרוטוקול זה, נהלים להכנתו של מ ' תמציות סלולריות חפת לניתוח metabolomic NMR מתוארות. תרביות תאים גדלות בתנאים מתאימים ו3 בלימה ברמת בטיחות הביולוגית הנדרשת, ¹ נקטפו, ונתונים לתמוגה מכאנית תוך שמירה על טמפרטורות נמוכות על מנת למקסם את השימור של מטבוליטים. lysates הסלולרי הם התאוששו, מסוננים מעוקרים, ומאוחסנים בטמפרטורות נמוכות במיוחד. Aliquots מתמציות תאים אלה מצופים באגר 7H9 מידלברוק ליחידות מושבה להרכיב כדי לוודא היעדר תאי קיימא. לאחר חודשים של דגירה ב 37 ° C, אם לא viמושבות מסוגלות הם נצפו, דגימות יוסרו ממתקן הבלימה לעיבוד במורד זרם. תמציות הנן lyophilized, resuspended במאגר deuterated ומוזרק במכשיר NMR, לכידת נתונים ספקטרוסקופיות אז זה נתון לניתוח סטטיסטי. ההליכים המתוארים יכולים להיות מיושמים גם לממד יחיד-(1D) H NMR ¹ ודו ממדי ¹ (2D) ^H-13 C ניתוחי NMR. מתודולוגיה זו מספקת זיהוי אמין יותר קטן משקל מולקולרי מטבוליט וניתוחים כמותיים אמינים ורגישים יותר של יצירות מטבוליות תמצית סלולרית מאשר שיטות chromatographic. וריאציות של ההליך מתוארת בעקבות צעד תמוגה התא יכול גם להיות מותאם לניתוח proteomic מקביל.

Protocol

1. טקסט פרוטוקול

פרוטוקול זה מדגיש את ההסתגלות של המתודולוגיה NMR למ ' שחפת (סוכן שלישי כיתה). לכן, biosafety רמה 3 (BSL3) נהלים צריכים להיות מלווה בעת ביצוע מ ' מחקר שחפת במעבדה מוסמכת מדי שנה. חשיפה לאירוסולים מעבדה שנוצרה היא הסיכון החשוב ביותר שנתקל בו כוח אדם שעובד עם מיקרואורגניזמים אלה. ההליכים הבאים מתנהלים במוסד שלנו ווריאציות יכולות להתקיים על בסיס ההמלצות של ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית. אנשים נפוצים ציוד מגן יכללו חליפת Tyvek, כובע נפוח, נעליים, הנשמת N95, הגנה על עין, שרוולים, וזוג כפפות כפול של nitrile. עבודה שיש בי מ ' תרבויות שחפת ו / או מניפולציות עם פתוח מ ' שחפת מכולות מתבצעות בA2 הסוג או ארון בטיחות ביולוגי B2. נייר סופג מכוסה פלסטיק מונח על working פני שטח. כל החומרים / הציוד להיות מסולק או הוסרו מהמתקן חייבים להיות ממוקמים בשתי שקיות Biohazard ולחטא על ידי מעוקר. משטחי עבודה וציוד מנוצל בתוך הארון (FastPrep-24 תמוגה homogenizer, ספקטרופוטומטר, דלי עם קרח, וכו ') יש לחטא לאחר כל ישיבת עבודה עם Amphyl% 1 (tuberculocidal, bactericidal, קוטל פטריות, וvirucidal סוכן). מ' תרבויות שחפת חייבות להיות ממוקמות מתחת לבלימה כפולה לתחבורה לציוד גדול הממוקמים מחוץ לארון הבטיחות הביולוגי כגון מקפיאים, אינקובטורים, צנטריפוגות, ומקררים. צנטריפוגה מתנהלת עם כוסות בטיחות סגורות וצינורות מובילים בורג O-טבעת. לניתוח נוסף, מחוץ למעבדת BSL3, תמציות תא חינם מסוננות דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר או חום מיקרואורגניזמים נהרג ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ² דוגמאות מצופות לאמת היעדר יחידות מושבה להרכיב לפני ההסרה מבלימה.

1. העברת 110 מ"ל של 7H9 תקשורת מלאה המכילה מידלברוק polysorbate 80 (Tween 80 כדי למנוע יצירת גושים) מרק (MADC-TW) או בינוני מתאימה לבקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer. תרבויות שלושה עותקים גדלות באופן שגרתי לכל מצב בעת שימוש ^C-13 מטבוליטים, ועשר תרבויות זהות גדלות לפרופיל 1D H ¹ NMR. לשני תנאים (למשל, עם ובלי תוספת של תרופה), נפח כפול של תרבות ללשכפל ניתן לגדל והתפצלו לשתי תרבויות זהות. כל המתכונים המגיבים ופתרון מסופקים בסוף הפרוטוקול.
2. לחסן מרק עם 0.150 מ"ל של מ ' 50% מניות גליצרול חפת (תאפשר להפשיר על קרח). ראה באור 1 להלן.
3. בואו לגדול התרבות ב 37 ° C רועד ב 100 סל"ד במשך כ 6 ימים (OD ₆₀₀ 0.6-0.8). ראה באור 2 להלן.
4. אם לא ניתן טיפול אנטיביוטי, תוספות או טיפולים אלטרנטיביות אחרים, יש צורך, התרבויות מוכנות לאיסוף. אם טיפולים משמשים, המשךישירות לשלב 5. הסר מדגם 0.5 מ"ל מכל בקבוק, להעביר לצינור microcentrifuge ומקום ב 4 ° C לטיטרציה התרבות ובקרת איכות: בדיקות זיהום, ניתוח פנוטיפית, בדיקות PCR. ראה באור 3 להלן. בשלב זה, המשך לשלב 6.
5. הסר צלוחיות מייקרו ולבצע את הטיפול הרצוי (למשל, להוסיף תרופה או מטבוליט). מקום צלוחיות גב במערבב ולדגור לתקופה נוספת (למשל, 6-18 שעות). בסופו של שלב זה, תיקח עוד aliquot מ"ל 1.0 ולקבוע OD _600. הסר מדגם 0.5 מ"ל מכל בקבוק, להעביר לצינור microcentrifuge ומקום ב 4 ° C לטיטרציה התרבות ובקרת איכות.
6. תרבויות מקום על קרח למשך 5 דקות. לאחר שלב זה, לצאת מתאים על קרח בכל הפרוטוקול שנותר שלם. תרבויות קציר על ידי צנטריפוגה ב2000 XG ו4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 50 צינורות מ"ל באמצעות צנטריפוגות benchtop. לכל תרבות תדרוש ארבעה צינורות עם 25 מ"ל כל אחת (סך של 100 מ"ל נדרש לקבל אות לרעש הולם עבור ¹ 2D ^H-13 C ניסויי NMR, שבו רק 50 מ"ל לתרבות נדרש לניסויי 1D ¹ H NMR).
7. שטוף את כל תא גלולת שתי פעמים עם DDH ₂ O קר כקרח (כ 15 מ"ל בפעם הראשונה ו10 מ"ל הפעם השנייה) על ידי פרמטרי צנטריפוגה שתוארו לעיל. לכביסה השנייה, לשלב את 10 aliquots המ"ל לאותו צינור לפני ספינינג. Resuspend תא הגלול בנפח סופי של 1.0 המ"ל DDH ₂ O (צריך להתאים לנפח כדורי תא). אם השעית תא בודדה ללא clumping היא רצויה בשלב זה, תאים ניתן sonicated בקצרה ו / או עברו דרך מחט 27-מד שלוש פעמים. לחלופין, תא הגלולה אפשר להקפיא ב-80 ° C ומאוחסנת עד עיבוד נוסף. במקרה האחרון, כדורים קפואים מופשרים על קרח לפני resuspension. Resuspend את הכדורים הסלולריים בנפח סופי של 1.0 המ"ל DDH ₂ O כאמור לעיל.
8. Transfer השעית תא המ"ל 1.0 עד 2.0 מיליליטר צינור בורג מכסה המכיל Lysing מטריקס B (0.1 מ"מ תחומי סיליקה). הנח homogenizer FastPrep-24 תמוגה בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. שים את הדגימות לבעל המדגם, אבטחת השמירה דברה צלחת על חלק עליון של הצינור. לעבד את הדגימות ל60 שניות בhomogenizer בהגדרת מהירות של 6 מטר / שני.
9. לסובב את הדגימות בmicrocentrifuge ב15000 XG ו4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפסולת תא גלולה ותאים שלמים.
10. הסר מדגם supernatant ועובר דרך מסנן מזרק (0.2 מיקרומטר) לתוך צינור סטרילי. 0.1 מיליליטר צלחת המדגם (או כל חלק נציג של המדגם, כמו למשל 10%) על אגר MADC כדי לוודא שאין תאי קיימא. חוקרים יכולים גם לערוך שלב סינון אחד או יותר ו / או לאמת את הנוכחות של תאי קיימא בתמציות באמצעות נהלי מכתים חי מתים כדי למנוע או לזהות כל חששות biosafety פוטנציאליות. להקפיא דגימות באמבט קרח אתנול יבש לאחסוןב-80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לlyophilized ומעובד במתקן לתמ"ג.
11. לאחר 2 חודשים, לבדוק צלחות כדי לוודא היעדר יחידות מושבה להרכיב. אם לא CFU של מצוי, ניתן לקחת דגימות ממעבדת BSL3. ניתוח נוסף בוצע במתקן NMR סטנדרטי, אשר בדרך כלל משמש מרובי משתמשים ופועל תחת בלימה אין דרישות ספציפיות.
12. Lyophilize את הדגימות ליובש, אז resuspend ב0.7 מ"ל של חיץ והעברה לצינור microcentrifuge NMR. צנטריפוגה ל3 דקות ב13000 x גרם. הסר 0.6 מ"ל והעברה לצינור NMR 5 מ"מ. לחלופין, דגימות lyophilized יכולות תישלחנה למתקן חיצוני כדגימות רגילות שאינן ביולוגיות מסוכנות.
13. NMR נתונים נאספים באופן מיידי. למרות כל אמצעי הזהירות, אנזימים פעילים, עדיין עשויים להיות נוכחים והמדגם הוא בדרך כלל לא יציב לפרקי זמן ארוכים. שינויים בספקטרום NMR הם מורגשים כאשר הדגימות נותרות בחוץ בטמפרטורת חדר או ב4 מעלות צלזיוס למשך מ 'בצר מ 1 שבוע. כמו כן, איסוף נתוני תמ"ג הוא נע בין תרבויות שלא טופלו ותרופה שטופלו בו, הם דוגמאות שנבחרו באקראי מכל קטגוריה. הדבר מונע הטיות מיותר כי קטגוריה מסוימת היה עיכוב עוד לפני ספקטרום NMR נאסף. הטיה בנתונים תתרחש אם ספקטרום NMR לכל דגימות שלא טופלו נאספו ראשון, ולאחר מכן על ידי דגימות הסמים שטופלו. אם הדגימות לא מסוגלות להיות מנותח באופן מיידי על ידי תמ"ג, הדגימות צריכות להיות מאוחסנות במיליליטר אפנדורף צינורות 1 ב -80 ° C.
14. לאחר שהוא מכניס את הדגימות לBACS-120 מדגם מחליף, כיול מכשיר, הכולל כמה צעדים שיגרתי כגון נעילה, פחית, מנגינה, ואופטימיזציה של ° אורך הפולס 90, נדרש על מנת למקסם את איכות התוצאות. דוגמה אחת משמשת לכיול 90 ° אורך דופק ולכוון את המכשיר לדגימות שנותרו. נעילה, shimming, ואיסוף נתוני תמ"ג לכל מדגם הוא usin האוטומטיגרם ICONNMR וgradshim.
15. ספקטרום 1D H ¹ NMR הוא נאסף באמצעות רצף דופק zgesgp Bruker עם דיכוי מים באמצעות פיסול עירור. נקודות של 32K נתונים עם רוחב סריקה של 5482.5Hz, 128 סריקות, ו16 סריקות דמה נמצאים בשימוש. ¹ ספקטרום 2D ^H-13 C HSQC נאסף באמצעות רצף דופק hsqcetgp ברוקר. סך של 2048 נקודתי נתונים עם רוחב סריקה של 5000.0 הרץ נאסף לאורך ממד H הישירה ^1, ו64 נקודתי נתונים עם רוחב סריקה של 18,864.9 רץ לאורך ממד C העקיף ^13. הספקטרום נאסף עם 128 סריקות ו16 סריקות דמה לקבל אות לרעש טובה.

איור 1. תרשים זרימה של הפרוצדורות מתואר.

NMR חיץ

פתרון מלאי חובב פוספט אשלגן 50 מ"מימאה עם TMSP מיקרומטר 50:

• 2.17 הגר 'K ₂ HPO ₄ (אשלגן פוספט dibasic)
• 1.70 גרם KH ₂ PO ₄ (אשלגן פוספט monobasic)
• 7.86 מ"ג נתרן-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2-D ,2,3,3 ₄ (ד ', 98%))
• מתמוסס ב500 מ"ל של "100%" D ₂ O
• הפתרון הסופי צריך להיות ב-pH 7.2 (שלא תוקן)

MADC-TW או MOADC-TW (L 1)

• 4.7 גרם מידלברוק 7H9 מרק בסיס
• 900 המ"ל DDH ₂ O
• 2 המ"ל גליצרול
• מערבב את הרכיבים והחיטוי ל25 דקות. נוזל קר לגעת ולהוסיף את הפתרונים הבאים:
• 100 המ"ל ADC עת הכנת OADC MADC או 100 מ"ל בעת הכנת MOADC
• 2.5 מ"ל 20% Tween 80 (לחלופין, 1 מ"ל של Tyloxapol 20% שאינם metabolizable)
• 10 מ"ל 1% cycloheximide

ADC (L 1)

• 20 גרם D (+)-גלוקוז
• 50 גרם שבר BSAV
• 8.5 גרם NaCl
• 800 המ"ל DDH ₂ O
• ממס יחד, להתאים את עוצמת קול ל1 ליטר ולחטא עם 0.2 מיקרומטר מסנן. לאחסן ב 4 ° C.

לחלופין, להכין OADC (1 ליטר), מוסיף את כל המרכיבים המפורטים לעיל בתוספת 50 מ"ל של 1% חומצה אולאית (מתכון בהמשך הופך יצווה 250 מ"ל). ממס יחד, להתאים את עוצמת קול ל1 ליטר ולחטא עם 0.2 מיקרומטר מסנן. בקבוק צריך להיות עטוף ברדיד האלומיניום ולאחסן ב 4 ° C.

• חומצה אולאית 2.5 גר '
• 250 המ"ל NaOH 0.2m
• חומצה אולאית הפשרה (מבצר על קירור) על ידי חימום של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהוסיף לפתרון וחום NaOH עם הערבוב במשך 60 דקות. חנות בבקבוקי זכוכית סטריליים שהם עטופים ברדיד אלומיניום. בקבוקים חותמים עם parafilm וחנות ב 4 ° C.

אם העדיף, תוכל לרכוש BD BBL מידלברוק ADC המסחרי או OADC עם העשרת catalase.

1% Cycloheximide (100 מ"ל) חזק

• 1 גרם cycloheximide
• 100 המ"ל DDH ₂ O

ממס ולחטא עם מסנן 0.2 מיקרומטר. לאחסן ב 4 ° C. זהירות: cycloheximide הוא רעיל כדי לטפל בזהירות מרבית.

20% (v / v) Tween 80 (100 מ"ל)

• 20 המ"ל Tween 80
• 80 המ"ל DDH ₂ O

לחלופין, שוקל 20 גרם של Tween 80 (כ 18.9 מ"ל; צפיפות 1.06 גרם / מ"ל), כדי להכין את 20% פתרון w / v. פתרון חום עד 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להמסה ולערבב לחלוטין. לעקר נוזלי עם 0.2 מיקרומטר מסנן. אחסן את הפתרון הסופי בטמפרטורת חדר.

20% (v / v) Tyloxapol (100 מ"ל)

• 20 המ"ל Tyloxapol
• 80 המ"ל DDH ₂ O

לחלופין, שוקל 20 גרם של Tyloxapol (כ 18.2 מ"ל; צפיפות 1.1 גרם / מ"ל), כדי להכין את 20% פתרון w / v. פתרון חום עד 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לdissolve, ולערבב לחלוטין. לעקר נוזלי עם 0.2 מיקרומטר מסנן. אחסן את הפתרון הסופי בטמפרטורת חדר.

שים לב 1: מניות גליצרול של מ ' שחפת מוכנה באמצעות הפרוטוקול הבא.

גרב של מ ' שחפת

• לגדול מ ' שחפת ב50 המ"ל MADC לרוויה (OD ₆₀₀ = 1.5-2.0) על 37 המעלות צלזיוס בתנאים רועדים (100 סל"ד). בהתאם לעומס, זה ייקח 7-14 ימים.
• ספין דגימות ב2000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לתרבות גלולה. הסרת supernatant.
• Resuspend ב 6 מ"ל של גליצרול 50% סטרילי.
• 1.5 מיליליטר aliquot לתוך 4 מבחנות קורנינג קירור ותווית כראוי.
• מייד בקבוקוני הבזק להקפיא אמבטית אתנול / יבשה קרח וחנות ב-80 ° C.

הערה 2: inoculating המתח H37Rv (-80 ° C מניות עד 1.5 שנים) לתוך 70 מ"ל של MADC תקשורת מניבה OD _{600 <}/ תת> של כ -0.6 לאחר 5 ימים של צמיחה על 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים (100 סל"ד) בInnova 40 אכר.

הערה 3: לבדיקת זיהום התרבות, חוקרים הצליחו לחסן aliquot תרבות על מדיום עשיר סטנדרטי ולאמת היעדר הצמיחה לאחר דגירת הלילה. באופן שגרתי, תרבויות מצופות באגרו MADC להתבונן ולבחון את מורפולוגיה מושבה על ידי מיקרוסקופ שלב ניגוד. אם תרצו, ניתן לאמת תרבויות באמצעות PCR משתמש הוא 6110 פריימרים כמתוארים. ³

2. נציג תוצאות

מדגם שהוא מוכן היטב יניב ספקטרום דומה לזה מתואר באיור 2 NMR. הספקטרום הזה הוא ייצוג של מ ' ברכת שחפת פראית סוג מטבולית. המטבוליטים שזוהו קשורים ישירות או בעקיפין במסלול D-אלאנין. כמו כן, סדר הגודל של עוצמות שיא הוא פרופורציונלי לריכוזי מטבוליט להציגבתמצית התא. לכן שינויים בעוצמות שיא בין תרבויות שלא טופלו, טיפול תרופתי, וזנים מוטנטים יכולים להצביע על הפרעות במטבוליטים ומסלולים מטבוליים. מ ' שחפת 1D H ¹ NMR הספקטרום נאסף על ספקטרומטר Bruker Avance 500 MHz מצויד בcryoprobe משולשת תהודה, Z-ציר שיפוע. הספקטרום מכיל CA. 400 פסגות, שממנו היו אפשר לזהות ולכמת 40-50 מטבוליטים, כולל חומצות אמינו, מבשרי נוקליאוטידים, ביניים glycolytic וחומצת לימון. מחליף BACS-120 עם תוכנת דגימת אייקון Bruker שמש כדי להפוך את איסוף נתוני התמ"ג. 1D H ¹ NMR הספקטרום נאסף באמצעות פיסול עירור ⁴ ביעילות להסיר הממס ולשמור על בסיס שטוח, ומבטל כל צורך באוסף בסיסי שעשויה לגרום לממצאים בניתוח שלאחר מכן מנהלת רכיב (PCA) או ניתוח אורתוגונלי החלקי לפחות ריבועי מבחין (OPLS- ד"א). 1ספקטרום ד H ¹ NMR נאסף ב 25 ° C עם רוחב ספקטרום של 5482.5 הרץ ונקודתי נתוני 32K. סך של 16 סריקות דמה ו 128 סריקות שמשו כדי להשיג את הספקטרום. תוכנת ACD מעבדות 1D NMR המעבד שמשה לעבד באופן אוטומטי למחצה כל ספקטרום 1D H ¹ NMR. הספקטרום היה פורים הפך, בהדרגה, וההפניה לTMSP השיא (0.0 עמודים לדקה). חבילת תוכנת NMRpipe שמשה בנפרד לעבד 2D H ^1-13 C NMR הספקטרום ונתחה עם NMRDraw. קובץ נתוני ברוקר FID הוסב ראשון שפורמט קובץ ניתן לזיהוי על ידי NMRpipe ולאחר מכן הקשת הייתה פורה הפכה, השלב תוקן, ואפס מלא. פסגות NMR נצפו בH 1D NMR ספקטרום ¹ ו 2D C ספקטרום ^{1 H-13} NMR מוקצות למטבוליטים ספציפיים באמצעות H ¹ ו ¹³ טולרנסים משמרת כימית C של 0.05 ו 0.50 לדקה, בהתאמה, ומדיסון metabolomics Consortium מסד הנתונים (MMCD ,) ^{5 BioMagResBank, 6 ומסד Metabolome האנושי. 7 באופן ספציפי, ספקטרום התמ"ג 1D ו 2D הם ידני שיא קטוף בי רשימת השיא של משמרות NMR הכימיים היא לאחר מכן נטענת למאגר Metabolome האנושי. המטבוליטים שזוהו על ידי מסד נתוני Metabolome אדם מוקצים לספקטרום NMR מבוסס על שניהם למקסם את מספר התאמת תהודות NMR ושייך לרשת מטבולים. לכל תרכובת או המטבוליט בדרך כלל יש זוגות CH מרובים ותהודות NMR בהתאם מרובות. לכן, יותר מתהודות NMR אלו שנצפו בספקטרום NMR הניסיוני, כך סביר יותר מטבוליט הוא הווה. באופן דומה, זיהוי מטבוליטים לשייך אותו המסלול מרובים מגביר את הסבירות של מטלות נכונות. נוכחותם של מטבוליטים ומסלולים מטבוליים מאומתת עם אנציקלופדית קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) 8 ומאגרי MetaCyc. Mycobacterium smegm 9ATIS הוא מערכת מודל שימושית עבור מ ' שחפת ופתוגנים mycobacterial אחרים. כפי שתואר במקומות אחרים, דגימות של מ ' smegmatis גם יכול להיות משובש על ידי sonication 10.}

איור 2. ¹ ספקטרום תמ"ג 1D H של תמצית תא חפת Mycobacterium. פסגות NMR קשורים מטבוליטים יציגים מסומנות. קיצורים הם כדלקמן: AMP פוספט, אדנוזין מונה; α-ק"ג, α-ketoglutarate; Glu, גלוטמט, ועלא, אלאנין.

Discussion

מספר לא מבוטל של מחקרים נתח את פרופילי transcriptomic וproteomic של מ ' שחפת תחת מגוון במבחנה בתנאי vivo. ^11-16 סופו של דבר, שינויים בביטוי גנים ופעילות אנזים יובילו לשינויים בריכוזים של מולקולות קטנות משקל מולקולריות. התיאור המלא של תרכובות אלו מהווה metabolome. לכן, יכו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב / הציוד	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
העשרת ADC	BD BBL מידלברוק	212352
BACS-120 מחליף לדוגמה	ברוקר
הברוקר Avance NMR	ברוקר		500 MHz
שור הסרום אלבומין	הפישר סיינטיפיק	BP1600-100	החלק V
סרכזת	Beckman Coulter	אלגרה X-15R	Benchtop
צינורות צנטריפוגות	קורנינג	430291	פוליפרופילן 50 המ"ל סטרילי
בקבוקוני קריוגני	קורנינג	430488	פוליפרופילן סטרילי 2.0 מ"ל
Cycloheximide	AG מדעית	C-1189	רעיל
D (+) - גלוקוז	Acros	41095-0010
אוקסיד דאוטריום	סיגמה אולדריץ	617385
Flask Erlenmeyer	VWR	89095-266	, בסיס שטוח סטרילי, פוליקרבונט, כובע 0.22 מיקרומטר PTFE קרום פרק
Flask ההקפאה פלאש	VWR	82018-226	750 מ"ל
הקפא מייבש	VWR	82019-038	4.5 הליטר Benchtop
גליצרול	GibcoBRL	15514-029
מדגרה	ניו ברונסוויק	Innova 40	Benchtop ייקר
Lysing מטריקס B	Biomedicals MP	6911-100
מכונת תמוגה	Biomedicals MP	FastPrep-24
Microcentrifuge	אפנדורף	5415D	Benchtop
Microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 22R	Benchtop
מידלברוק 7H9 מרק	Difco	271310
NMR צינורות	Norell	ST500-7	5mm
העשרת OADC	BD BBL מידלברוק	212351
חומצה אולאית	סיגמא	O1008
אשלגן זרח Dibasic	VWR	BDH0266
אשלגן זרח Monobasic	VWR	BDH0268
רוטור - Microfuge 22R	Beckman Coulter	F241.5P	אטום ופוליפרופילן
רוטור - אלגרה X-15R	Beckman Coulter	SX4750	עם כיסויים יו מוסמכים
כלוריד הנתרן	הפישר סיינטיפיק	S271-3
נתרן-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4	קיימברידג' איזוטופ	DLM-48
ספקטרופוטומטר	Beckman Coulter	DU-530
Cuvettes ספקטרופוטומטר	עורק חיים	LS-2410	פוליסטירן מ"ל 1.5, 2 צדדים ברורים
מזרק	הקיטון דיקינסון	309585	סטרילי, 3 מ"ל luer-Lok
מזרק סינון	Nalgene	190-2520	יצטט תאית סטרילי 0.2 מיקרומטר
Tween 80	הפישר סיינטיפיק	BP338-500