Method Article
תסיסנית ביצה קאמרית הוא מודל מצוין לחקר המנגנונים של לוקליזציה mRNA. על מנת ללכוד את האירועים דינמיים ביסודה של תהליכי לוקליזציה, ברזולוציה גבוהה הדמיה מהירה של רקמה חיה נדרש. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה והדמיה של דגימות חי עם הפרעה מזערית.
הדמיה תא חי הוא טכניקה חשוב ליישם מספר של רקמות תסיסנית המשמשים מודלים לחקור נושאים כגון מפרט ציר, התמיינות תאים ו organogenesis 1. הכנה נכונה של דגימות הניסוי הוא מכריע, לעיתים קרובות מוזנחים, צעד. מטרת ההכנה היא להבטיח התאמה פיזיולוגית ולקבוע תנאים אופטימליים הדמיה. כדי לשמור על הכדאיות רקמות, חיוני כדי למנוע התייבשות, הידרדרות היפוקסיה, התחממות יתר או בינוני 2.
תא הביצה תסיסנית היא מערכת מבוססת היטב לבחינת שאלות הנוגעות, אך לא רק, על דפוסים הגוף, לוקליזציה mRNA וארגון cytoskeletal 3,4. עבור בתאי ביצה המוקדמות ו באמצע הבמה, גובר בשמן halocarbon טוב להישרדות כי היא מאפשרת דיפוזיה ללא חמצן, מונע התייבשות היפוקסיה ויש לו תכונות אופטיות מעולה במיקרוסקופ. Imההזדקנות של חלבונים ניאון ניתן באמצעות הכנסת transgenes לתוך תא ביצית או הזרקת הפיזי של רנ"א, חלבונים שכותרתו או נוגדנים 5-7. לדוגמה, תוספת של MS2 בונה על הגנום של בעלי חיים המאפשרת תצפית בזמן אמת של mRNAs ב הביצית 8. מבנים אלו מאפשרים על תווית vivo של ה-mRNA באמצעות ניצול האינטראקציה bacteriophage MS2 RNA גזע לולאה עם חלבון המעיל שלה 9.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להוצאת השחלות, כמו גם בידוד ovarioles בודדים ותאי ביצה מ תסיסנית הנשי. לתיאור מפורט של תסיסנית oogenesis הכס אלן ג Spradling (1993, נדפס 2009) 10.
1. תסיסנית הכנה לפני לנתיחה (לפי א 'Gavis, אוניברסיטת פרינסטון)
הערה: לחילופין, שמרים premix להדביק בכלי נפרד ולהוסיף את העיסה כדי בקבוקון עם מרית.
2. תסיסנית לנתיחה השחלה
3. בידוד ovarioles
הערה: השחלה מכילה כ 16 ovarioles מורכב של 6 עד 10 חדרי ביצת בשלבים שונים המסודרים כמו חרוזים על חוט 10.
הערה: לפני לבודד את ovarioles, להתאים את מקור האור על מיקרוסקופ לנתח כך הארה פוגעת בזווית שטוחה המדגם. זה נותן לעומת המדגם מאפשר הדמיה של בתאי ביצה צעירים הבמה.
הערה: ovarioles אישיות ישבור בין בשלבים הצעירים (germarium לשלב 10) כמו בשלבים מבוגרים יותר הם גדולים מדי כדי להיפרד השחלה מלא.
הערה: ניקוב הביצית בשלב מאוחר עם החללית לנתח תגרום הציטופלסמה דולף לתוך השמן ולעשות להפקת ovarioles בודדים מאוד מאתגר. אם הביצית בשלב מאוחר הוא ניקב, לעבור השחלה טרי.
הערה: מומלץ לנתח שחלה אחת לכל מספר מ זבובים ולא לנתח את שתי השחלות מ זבובים פחות להגדיל את מספר n של זבובים על הניסוי.
הערה: טיפול אגרסיבי מדי של ovariole תגרום ביציות לא בריאים והוא יכול להוביל חפצים בניסוי.
הערה: ביציות יתחילו להציג שינויים פנוטיפי בשל הלחץ 40 דקות לאחר גזור מן השחלה (השוו 7E איור ל-F).
4. בידוד הפרט בסוף שנות ביצה הבמה חדרי (לפי א 'Gavis, אוניברסיטת פרינסטון)
הערה: ניקוב הביצית תוך לנתח בסוף שנות ביצה חדרי הבמה הוא לא מגנה כמו לנתח אניovarioles ndividual לשלבים צעירים יותר.
הערה: 14 חדרי הבמה ביצים, להשתמש במלקחיים כדי לתפוס את הנספחים הגב להתמצאות.
5. הזרקת הכנה
הערה: הזרקה של ביציות הבמה באמצע, המזרח ovarioles בניצב לציר הארוך של שובר את הכיסוי.
6. הזרקת RNA ניאון
לפני שתתחיל: הגדרת מנגנון הזרקת מיקרו המניפולטורים בקרות כאלה מחט הזריקה ממוקם מעל מרכז שדה הראייה.
הערה: אם אתם משתמשים בשלב אוטומטית עם יכולת נקודת ביקור מומלץ לסמן כל שלב 8-9 ביציות עבור זריקה לפני תחילת. זה מאפשר ביקור קל הזרקת ביציות שנבחרו.
הערה: תהליך ההזרקה כל צריך לקחת פחות מ -10 שניות כאשר מבוצע כהלכה. רב דקירה או משתהה עם המחט בתוך הביצית תגרום נזק חמור תא הביצה.
הערה: אם זו טעות הוא עשה תוך כדי הזרקה, מעבר הביצית המסומן הבא. אל תבזבזו זמן על ביציות פגומות.
הערה: המחט עשוי להיות סתומים במהלך הפגישה זריקה. במקרה זה, להזיז את המחט בסמוך פיסת זכוכית שבורה בשמן על coverslip. שנינותH זכוכית מחט המטוס מרחק אותו, בעדינות לתקוע את המחט לתוך כוס (איור 6 שעות). בדוק כי המחט מתפנה על ידי לחיצה על לחצן הזרקת ולראות אם הנוזל יוצא כל קצה המחט.
הערה: אם תקופה ממושכת של זמן שחלף בין בידוד ביצה קאמרית הזרקת ביצית, ביציות יהיה קשה להכניס ולהציג שינויים פנוטיפי הקשורים ללחץ. בעיות דומות עלולות להתעורר עם טיפול אגרסיבי מדי של הביצית או הזרקת כמויות עודפות (השוו 6I דמויות, J, K).
7. חיים הדמיה עיצוב ניסיוני
8. נציג תוצאות
במבחנה מסונתז Alexa-546 grk RNA מוזרק Me31B :: GFP תא הביצה (7 א איור). RNA localizes כדי הקדמי הגב של הביצית ויוצר שווי סביב הגרעין (7 ב איור). לדוגמאות נוספות של לוקליזציה RNA לראות מקדוגל נ ', et al. (2003) 11.
ביציות בשלב אמצע ומאוחר המבטאים חלבון הנקרא ניאון (טאו-GFP, איור 7C) או מערכות רנ"א תיוג (grk * mCherry, איור 7 ד) ניתן הדמיה ללא הזרקה.
באיור 1.
= "Jove_content">
איור 2.
איור 3.
באיור 4.
איור 5.
איור 6.
איור 7.
הדמיה תא חי הוא assay עוצמה לבחינת תהליכים תאיים בזמן אמת. בנוסף תצפית פשוטה בתחום בהיר, הוספת תוויות ניאון כדי חלבונים RNAs של עניין יש להוביל לפריצות דרך רבות. כאן אנו התוויתי פרוטוקול ביציות הדמיה חיים בודדים שניתן לנצלם בשילוב עם מבחני גנטיים ביוכימיים.
בפרוטוקול זה, אנחנו גם מסבירים כיצד לתפעל באופן ניסיוני ביציות החיים בזריקה. קיימות אפשרויות רבות עבור חומר להזריק, כולל חוץ גופית ב-RNA מסונתז שכותרתו ניאון assay את היכולת של המבנה משני לוקליזציה RNA ישירה (כדור ו דייוויס, לא פורסם) וכן נוגדנים המעכבים את הפונקציה של חלבונים 6. העבודה העתידית צפויה לראות את המבוא של רכיבים אחרים תיוג ומכונות הסלולר ביציות חיים המאפשרים המנגנונים המולקולריים להיבדק.
t "> שמירה על יכולת הקיום והבריאות של רקמה חיונית בעבודה עם תאים חיים. בפרוטוקול זה, אנו מציינים מספר צעדים שיכולים להוביל ללחץ של תא הביצה. לדוגמה, על אף היותו שמן מעולה עבור הדמיה, תרבות המורחבת בשמן יכול להוביל ללחץ על תא הביצה. זה ניתן לפקח בקלות על ידי בחינת המורפולוגיה עמדה גרעינית, קרום הביצית אשר לעוות ו בועה תחת לחץ (איור להשוות 7E (מוטעמות) כדי Figure7F תחת חשיפה לשדות בהיר ( הדגיש)). שלב 9 בתאי ביצה להראות לוקליזציה RNA של התא הגבול ההגירה מעל 12 שעות מרובות. עם זאת, בשלב 7/8 תא הביצה תתחיל להציג תופעות לוואי בשמן פחמן הילה לאחר כ 40 דקות של השחלה סולקו מן נשים. מאוחרת ביצה הבמה חדרי, בשלב 11-14, יכול להתפתח בדרך כלל בשמן או בתקשורת מימית בגלל הפרשת מעטפת הביצית מתאי זקיק בכל השלבים האלה 13. זה כבר reported כי תוספת של אינסולין עד בינוני חרק מימית יכול לשמור 9 ביציות הבמה עד 6 שעות 14 ו germaria עד 14 שעות 15. בכל המקרים, תמרון אגרסיבי של תא הביצה יש להימנע, כפי שהוא מדגיש את ביציות ומפחית את יכולת הקיום שלה. הדמיה פחות בתאי ביצה ולדאוג לטיפול בכל בעדינות היא הדרך הטובה ביותר להבטיח את יכולת הקיום האופטימלי.אין לנו מה למסור.
עבודה זו נתמכה על ידי אחוות Wellcome Trust מחקר בכיר א דייויס.
כלים המשמשים לנתיחה צריך להיות נקי אבל לא צריך להיות autoclaved. נגב כלים עם ETOH ולאפשר להם להתייבש לפני ההתחלה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
בסדר צבע היטה מברשת (אמנים סייבל, עגול, בגודל 00 או 0) | זמין מ רוב חנויות ציוד אמנות | מברשת איכותית היא חשובה | |
Halocarbon מוצרי החברה, סדרה 95 | Halocarbon מוצרים Corporation, 887 Kinderkamack כביש, נהר Edge NJ 07661 | אירופה המפיץ: Solvadis (GmbH) הקפד על ידי חמצן מבעבע אוויר דרך השמן. | |
מכסים, לא להחליק. 1.5, 22 x 50 מ"מ | הבינלאומי-No1-VWR cat = 631-0137-22-50mm | מנצל-גלזר-22-40mm MNJ-400-070T | |
דומון מס '5 - Dumostar | מדע כלים עדינים | 11253-20 | "Biologie" עצה טובה גם אבל שברירי יותר |
לנתח בדיקה | מדע כלים עדינים | 10140-01 | |
לנתח מיקרוסקופ | אולימפוס | SZ61 | |
CO2 כרית | זמין דרך http://www.flystuff.com / (חלוקת Genesee מדעי) | 59-114 (789,060 Dutscher) | אירופה המפיץ: Dutscher www. dutscherscientific. com / זה גם קל יחסית מותאם אישית לבנות רפידות משלך זבוב |
KimCare | Kimbery קלארק, KimCare רפואיות מגבונים | KLEW3020 | |
מיקרוסקופ-DeltaVision | יישומי Precision | DC-CORE | |
Micromanipulator | Burleigh Micromanipulators מ Lumen הדינמיקה הקבוצתית Inc. 2260 Argentia כביש, Mississauga, אונטריו, קנדה L5N 6H7 | Burleigh PCS-5000 הסדרה, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com / (לשעבר Exfo) |
זריקת המכשיר | Tritech Research, Inc 2961 ותיק Ave לוס אנג'לס, קליפורניה 90064 | MINJ-1 | שונה עם בעל לקחת Eppendorf Femptotips |
הזרקת מחט | Eppendorf סטרילי Femtotips I ו-II | 930000043 | טיפים שונים טובים יותר עבור יישומים שונים |
טוען טיפים 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
שמרים יבשים פעילים | פליישמן של שמרים | # 2192 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved