פילוח ומדידה של כמויות השומן מודלים השמנת יתר Murine באמצעות קרני רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת

Summary

ניתוח תכולת השומן מתבצעת באופן שגרתי מחקרים ניצול מודלים השמנה Murine. שיטות המתעוררים קטנה החיה CT הדמיה וניתוח מספקים ניתוח האורך עשיר בפרטים תכולת השומן. כאן יש פירוט צעד אחר צעד לביצוע הליכים קטנה החיה CT הדמיה, ניתוח, הדמיה.

Abstract

השמנה קשורה לתחלואה ותמותה מוגברת, כמו גם מדדים מופחת איכות החיים. ¹ שני גורמים סביבתיים וגנטיים הקשורים להשמנה, אם כי המנגנונים המדויקים התורמים המחלה נמצאים כעת התחום. ^2,3 חיה קטנה כמה מודלים של השמנת יתר פותחו מועסקים במגוון רחב של מחקרים. ⁴ מרכיב קריטי אלה ניסויים כרוכה אוסף של אזוריים ו / או שומן מן החי הכולל נתונים התוכן בתנאים מגוונים.

שיטות ניסיוניות המסורתיים הקיימים למדידת תכולת השומן במודלים של בעלי חיים קטנים של השמנת יתר כוללים פולשנית (למשל לשעבר המדידה vivo של משקעי שומן) ולא פולשניות (כגון אנרגיה כפול רנטגן absorptiometry (DEXA) או תהודה מגנטית (MR)) פרוטוקולים, שכל אחד מהם מציג את יחסי הפשרות. שיטות פולשניות שוטפות למדידת כמות השומן עשויה לספק פרטיםלעוגב והפצה ספציפית באזור שומן, אבל להקריב הנבדקים ימנע הערכות האורך. לעומת זאת, כיום לא פולשנית אסטרטגיות לספק פרטים מוגבלים על איבר מסוים והפצה באזור שמנה, אבל מאפשרים הערכת אורך יקר. עם כניסתו של ייעודיים קטנים רנטגן בעלי חיים טומוגרפיה ממוחשבת (CT) מערכות ונהלים אנליטיים אישית, הן איברים וניתוחים באזור מסוים של חלוקת שומן פרופיל האורך יכול להיות אפשרי. דיווחים אחרונים אימתו את השימוש CT עבור בתחום ההדמיה vivo האורך של השמנה בעכברים חיים. ^5,6 כאן אנו מספקים שיטה שונה המאפשר מדידת שומן / הכולל נפח, ניתוח להדמיה ניצול מערכת הדמיה מולקולרית Carestream Albira CT יחד עם חבילות PMOD ו Volview תוכנה.

Protocol

1. בעלי חיים

1. לקבלת תוצאות דיווחו להלן, שלושה עכברים C57BL/6J וארבעה B6.V-הלפריקונים ^OB / י עכברים התקבלו ג'קסון מעבדות (בר הרבור, מיין, ארה"ב). B6.V-הלפריקונים ^OB / י עכברים לייצג את אחד הדגמים הראשונים של חקר השמנת יתר ולהישאר פעיל. B6.V-הלפריקונים ^OB / י עכברים להציג פנוטיפ מתאפיין בגודל adipocyte מספר גדל והוא יכול לשקול עד פי שלושה יותר מאשר עכברים מסוג בר. ^7,8 כאן B6.V-הלפריקונים ^OB / י עכברים הועסקו חיובית שליטה על הפנוטיפ שמנים כדי להמחיש את הכדאיות של מערכת Albira CT עבור ה-CT מדידות מבוססי שומן.
2. ההדמיה בוצעה כאשר החיות הגיעו כ 12 שבועות. (השמנת יתר אצל עכברים B6.V-הלפריקונים ^OB / י בא לידי ביטוי לאחר 4 שבועות של גיל).
3. העכברים היו הרדים ידי Isofluorane (קצב הזרימה 2.5%) ואת כל הזמן תחת ב -2.5% באמצעות הגדרת האף חרוט הדמיה.imals הוצבו מועדים במיטה עכבר סטנדרטי (M2M הדמיה בע"מ קליבלנד, אוהיו) ב מסופק עם תחנת התמונה Albira. גפיים הוצבו לרוחב מהגוף לרכישת CT אחיד.
4. לאחר רכישת התמונה הושלמה, עכברים הוצאו מן קונוס האף וחזר לכלוב התאוששות עד אמבולטורי.

2. תמונה רכישת ושיקום

1. הרכישות מבוצעות באמצעות תמונה CT Albira המערכת (Carestream מולקולרית והדמיה, Woodbridge, CT). העכברים היו הרדים ידי Isofluorane (קצב הזרימה 2.5%) ואת כל הזמן תחת ב -2.5% באמצעות הגדרת האף חרוט הדמיה. הרכישות בוצעו לסרוק מיטה באורך 115 מ"מ, באמצעות 600 התחזיות. מקור קרני ה-X נקבע הנוכחי של μA 200 ומתח של kVp 45, והשתמשו 0.5 מ"מ אל מסנן קרן להקשיח.
2. קרינה משוער עמוקה במינון שווה ערך עבור הגדרות ה-CT היה 220 mSv, ואת שווה ערך למינון הרדוד היה 357.4 mSv. אלהמינונים של מעל 20-לקפל LD50 ערכים נמוכים יותר מכפי שדווח. ⁹
3. תמונות מחדש באמצעות אלגוריתם (הקרנה לראש מסונן) FBP דרך Suite 5.0 Albira Reconstructor באמצעות "התקן" פרמטרים. אלה רכישת משולב שחזור הגדרות לייצר התמונה הסופית עם 125 מיקרומטר ווקסלים איזוטרופיים, שדי לניתוח בעל חיים שלם. לניתוח מפורט באזור מסוים, שיחזור עם 35 ווקסלים איזוטרופיים מיקרומטר ניתן לבחור לפתרון הסופי של 90 מיקרומטר.

3. ניתוח תמונה

ניתוח התמונה מתבצע באמצעות תוכנה (PMOD טכנולוגיות בע"מ, ציריך, שוויץ) PMOD ניתוח. תמונות הן מפולח ב PMOD פי צפיפות הרקמה 1 עבור הנפח הכולל ולאחר מכן עבור נפח שומן.

3.1 תמונות עשוי לרדת לניתוח כדי למזער את דרישות חישוביות.

1. כדי להקטין, נווט בכרטיסיה תצוגה הראשי.
2. בחר כלים> הפחת.
3. בחר על ידי X 2, Y של 2 ו-Z של 2.
4. לבדוק החלף.
5. בחר הפעלה.

הודעה: "תיבה תוחמת ישתנה" מציג פעם ירידה הושלמה.

3.2 דמויות יכולות להיות רעולי פנים כדי למנוע שינה והאף, חרוט אלמנטים עבור ניתוח שלאחר מכן (VOI) בנפח של ריבית.

1. כדי להסוות, לנווט מטוסים, פריסות, סיבוב, מראה, סמנים 3D> מטוסים שימוש פריסות.
2. בחר הצג המטוס Z.
3. גלול אל חרוט אף במישור Z.
4. בחר את הכרטיסייה ראשי VOI> צייר קודקודים.
5. צייר אזור של עניין (ROI) סביב החיה באף לא כולל לינה וארוחת חרטומו.
6. לבחורהעתק את ההחזר על ההשקעה בפועל.
7. מעבר הפרוסה הבאה, ולהדביק את ההחזר על ההשקעה של חיץ בין המטוסים הרלוונטיים של האף.
8. השתמש ערוך קבוצה של קודקודים להתאים ROIs לפי הצורך.
9. בחר מחק את ההחזר על ההשקעה על המטוסים הראשונים מעבר קונוסים האף.
10. צור VOI חדש להקיף את היקף בעלי החיים (למעט המיטה בעלי חיים) על המטוסים הראשונים מעבר קונוסים האף.
11. נווט מסוך VOI> כלים & אלגברה.
12. הזן -1000 בתיבת הדיאלוג סיפק.
13. בחר את ווקסלים מסכת מחוץ כפתור VOIs שנבחר.

הודעה: ". פעולה בלתי הפיכה נתונים אתה רוצה להמשיך?" מציג.

14. בחר כן.
15. כדי לנווט מטוסים, פריסות, סיבובים, מראה סמנים 3D> מטוסים & הנחפסקי.
16. בחר הצג את כל המטוסים.
17. לבחון את VOI שלמות.
18. בחר שמור.
19. שמור כמו ניתוח.
20. לשנות את קידומת שם קובץ.

3.3 הקטע הראשון, התמונה להגדלה בנפח חיים הכולל:

1. בחר כלים> חיצוני.
2. בחר בתיבת הסימון פילוח.
3. הזן מגוון -300 עד 3500 (טווח צפיפות התייחסות נגזר טווח שומן באזור הבטן צפיפות).
4. בחר הפעלה פילוח.
5. בדוק את שלמות פילוח.
6. לחץ על אישור.
7. בחר הסר את ההחזר על ההשקעה.
8. בחר VOI לסטטיסטיקה.

הסטטיסטיקה מדווחים לייצג את הנפח הכולל.

9. רשום את נפח דיווח.

3.4 קטע הבא, התמונה להגדלה נפח שומן:

1. חזור אל התמונה הלא מפולח רעולי פנים על פילוח שומן נפח.
2. כדי לטעון את קובץ הנתונים נשמר רעולי פנים, סמן את התיבה ניתוח בחלון Load).
3. בחר כלים> חיצוני.
4. בחר בתיבת הסימון פילוח.
5. הזן מגוון -200 ל -50.
6. בחר הפעלה פילוח.
7. בדוק את שלמות פילוח.
8. לחץ על אישור.
9. בחר VOI לסטטיסטיקה.

הנתונים הסטטיסטיים המדווחים מייצגים את נפח שומן.

10. רשום את נפח דיווח.
11. בחר שמור.
12. שמור כמו ניתוח.
13. לשנות את קידומת שם קובץ.

אופציונלי: אם העור / צפיפות ההיקפית נשארת, "שחיקת והתרחבות" פרוטוקול בהמשך ניתן לבצע לחסל את האזורים הללו לניתוח VOI.

1. בחר כלים> חיצוני.
2. בחר בתיבת הסימון מורפולוגי. את התצוגה מציג מורפולוגי.
3. בחר שחיקה.
4. לחץ על אישור.
5. בחר כלים> חיצוני.
6. בחר בתיבת הסימון מורפולוגי. את התצוגה מציג מורפולוגי.
7. בחר התרחבות.
8. לחץ על אישור.

4. ויזואליזציה של תמונות ה-CT

4.1 VolView v3.2 (Kitware, קליפטון פארק, ניו יורק, ארה"ב) נוצל ליצירת שניתנו הצגה ויזואלית של תמונות 3D מפולח.

פתח את נתוני ה-CT שנקבעו ניתוח עיצוב.
1. להשתמש בהגדרות ברירת המחדל של חלון קופץ.
2. לפתוח את התפריט תוספות.
3. במסגרת השירות, בחר מיזוג כרכים.
4. לבטל את הסימון רכיבי Rescale.
5. לחץ על הקצה השני קלט.
6. בחר את הנתונים שומן לפלחים בשביל קלט 2.
7. להשתמש בהגדרות ברירת המחדל של חלון קופץ.
8. לחץ על החל התוספת.
9. לחץ פעמיים על תצוגה כרך חלון תצוגה גדול יותר של העכבר את הנושא.

4.2 חזור אל הכרטיסייה 'צבע / אטימות. בתיבה הנפתחת מרכיב מתייחס אליו סט הנתונים כעת בעריכה. שני המחוונים ממוקמים בחלק התחתון של הכרטיסייה ולקבוע את הבהירות היחסית של כל רכיב נתונים שנקבעו בתוך כיסוי, תוך שימוש בערכים 0 עד 1. עבור 1 רכיב, הה-CT, אנחנו מעדיפים להשתמש בגווני אפור ערכת הצבעים. כדי לשנות את הצבע:

1. במקטע צבע סקלר מיפוי, לחץ פעמיים על אחד מחווני הצבע.
2. כדי להסיר את המחוון, גרור אותו מחוץ לקופסה.
3. כדי להוסיף מחוון חדש, לחץ במקום כלשהו בתוך השטח המחוון.
4. הסר אחד המחוונים.
5. הפוך את המחוון שמאלה בצבע שחור (ערך סקלרי (S) = -19,000).
6. תן זכות צבע המחוון הלבן ((S) = 15,000).
7. מתיבת אטימות סקלר מיפוי, ליצור נקודה חדשה על ידי לחיצה בתוך התיבה. זה ייתן בסך הכל שלוש נקודות החלון.
8. עבור נקודת התיכון, לשנות את (ים) ~ -3000, ואת אטימות (O) ערך 0.
9. בחר את הנקודה השלישית בחלק הימני של החלון.
10. שינוי (ים) על 32,000, ו O ל 0.25.
11. הנקודה הראשונה יכול להיות בכל מקום בצד שמאל, כל עוד הערך אטימות מוגדר 0.
12. שנה ל 2 רכיב, שאמור לערוך את המראה של שומן.
13. כל שינוי מחווני הצבע לאדום על ידי לחיצה כפולה ומחליקים הגוון (H) המחוון שמאלה למפה בצבעים מלאכותיים שומן לאדום. מעט מאוד אחר יש צורך להתאים את המראה של שומן.

4.3 על מנת ליצור סרט תלת פאנל סיבוב הצגת CT, שומן, כיסוי:

1. לחץ וגרור את העכבר הנושא למצב זקוף עם הגב פונה אליך.
2. תחת משקל רכיבים, להגדיר את הערך של רכיב 2 0 כדי להציג רק את בדיקת CT.
3. לחץ סקירה> מצלמה.
4. בחר מספר מסגרות FOr הסרט הסיבוב (במקרה הנוכחי, בחרנו "36").
5. שנה את הערך X כדי סיבוב 360 מעלות.
6. בחר 'צור'.
7. בתיבה הנפתח שיח, ליצור תיקייה חדשה בשם CT, ושמור את הקובץ בפורמט TIFF, אשר פלט סדרה של תמונות סיבוב.
8. חזור על פעולה זו עבור התמונה שומן, כמו גם תמונת השמן / CT מעולף, לשמור אותם בתיקיות נפרדות בכל פעם.

4.4 ImageJ V 1.43u שימש להפקת סרט סיבוב הקובץ באמצעות תמונות פלט VolView.

1. ב ImageJ, בחר> ייבוא ​​קובץ> התמונה ברצף.
2. בחר את התמונה הראשונה בתיקיה CT. התוכנה תזהה אוטומטית את הקבצים האחרים ולפתוח אותם בערימה.
3. חזור על כדי לפתוח את רצפי שומן כיסוי.
4. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה על פי ניתוח> כלים> ROIמנהל.
5. צייר ROI סביב העכבר את הנושא, לא כולל פיקסלים רקע מיותרים.
6. במנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על הוסף כדי להוסיף את ההחזר על ההשקעה.
7. בחר רצף תמונה שונה.
8. במנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על החזר ההשקעה כדי להחיל אותה על התמונה. באופן זה, כל אחד ערימות שנחתכו יתאים בצורה מושלמת.
9. כאשר ההחזר על ההשקעה על כל המדפים, לחץ לחיצה ימנית בתוך ההחזר על ההשקעה.
10. בחר כפולים.
11. לסמן את מחסנית כפולה להפריד את ההחזר על ההשקעה משאר התמונה.
12. סגור את ערימות תמונה גדולה יותר.
13. חזור על הליך זה עבור כל שלושת רצפי תמונות.
14. עבור תמונה> ערמות> כלים> שלב לשלב את ערימות יחד.
15. בחר CT עבור מחסנית 1.
16. בחר שומן עבור מחסנית 2.
> חזור ובחר ערמות משולב עבור מחסנית 1 ו כיסוי עבור מחסנית 2.
17. יש כעת שלושה הפאנל, סיבוב תמונה מחסנית זה יכול להיות בתצוגה המקדימה על ידי בחירת נגן בפינה השמאלית התחתונה של חלון התמונה.
18. כדי לשמור את הסרט כ AVI, בחר קובץ> שמירה בשם ...> אבי ...
19. לחץ על שמור.

5. נציג תוצאות

תוצאות עבור שלושה WT (C57BL/6J) עכברים 4 שמנים (B6.V-Lep ^ob / י) עכברים מדווחים כאן כדוגמה מייצגת של שומן / סך יחס מדידות נפח המעסיקים את מערכת ה-CT Albira. איור 1 להלן מספק נציג התצוגה שנוצר עם VolView v3.2 עבור פילוח (כלומר הנפח הכולל ונפח השומן) של תמונות עכברים שמנים CT.

0/3680fig1.jpg "/>
באיור 1. נציג ה-CT תמונות לפלחים בשביל שומן. () שמנים העכבר (B6.V-Lep ^ob / י) נפח CT הכולל בגווני אפור, (ב) נפח שומן באדום, ו (ג) היתוך התמונה. (ד) WT העכבר (C57BL/6J) בנפח כולל CT בגווני אפור, (ה) היקף השומן אדום, (F) היתוך התמונה.

כרכים סך הכל, אמצעי אחסון השומן, וחישב יחס נפח שומן / סך מדווחים להלן העכבר כל WT וכל העכבר שמנים בטבלה 1. יחס ממוצעים של שומן / נפח הכולל של הקבוצה WT והקבוצה מהשמנת יתר היה 0.09 ו - 0.42 בהתאמה (איור 2). שומן / הכוללת את יחסי נפח של העכברים WT לעומת עכברים שמנים נמצא הבדל מובהק (p = 0.001).

WT (C57BL/6J)	סך הכל (ס"מ 3)	שומן (ס"מ 3)	שומן / סה"כ יחס	השמנת יתר (B6.V-Lep OB /)	סך הכל (ס"מ 3)	שומן (ס"מ 3)	שומן / סה"כ יחס
בעלי חיים 1	28.79	3.00	0.10	בעלי חיים 1	66.25	26.75	0.40
בעלי חיים 2	33.25	3.05	0.09	בעלי חיים 2	61.15	26.31	0.43
בעלי חיים 3	30.30	2.63	0.09	בעלי חיים 3	64.19	25.7	0.40
				בעלי חיים 4	54.25	23.78	0.44

טבלה 1. הנפח הכולל, נפח שומן,ויחסים נפח שומן / סך של עכברים WT והשמנה. כרכים סך הכל ושומן נגזרו תמונות מקוטעות באמצעות ניתוח PMOD VOI.

איור 2. בממוצע יחסי נפח שומן / סך של עכברים WT לעומת עכברים שמנים. פי הממוצע שומן / סך יחס נפח של WT (C57BL/6J) והשמנה (B6.V-Lep ^ob / י) שנמצאו 0.09 ו - 0.42 בהתאמה מוצגים. (ברים שגיאה = סטיית תקן אחת). WT לעומת שמנים שומן / הכוללת יחסי נפח נמצאו הבדלים משמעותיים (p-value = 0.001).

Discussion

כאן, תוך שימוש בעכברים B6.V-הלפריקונים ^OB / י לנו הדגימו את הכדאיות של ביצוע מדידות תכולת השומן במודל חיה קטנה באמצעות מערכת ה-CT Albira. מדידות אלה עולים בקנה אחד עם ציפיות השוואות של קבוצת הפנים וקבוצת בין המדידות. ראשית, התוצאות מייצגות הניתן כאן להדגיש השונות מוגבלת התוך קבוצה מדידות של שומן / סך יחס נפח של שתי קבוצות עכברים WT והשמנה באמצעות הליכים אלה. שנית, שומן / סך יחס נפח של עכברים WT לעומת שמנים שונים משמעותית. לבסוף, בהתבסס על השוואות (לא מוצג) עם ערכים קודמים דיווחו על מסת השומן היחסית סך השומן בגוף אחוז לעומת WT B6.V-הלפריקונים ^OB / י עכברים, שלנו מדידות של שומן / סך יחס נפח של WT לעומת B6.V- הלפריקונים ^OB / י עכברים ליפול בטווח הצפוי, ^{7, 8.}

השיטות שפורטו כאן יכול להיות מיושם או מותאמת מ 'השניodels ו / או מטרות המחקר. שינויים בפרמטרים השיקום עשויים להידרש כדי להשיג מטרות מסוימות. לדוגמה, Judex et al. (2010) דיווחו כי 50 תמונות ברזולוציה מיקרומטר נדרשו לניתוח כלשהו באזור מסוים. אחד הכרכים איזוטרופיים ס"מ של התמונה ניתן לבחור 35 שחזורים מיקרומטר Reconstructor 5.0 סוויטה Albira באמצעות "משאבי אנוש" אפשרות שחזור. לאחר מערכת ה-CT Albira נוצל לאזור ועוגב מדידות ספציפיות תוכן שומן היתרונות מלא (כלומר האזור בו זמנית ועל איברים ספציפיים מדידות שומן נפח מדידות אורך) של ניתוח תוכן מבוסס-CT שומן הבא לידי למערכת Albira CT.

מסקנות:

כאן אנו מספקים צעד מפורט, בשיטת צעד למדידת תכולת השומן בעכברים חיים באמצעות צילום רנטגן CT הדמיה. רכשנו נתוני CT שנו באמצעות תחנת התמונה Albira, וביצע לאחר פילוח ואנהתמוגה באמצעות חבילת התוכנה PMOD. לבסוף, אנו מספקים הוראות כדי לאפשר עיבוד קליל ויזואליזציה של התפלגות רקמת שומן בתוך חיה כולו.