יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

Summary

תיאור של שיטות להמיר HP DeskJet 500 המדפסת לתוך bioprinter. המדפסת מסוגלת עיבוד תאים חיים, מה שגורם הנקבוביות חולפים על הממברנה. נקבוביות אלה יכול להיות מנוצל לשלב מולקולות קטנות, כולל ניאון G-אקטין, לתוך תאים מודפסים.

Abstract

Bioprinting יש מגוון רחב של יישומים ומשמעותם, כולל הנדסת רקמות, טיפולים ישירים יישומים סלולריים, microfabrication biosensor. ^1-10 לאחרונה, הדפסה הזרקת דיו תרמית שימש גם עבור transfection הגן. ^8,9 תהליך הדפסת דיו תרמית הוצגה זמני לשבש את קרום התא מבלי להשפיע על כדאיות התא. הנקבוביות חולפות בקרום ניתן להשתמש כדי להציג את מולקולות, אשר היה אחרת להיות גדול מכדי לעבור דרך הממברנה, לתוך הציטופלסמה של התא. ^8,9,11

יישום שמפגינים כאן הוא השימוש הדפסת דיו תרמית על שילוב של מונומרים שכותרתו fluorescently G-אקטין לתוך התאים. היתרון בשימוש הדפסה הזרקת דיו תרמית להזריק מולקולות לתוך תאים היא הטכניקה היא סבירה יחסית לתאים. ^{8, 12} כדאיות התא לאחר ההדפסה הוכח להיות דומה לתא PLA תקןטינג שיטות ^1,8. בנוסף, הדפסת דיו יכול לעבד אלפי תאים בתוך דקות, שזה הרבה יותר מהר מאשר microinjection ידנית. בנקבוביות נוצר על ידי הדפסה הוכחו להיסגר בתוך כשעתיים. עם זאת, אין הגבלה על גודל הנקבוביות של יצירה (~~~HEAD=NNS 10 ננומטר) עם טכניקה זו הדפסה, אשר מגביל את הטכניקה כדי הזרקת תאים עם חלבונים קטנים ו / או חלקיקים. ^8,9,11

תקן HP Deskjet 500 Printer שונה, כדי לאפשר הדפסה התא. ^{3, 5, 8} הכיסוי של המדפסת הוסר מנגנון הזנת הנייר היה לעקוף באמצעות מנוף מכני. בשלב נוצר כדי לאפשר הצבת של שקופיות מיקרוסקופ ו coverslips ישירות תחת ראש ההדפסה. מחסניות דיו נפתחו, דיו הוסר והם נוקו לפני השימוש עם תאים. דפוס הדפסה נוצר באמצעות תוכנת ציור רגיל, אשר לאחר מכן נשלט על המדפסת באמצעות הפקודה הדפסה פשוטה. 3T3 fibroהפיצוצים היו גדולים כדי המפגש, trypsinized, ו resuspended מכן לתוך פוספט שנאגרו מלוחים עם מסיסים G-אקטין מונומרים שכותרתו fluorescently. ההשעיה התא pipetted לתוך מחסנית דיו שורות של תאים הודפסו על גבי זכוכית מיקרוסקופ תלושי כיסוי. התאים היו חיים צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו אקטין נמצא ברחבי הציטופלסמה. שילוב של אקטין פלואורסצנטי לתוך התא מאפשר הדמיה של זמן קצר הדינמיקה cytoskeletal והוא שימושי למגוון רחב של יישומים. ^13-15

Protocol

1. המרת HP DeskJet 500

יש לציין כי טכניקה זו צריך לעבוד הרבה עם מדפסות הזרקת דיו מסחרית. עם זאת, מדפסות ישנות יותר נוטים לפעול טוב יותר כאשר הם משתמשים מחסניות דיו עם חרירים בקוטר גדול יותר, אשר לא סותמים באותה קלות. בנוסף, מדפסות מבוגרים נוטים להשתמש מכניים הזנת הנייר חיישנים כי הם יותר קל לעקוף. מדפסות עם חיישנים אופטיים יכול להיות מרומה אלא באמצעות רצועת נייר קטנה בקצה המרוחק של המדפסת במהלך כל מחזור, אבל הוא קצת קשה יותר מאשר מערכת מכנית "טריק". מדפסות כרגע זמינים מסחרית שהעבודה הטובה ביותר יש רזולוציה נמוכה (DPI).

מדפסות ברזולוציה גבוהה יותר נוטים להדביק בקלות רבה יותר. רזולוציה של HP Deskjet 500 הוא 300 DPI. יש מדפסות מסחריים רבים (HP Deskjet סדרת ואחרים) בעלי רזולוציה של 600 DPI. סוג זה של המדפסת ניתן להשתמש עם עלייה קטנה בלבד בנחירסתימת נושאים ניתן להקל באמצעות ניקוי זהיר (סעיף 3).

1. להסיר את מעטפת הפלסטיק העליון של המדפסת על ידי פותח קליפים פלסטיק כמה מהבסיס התחתון של המדפסת ולאט לאט להרים את המכסה.
2. פתחו את הברגת כפתור / תצוגה אור לוח מלמעלה של המדפסת, משאיר אותו מחובר אל לוח האם של המדפסת.
3. נקו את החלק הפנימי של המדפסת, במיוחד באזורים בהם מחסנית הדיו נח שם הדפסה מתרחשת.
4. אתר את כבלי אספקת החשמל מנגנוני הזנת הנייר ונתק בינם לבין האם.
   1. ב-HP DeskJet 500, אלה נמצאים ממש מתחת מגש הנייר לכיוון השמאלי של החזית.
5. אתר זיהוי מנגנון נייר. לעקוף את המנגנון על ידי הדבקת מחרוזת או לולאת תיל לשמש ידית משיכה ידנית.
   1. ב-HP DeskJet 500, מנגנון זיהוי נייר הוא מנוף הפלסטיק האפור נמצא מעל ומאחורי מנגנון הדפסה / נייר ההזנה.
6. יצירת הבמה מול מנגנון הזנת הנייר (שם נייר יהיה מוזן מ והפקיד) על מנת להביא את השקופיות ההדפסה הרצוי לרמה בדיוק מתחת לראש מחסנית הדפסה.
   1. על הניסויים שלנו, משלוח קצף בעל 15 צינורות צנטריפוגות מ"ל שימש עם שקופיות מיקרוסקופ מספר מוקלטות במקום באזור ההדפסה כדי להביא את רמת הסופי של השקופיות לגובה הרצוי.
7. כדי לשמור על טכניקה מזוהם, המדפסת יכול להיות ממוקם בתוך ארון Biohazard רגילה או למינרית השולחן מכסה המנוע לזרום.
8. חשוב לציין כי שינוי זמינים מסחרית הזרקת דיו למדפסת בדרך כלל להפר את האחריות אל יצרן המדפסת.

2. המרת מניות של HP מחסניות דיו (HP 26 ראש דיו שחור)

1. הוצא את המחסנית מהאריזה שלו, עוזב את הסרט המגן מכסה את הקשר המדפסת ראש ההדפסה עבור בינתיים.
2. לייצב את הגוףשל מחסנית (החלק השחור) או עם מהדק או מלחציים (פשוט לופת בחוזקה את מחסנית ביד בדרך כלל עבד גם כן), עוזב ראשיות הירוק של מכשול כלשהו.
3. באמצעות צבת או מפתח ברגים מתכוונן, לתפוס את החלק העליון הירוק של מחסנית ולסובב הלוך ושוב מספר פעמים עד שהוא משתחרר.
   1. זה לא צריך לקחת בכוח רב, אבל את החלק העליון כבר אינו נחוץ, אז זה בסדר אם זה שובר כאשר הסרתו.
4. באמצעות מברגים, לחלץ את פיסת פלסטיק שקופה נחשף עכשיו.
   1. שוב, זה לא צריך לקחת הרבה כוח, אבל זה לא יהיה צורך, אז זה בסדר אם זה שובר במהלך ההסרה.
5. לרוקן כל שנותר מן המאגר.
6. הסר את הסרט מגן פלסטיק המכסה את המגעים המדפסת ראש ההדפסה.
7. לשטוף היטב את מאגרי מים.
   1. השתמש טפטפת או מזרק לדחוף את המים דרך הערוצים.
   2. מים צפוי להדליף מהראש במהלך ההדפסהתהליך זה, זה מקובל, ואינו גורם נזק לפעולה התקינה של המחסנית.
8. כשהמים פועל ברורה, לאפשר המחסנית לייבוש.

3. ניקוי דיו

1. על מנת לשמור על סביבה נקייה הדפסה, מחסנית הדיו יש לנקות לפני ואחרי השימוש.
   1. זה גם עוזר עם מניעת התגבשות מלחים חומר ביולוגי אחר מחסנית שעלולה לגרום חסימות.
2. מלא להטביע את מחסנית בכוס מלאה במים דה מיונן, ו sonicate במשך 15 דקות לפני ואחרי ההדפסה.
3. לאחר sonication, להסיר את המחסנית מתוך המים, לנער את עודפי המים.
4. תרסיס אתנול 70% לתוך המחסנית כדי ליצור סביבה יותר מזוהם.
   1. ודא אתנול התייבש לפני הוספת פתרון הדפסה bioink.

4. ביצוע השעיה Cell - "ביודיו "

1. תאים והתרבות עד מוכנים למעבר.
   1. עבור fibroblasts 3T3: תאים זרעים על T-75 צלוחיות על כ 1.3x10 ⁴ תאים / ס"מ ² ב Dulbeccos שינוי הנשרים בינוני (DMEM) עם סרום 10% שור עוברית (FBS). תאים תרבות יומיים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. הפוך את הפתרון ניאון G-אקטין המניות בריכוז 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​בפתרון פוספט חוצץ (PBS).
3. המעבר התאים.
   1. עבור fibroblasts 3T3: הסר מדיה הבקבוק ולשטוף פעמיים עם PBS. לכסות את התאים עם 5 מ"ל 0.25% + טריפסין EDTA ו דגירה במשך 5 דקות.
   2. הוסף 5 מ"ל של מדיום טרי פיפטה ההשעיה התא לתוך צינור מ"ל 15 צנטריפוגה צנטריפוגה חרוטי ו בסל"ד 1000 דקות 5. Aspirate בילה בינוני.
4. Resuspend התאים PBS עם פתרון ה-G-אקטין המניות ניאון ליצור bioink.
   1. Bioink צריך הריכוז הסופי של ה-G-אקטין של מיקרוגרם 10 / מ"ל ​​ו שותף לתאncentration של 1x10 ⁵ תאים / מ"ל. ריכוז זה עבר אופטימיזציה כדי להגביל את כמות התאים לכל טיפה ואת סתימת ראש המדפסת. ⁸
   2. שים לב, 250 μl של bioink מדפיסה שלושה תלושי מכסים תבנית שמוצג באיור 2.

5. Bioprinting

1. הפעל את המדפסת ולתת להתחמם.
2. במקום משטח ההדפסה הרצוי (כאן, אנו משתמשים 22 מ"מ x 22 מ"מ coverslips) על מרכז הבמה מוכנה בשלב 1.6.
3. יצירת קובץ תבנית ההדפסה.
   1. פתח את Microsoft Word (או כל תוכנת ציור אחרת), ולצייר את התבנית הרצויה.
   2. בחר תבנית ההדפסה הרצוי להדפסה התא בקובץ את התערובת של העוגיות.
4. טען את המחסנית מוכן עם ההשעיה התא הרצוי.
   1. פיפטה ההשעיה לתוך עגול קטן גם בחלק התחתון של תא מחסנית. השתמש כ 100-120 μl של פתרון. גודל טיפה מודפס הוא בסביבות 130picoliters ^8.
5. להדפיס את הקובץ עם מדפסת HP Deskjet 500.
   1. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להדפיס תבניות קטנות יותר מספר רב של פעמים (5), על ידי שינוי כמות עותקים הרצויה בתוכנית עיבוד תמלילים.
6. מדפסת יהיה לחמם שוב, ואז המחסנית יעברו "העמדה מוכן".
7. כאשר המחסנית עובר למצב מוכן (מעט שמאלה של טפטוף דיו הרבה מתחת ונשאר שם), משוך על חוט מנגנון הזנת הנייר, ודפוס שצריך להתחיל.
   1. במשך מספר עותקים של הדפסה, מנגנון הזנת הנייר יהיה להשתחרר אחרי כל מחזור או דף מודפס. המחסנית לאחר מכן לחזור למצב "מוכן", ואת חוט מנגנון הזנת הנייר יש להעלות שוב.
8. המדפסת תדפיס על coverslip דגש על מרכז הבמה הדפסה בשלב 5.2 (ראה תרשים 2).

6. תוצאות נציג

התוצאות מייצגות של תהליך ההמרה של כל תקן, מדף-HP Deskjet 500, 26 מחסניות סטנדרטיות של HP מסדרת ייצור מדפסת עם יכולת של פתרונות הדפסה ניידים עבור סוגים רבים של ניתוח כאמור קודם לכן. המדפסת הושלמה לאחר ההמרה מוצגת באיור 3, כאשר בשלב ההדפסה למקם את תלוש כיסוי מיקרוסקופ על. המדפסת יכולה להיות שימושית בניתוח בתחומים רבים, כולל אך לא רק: מכניקת תאים בודדים, הנדסת רקמות, transfection גן, micropatterning biosensor, וטיפולים סלולריים ישירות ^{1-10, 16-22.}

בדוגמה זו, HP Deskjet 500 Printer ו-HP 26 מחסניות דיו סדרת שונו עבור bioprinting. באמצעות הגדרת מדפסת זו עם bioink המורכב ההשעיה פיברובלסטים תא פתרון ה-G-אקטין מונומר, תאים הודפסו על גבי זכוכית מיקרוסקופ coverslips. איור 1 מדגים מיל נציג אולטס של תאים פיברובלסטים מודפסים, אשר מראים המשולבים מונומרים אקטין פלואורסצנטי. התוצאות התקבלו בסביבה מבוקרת מזוהם שבו התאים הודפסו לתוך תבניות הניתנות להתאמה אישית.

דפוס שימוש בדוגמה זו נוצרה ב-Microsoft Word (איור 2). דפוס זה נוצר קו רציף של פתרון הדפסה על רוב שקופיות מיקרוסקופ. איור 4 מראה קו ישר שבו bioink ותאי מופקדים הדדית. יש לציין כי מיד לאחר ההדפסה, יש גידול של הקרינה רקע כי הפתרון bioink, שבו התאים מושעים, מכיל חינם מונומרים עודף אקטין ניאון. זו הקרינה רקע מקטין באופן משמעותי לאחר תוספת של בתקשורת הצמיחה על התאים (איור 1), אשר שוטף מונומר העולה מן המצע.

ad/3681/3681fig1.jpg "/>
באיור 1. תמונות נציג של fibroblasts 3T3 3 שעות לאחר הדפסה באמצעות מדפסת הזרקת דיו שונה. הפנים של התאים להראות המשולבים מונומרים אקטין מתויג fluorescently. ברים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר.

איור 2. עיצוב השתמשו להדפיס bioink.

איור 3. מדפסת לאחר ההמרה עם הבמה קלקר. החוט הכתום באמצע עוקף את הזנת הנייר חיישן מנוף.

איור 4. התמונה נציג fibroblasts 3T3 מודפסים באזור דפוס מקומי. תמונה מיקרוסקופית לקח 5 דקות לאחר ההדפסה בהגדלה 20x.

/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
איור 5. התמונה פלואורסצנטי (בהגדלה 40X) לקח 3 שעות לאחר ההדפסה מראה פיברובלסטים עם מופנמים מונומרים אקטין ניאון. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר.

איור 6. מיקרוסקופיה פלורסנט (20x הגדלה) של תא לקח 15 דקות לאחר ההדפסה. התמונה מראה גם G-אקטין (ירוק) ואת גרעין (כחול). משמאל לימין: G-אקטין עם Alexa פלואוריד 488, הגרעין עם DAPI, וכן כיסוי של שניהם.

איור 7. מיקרוסקופיה פלורסנט מראה שני fibroblasts בתבנית שורה 3 שעות לאחר ההדפסה. התמונה משמאל מראה מונומרים אקטין שכותרתו fluorescently בתוך התאים. התמונה מימין היא כיסוי של ערוץ ניאון עם תמונת הרקע להראות כי למרותייתכנו כמה פסולת בשקופית (בפינה השמאלית התחתונה), זה לא לזרוח. ברים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר אם הגודל לא הצביע על הימין הקיצוני היא קבוצת הביקורת שאינם מודפסים תאים מודגרות במשך 3 שעות עם מונומרים מתויג fluorescently. שליטה זו היא להראות כי מונומרים לא יכול לחדור את קרום התא ללא permeabilization קרום התא על ידי הדפסה.

Discussion

תהליך להמיר רגילות למדפסת הזרקת דיו עבור שולחן העבודה bioprinting לא קשה במיוחד. השלב המאתגר ביותר הוא לקבוע כיצד לעקוף את מנגנון הזנת הנייר, אשר תלויה המותג והדגם של המדפסת בשימוש. עם זאת, זה פשוט יחסית, כאשר חיישן הזנת הנייר הוא מכני, כמתואר כאן. עבור דגמים עם חיישנים אופטיים להאכיל, טכניקות אחרים עשויים צריך להיות מועסק על מנת להערים על מדפסת לחשוב זה היא באמצעות נייר, למשל, אפשר להפעיל פיסת נייר קטנה דרך המדפסת בזמן שהוא מדפיס בשקופית מיקרוסקופ. עקיפת מנגנון הזנת הנייר עשויה להיות הצעד הקשה ביותר ליישום נהלים אלה למודלים מדפסת אחר.

כאשר בניית השלב להחזיק את coverslips להדפסה, חשוב כדי להבטיח יישור גובה תקין. שלב צריך לאפשר coverslip כדי להיות ממוקם באמצע אזור ההדפסה. בנוסף, הוא צריך PLאייס coverslip בגובה מספיק כדי לאפשר פינוי של מחסנית ההדפסה לעבור על השקופיות מבלי לשבש אותה. הגובה המדויק של הבמה תלוי בדגם המדפסת.

על מנת להבטיח כי תאים מודפסים לא מקבלים שטף, השקופיות הונחו באינקובטור מיד לאחר ההדפסה למשך כ 30 דקות, כדי לאפשר התקשרות לתא לפני נוספות הצמיחה מדיה תא נוסף. כי התאים הודפסו הפתרון הכולל כמויות גדולות של PBS התאים לא התייבש ונותר בת קיימא. התאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין את חלוקת ה-G-אקטין מונומרים מתוייגים בתוך התא (איורים 1, 5-7). בעת הדפסה עם fibroblasts 3T3, איור 5 מראה תוצאה מייצג, עם אקטין גורם הרבה של התא כדי לזרוח, אבל לראווה שורות בהירות מוגברת. שילוב של מתויג fluorescently G-אקטין את cytoskeleton הואשימושי לחקר הדינמיקה cytoskeletal ומכניקה סלולריים. ^12-15 הגבלה של הטכניקה הזו הוא שהיא חלה רק על מולקולות וחלבונים בעלי קוטר קטן יותר מאשר כ 10 ננומטר.

על מנת להבטיח כי התאים היו ממש בטיפול ידי המדפסת המרה, DAPI (1:5000 ב PBS) נוספה bioink במקום מחצית מהיקף טהור PBS. DAPI כתם ניאון נקשר מנות חומצות האמינו העשירות של ה-DNA הנמצאים בגרעין. לכן DAPI הוא כתם שימושי גרעינים fluorescently הדמיה של תאים מודפסים. איור 6 מציג תמונה מייצגת של תא מציג גם פלואוריד Alexa 488 (אקטין) ו DAPI (גרעין) פלואורסצנטי עם תמונה כיסוי של שניהם. איור 7 גם ממחיש עד כמה התאים יהיה לזרוח פעם את G-אקטין מונומרים שולבו בזמן הלא ביולוגית חומר הופקד לתוך המדגם לא לזרוח בגלל absencדואר של G-אקטין מונומרים.

שיקול אחד חשוב bioprinting היא התקשורת מימית בשימוש עבור bioink. נמצא כי באמצעות תקן התקשורת הצמיחה סלולריים עם סרום הניבו תוצאות לא עקביות. זהו ככל הנראה בשל סתימת של הדפסה חרירי ראש שנכתבו על ידי חלבונים בדם. השימוש PBS גדל עקביות של דפוסי המודפסים ומספר תאים שהופקדו. חסרון אחד לשימוש PBS היא לא התאים יש להשאיר את ההשעיה לתקופות זמן ממושכות. עם זאת, fibroblasts בדוגמאות הללו היו מסוגלים לסבול את התנאים bioink במשך שעה לפחות ללא שינוי כדאיות התא. זה עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים מספר, אשר מדווחים כי תאי מודפסים באמצעות מנגנוני הזרקת דיו תרמית הוכחו יש שיעור גבוה הכדאיות. ^2-8

הגדרת מדפסת שונה יכול לשמש ליישומים אחרים מלבד הדפסה התא. ^16-22 חלבונים מטריקס, כגון קולגן או fibronectin, ניתן להדפיס בקלות על גבי מצעים בעזרת טכניקה זו, אשר יכול להיות שימושי עבור דפוסים התא. עבור סוג, למשל קולגן הדפסתי את דפוסי קו תגרום מצעים קולגן מסודרים בהם ניתן להשתמש על התרבות תאים במבחנה. ¹⁷ בנוסף חלבונים מטריקס, מולקולות אחרות, כולל גורמי גדילה, יכול להיות מקומי אמין ללימודי תאים על מצעים וגם לפוטנציאל הריפוי. ¹⁸

המגבלה העיקרית של עיצוב תיאר את השלבים לעיל היא כי המדפסת הזו הוא לא מסוגל להדפיס בממד אחד או יותר. זה מגביל את הפוטנציאל לשימוש ביישומים בדוגמת כגון הדפסה הפיגום. כדי לאפשר הדפסה 3D, הבמה המקצועית צריך לשמש. שלב צריך להיות התאמות גובה מצטבר עבור בתצהיר שכבה אחר שכבה של bioink.

Bioprinting הוכיח הבטחה כשיטה יעילה וחסכונית עבור הנדסת רקמות,, Transfection micropatterning ו microarray ייצור הגן ^{1-12, 16-22} היישומים העתידיים של סוג זה של המכשיר הם רבים, כולל:. יצירת microenvironments הסלולר שבשליטת בדוגמת, שילוב של מקרומולקולות לתוך הציטופלסמה התא, וכן בתצהיר של תאים על פיגומים ומבנים שאינם באופן טבעי או ביעילות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
HP Deskjet 500	Hewlett-Packard	C2106A	הופסק מהיצרן. רכש טריידר שיפוץ דצמבר
HP 26 דיו שחור	Hewlett-Packard	51626A
מן השריר אקטין ארנב, Alexa פלואוריד המצומד 488, 200 מיקרוגרם	Invitrogen	A12373
פוספט שנאגרו מלוחים (PBS)	מגה פיקסל Biomedicals	ICN1860454
Dulbeccos שינוי הנשרים בינוני (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
בסרום שור עוברית	סיגמא אולדריץ	F4135
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	השתמשו ב 0.5% בתקשורת תרבית תאים
פניצילין, סטרפטומיצין	Sigma-Aldrich	P4333	השתמשו ב 0.5% בתקשורת תרבית תאים
זרימה חד כיווני ספסל נקי	Envirco	VLF 797	דיור לא חובה לשמירה על המדפסת אספטי