זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

Summary

מהיר ומדויק נקודה של טיפול מבחן aspergillosis ריאתי פולשני מוצג. הוא מנצל את הטכנולוגיה לרוחב זרימת באמצעות נוגדן חד שבטי ספציפי נקשר אספרגילוס מופרש במהלך דלקות ריאה. Assay תואם שטיפה בסרום brochoalveolar ומייצג מבחן נלווה חדשנית לאבחון המחלה.

Abstract

Aspergillosis ריאתי פולשני (IPA) הינו הגורם המוביל בתחלואה ותמותה בחולי ממאירות haematological ואת היווצרות הדם בתאי גזע מושתלי ^1. זיהוי של IPA מהווה אתגר אבחנתי אדיר ו, בהיעדר "תקן הזהב", מסתמך על שילוב של נתונים קליניים למיקרוביולוגיה אנליזה פתולוגית בכליה בו הדבר ניתן. אבחון של IPA חייבת להתאים הארגון האירופי למחקר וטיפול סרטן המכון הלאומי קונצנזוס (EORTC / MSG) לאלרגיה מחקר מחלות זיהומיות קבוצת תורת הפטריות הגדרת "מוכח", "סביר", ו "אפשרי" מחלות פטרייתיות פולשניות ² . נכון לעכשיו, אין גרעין חומצה המבוססים על בדיקות אומתו חיצונית לאיתור IPA וכך שרשרת פולימראז התגובה (PCR) אינו נכלל הקריטריונים הנוכחיים EORTC / MSG אבחון.

זיהוי של אספרגילוס בסעיפים היסטולוגית הוא בעייתי בגלל סימיlarities ב מורפולוגיות hyphal עם אחרים פתוגנים פטרייתיים פולשניים ^3, וזיהוי מוכחת דורש בידוד של סוכן האטיולוגי בתרבות טהור. תרבות על בסיס גישות לסמוך על הזמינות של דגימות ביופסיה, אך אלה לא תמיד נגיש חולים, ולא תמיד להניב propagules מעשית עבור התרבות כאשר מתקבל.

מאפיין חשוב בפתוגנזה של אספרגילוס הוא Angio הפלישה, תכונה המספקת הזדמנויות לעקוב אחר פטריות immunologically באמצעות בדיקות המזהים האופייניים חתימות מולקולות אנטיגני בסרום ו ברונכואלוואולרית שטיפה (BAL) נוזלים. זה הוביל לפיתוח של immunoassay האנזים Platelia (GM-EIA) המאתר אספרגילוס galactomannan ו 'פאן פטרייתי "assay (בדיקת Fungitell) המאתר את הקיר משומר מרכיב פטרייתי התא (1 → 3)-β-D- גלוקן, אך לא את mucorales כי היעדר רכיב זה בקירות התא שלהם ^1,4. האםתובעת המקיף את הדיוק של בדיקות אלה ^1,4-6 הוביל להתפתחות האחרונה של נוגדן חד שבטי של הדור הבא (MAB) מבוססי מבחני המזהים פונדקאית סמנים של דלקת ^1,5.

תורנטון ⁵ לאחרונה תיאר את הדור של MAB אספרגילוס ספציפי (JF5) באמצעות טכנולוגיית hybridoma והשימוש בה לפתח חיסונית chromatographic הזרימה לרוחב המכשיר, (LFD) עבור טיפול של נקודה (POC) האבחנה של IPA. היתרון העיקרי של LFD הוא יכולתו לאתר פעילות מאז MAB JF5 נקשר אנטיגן תאי גליקופרוטאין המופרש במהלך הצמיחה הפעילה של הפטרייה רק ^5. זהו שיקול חשוב בעת השימוש נוזלים כגון BAL ריאות לאבחון IPA מאז נבגים אספרגילוס הם מרכיב נפוץ של האוויר הנשאף. השירות של המכשיר באבחון IPA הוכח באמצעות מודל בעלי חיים של זיהום, שם LFD המוצג רגישות משופרת specificity לעומת GM Platelia ו Fungitell (1 → 3)-β-D-גלוקן מבחני ^7.

כאן, אנו מציגים הליך LFD פשוטה לגילוי אנטיגן Aspergillus בנוזלי בסרום ו BAL אדם. מהירות ודיוק מספק נקודת נלווה הרומן של טיפול הבדיקה לאבחון של IPA בחולים ממאירות haematological.

Protocol

1. , אוסף אחסון והכנת נוזלים שטיפה סרום ו ברונכואלוואולרית

1. איסוף בסרום מדגימות דם לא מטופל בכך שהוא מאפשר לדם להיקרש ב 4 ° C, סרום החנות aliquots ב -20 ° C לפני השימוש. ברונכואלוואולרית נוזלים שטיפה (BAL) צריך גם להיות מאוחסן aliquots ב -20 ° C. הערה: אחסון של בסרום BAL כמו aliquots מגבילה את פוטנציאל הפירוק של האנטיגן יעד חוזר ונשנה על ידי הקפאה, הפשרה של דגימות במהלך בדיקה חוזרת.
2. ההפשרה דוגמאות ומערבבים את דגימות סרום ו BAL באופן יסודי על ידי vortexing ו צנטריפוגות דקות 1 14,000 סל"ד.
3. לבדיקה שגרתית של דגימות נסיוב אדם, לדלל 01:01 בסרום (V / V) עם בינוני רקמת התרבות (TCM). TCM מורכב בינוני RPMI 1640, 10% (V / V) נסיוב עגל עוברית, 1% (V / V) של פתרון ה-L-גלוטמין 200 מ"מ, ו אזיד הנתרן (0.02% w / v) כחומר משמר. בינוני מוכנה מראש ניתן לאחסן 4 ° C למשך מספר חודשים. החל 100 μl של dilutאד בסרום כדי LFD.
4. עבור נוזלים של באל אדם, ועל נוזלים של באל מן במודלים של בעלי חיים, חלה 100 μl של מדגם מסודר כדי LFD, עם טיפול מקדים לא.
5. עבור סרום מ במודלים של בעלי חיים, לדלל סרום 01:02 (V / V) עם פוספט שנאגרו מלוחים המכיל 4% (w / v) EDTA, חום עבור 3min באמבט מים רותחים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב -14,000 סל"ד, ולהחיל 100 μl של supernatant מסודר למכשיר LFD.

2. היישום של סרום ו BAL להתקן זרימת לרוחב,

1. אחסן את הזרימה לרוחב התקנים בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס). בטמפרטורה זו, מכשירים יציבים במשך 12 חודשים. הסר את ההתקנים שלהם מתוך שקיות ומניחים על משטח ישר.
2. משתמש קצה פיפטה סטרילית, להחיל 100 μl של מדגם טרום שטופלו BAL סרום או מסודר לנמל שחרורו של המכשיר.
3. אפשר assay לרוץ במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, אז את התוצאות של הבדיקות צריכות להיות רשומות. הערה: בתוך שניות הנוזל יהיה SEen להעביר פעולה על ידי נימי יחד קרום nitrocellulose בחלון התצפית.

3. הקלטה פירוש תוצאות LFD

1. LFD מורכב קו הבקרה הפנימית (מסומנת C מכתב על דיור פלסטיק) וקו הבדיקה (מסומנת האות T). קו השליטה תמיד צריך להופיע בלי קשר אנטיגן Aspergillus במדגם סרום או BAL. זה מראה כי assay יש לפעול כראוי.
2. אם אנטיגן Aspergillus קיים במדגם סרום או BAL, פס הבדיקה יופיעו גם בתוך 15 דקות של היישום לדוגמה. בגלל האינטנסיביות של פס הבדיקה היא יחסית לכמות הנוכחית אנטיגן Aspergillus במדגם, פס הבדיקה יכול להופיע חיובי חלש (+), מתונה חיובית (+ +) או חזקה חיובית (+ + +) . עם זאת, כל פס הבדיקה חיובית, ללא קשר בעוצמה, היה להעיד על נוכחות של אנטיגן Aspergillus במדגם. במאות הבהיעדר דואר של אנטיגן Aspergillus, לא פס הבדיקה יופיעו, והתוצאה נרשמת שלילית (-).

4. נציג תוצאות

דוגמאות מייצגות של שליליות, חיוביות חלשות, תוצאות חיוביות, וחזק מתונות LFD חיוביות עם דגימות של באל ו בסרום מוצגות באיור 1.

תוצאות של אנטיגן חיובי בדיקות LFD (חלשה וחזקה) או בדיקות LFD שליליות באמצעות נוזלים של באל מלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) חולים מאובחנים על פי EORTC / MSG הקריטריונים לאבחון מוצגים בטבלה 1. כלול בלוח זה הם המתאימים קליניים mycological (galactomannan ותרבות) הנתונים ותוצאות בדיקת PCR Aspergillus ספציפית שפותחה סנט ברתולומיאו החולים ^8, לכל מטופל. אבחון המחלה מבוסס על גורמים המארח (נויטרופניה, שימוש ממושך בסטרואידים, טיפול אחרים T-cell immunos מוכריםuppressants), קריטריונים קליניים חיוביות עבור GM BAL (מוגדרת כאן כערך ראשי GM> 0.8). על פי EORTC 2002 / MSG ההנחיות ^10, חולי 12, 13 ו -16 אובחנו עם IA "אפשר" על פי גורמים המארחות ואמות מידה קליניות חיוביות או GM. על פי המתוקן (2008) EORTC / MSG הנחיות ^2, גורמי המארחות חיוביות GM בלבד או מארחים גורמים וקריטריונים קליניים בלבד לא היה מציין זיהום "אפשרי" פטרייתי פולשני, אלא אם כן מלווה ראיות תומכות מנתונים קליניים תורת הפטריות בהתאמה. החולה אובחן עם 6 IA "סביר" על פי שני קווים מנחים 2002 ו 2008, בשל גורמים המארחות, מאפיינים קליניים ראשיות ומשניות חיוביות ו GM. שים לב, כי בעוד לא LFD ולא מבחני ה-PCR כלולים כיום הנחיות EORTC / MSG, יש הסכמה חזקה בין שני מבחני הבדיקה מסחרי galactomannan המעידים על נוכחות של אנטיגן אספרגילוס ו חומצות גרעין במדגם BAL ים של חולים 6 ו 12. תוצאות נוספות של מחקרים המדגימים את היעילות של מבחני LFD ו PCR באבחון IPA ניתן למצוא ג'ונסון ואח' ^8.

באיור 1. שלילי (פס בקרה בלבד) וחיובי (מלאה פס הבדיקה) תוצאות הבדיקות LFD שימוש בסרום BAL. את עוצמות של התגובות פס הבדיקה הם יחסי הריכוזים של אנטיגן המטרה של דגימות סרום ו BAL. התגובות בדרך כלל נע בין חלש (+) דרך מתונה (+ +) כדי חזק (+ + +). ללא תלות בעוצמת פס הבדיקה, את כל שלושת תגובות חיוביות בסרום היה מציין aspergillosis פולשני מחלת ריאות בשל נוכחותם של מחזורי אנטיגן Aspergillus בדם. התגובות החיוביות של באל (חלש, בינוני או חזק) היה מציין נביטה של ​​נבגי העובש ופיתוח פוטנציאל פתוגני בריאות.

pdflinebreak ">

החולה לא.	Patiאף אוזן גרון מידע	קריטריונים קליניים 1	BAL תרבות 2	GM EIA עמוד 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus התוצאה PCR	LFD התוצאה
6	-	סרן ה-CT סימנים (גולה ו הילה) ואחד קטין	שלילי	0.9 (חיובי)	סביר	סביר	חיובי	חלש חיובית (+)
12	חזקה זיהום פטרייתי הקודם	לא גדול, קטן 1	קנדידה glabrata	6.43 (חיובי חזק)	אפשרי	אף אחד	חיובי	חזקה חיובית (+ + +)
13	Coagulase שלילי Staphylococcus וא ' החיידק בדם	לא גדול, 2 קטין	שלילי	0.25 (שלילי)	אפשרי	אף אחד	שלילי	שלילי (-)
16	זיהום בחזה	3 קריטריונים קלים כולל השתפכות חדשה בלשון רבים לחדור פלוס	שלילי	0.16 (שלילי)	אפשרי	אף אחד	שלילי	שלילי (-)

¹ גושים או בהילות על טומוגרפיה ממוחשבת סריקה הוא מרמז על זיהום פטרייתי
² קנדידה glabrata בנוזל BAL יחשב המזהם כפי שהוא שמרים השני בשכיחותו מבודדת כחלק פלורה אדם נורמליים ^9
3 מדד> 0.8 במבחן GM EIA בל מעיד על אספרגילוס הזיהום
⁴ בהתבסס על EORTC 2002 / MSG הקריטריונים לאבחון "possible "," סביר "או" מוכח "מחלה פטרייתית פולשנית ^10
5 על פי המתוקן (2008) EORTC / MSG הקריטריונים לאבחון "אפשר", "סבירות" או "מוכח" מחלה פטרייתית פולשנית ²

טבלה 1. תוצאות של בדיקות של דגימות של באל LFD של חולי לוקמיה מיאלואידית חריפה עם IPA סביר ומתוך חולי שליטה AML (אין עדות לזיהום), וכן EORTC / MSG אבחנה של זיהום.

Discussion

זיהוי סופי של IPA יכול באמת להיות מושגת על ידי בידוד של סוכן האטיולוגי דגימות ביופסיה, אך התאוששות של דוגמאות מתאימות בדרך כלל לא ניתן בחולים חולה מאוד Aspergillus לעתים נדירות הוא ההשבה מן הדם. למרות התקדמות גדולה נעשו בשימוש סריקה טומוגרפית ממוחשבת של החזה באבחון IPA, מאפיינים רמיזות של IPA ריאות כגון "הילה" או "אוויר הסהר" סימנים הם זמניים או ניתן לייחס ממצא נשימה או זיהומים פטרייתיים אחרים ^11,12. נתונים אלה מתווספים ולכן עם טכניקות סרולוגיות שמטרתם לזהות מולקולות חתימה (GM ו-β גלוקן) מ פטריות אשר במחזור בסרום של החולה או נמצאים נוזלים של באל, כיח או דגימות שתן ^13. למרות בדיקות אלה מציגים רגישות משביע רצון, אין להם ייחוד מספיק או סובלים מהפרעות בתנאים מסוימים ^1,6 .

הבדיקה לגילוי LFD IPA המוצג כאן מאפשר אבחנה "הנקודה של טיפול" של הטכנולוגיה IPA ומנצל, שבו נעשה שימוש עד כה בדיקות לגילוי וירוסים, חיידקים, טפילים ורעלנים ^14-19, והכי מפורסם, עבור בדיקות הריון ביתית הוצג לראשונה בשנת 1988 על ידי Unipath. ב LFD אספרגילוס המתואר כאן, אספרגילוס ספציפי MAB JF5 היא משותקת לאזור הלכידה (פס הבדיקה) על קרום nitrocellulose נקבובי. נגד העכבר אימונוגלובולינים משותקת קרום באזור נפרד שימש שליטה פנימי (קו הביקורת). על תוספת של נוזל סרום או BAL לנמל לשחרר, MAB JF5-colloidal המצומד זהב בפנקס השחרור נקשר אנטיגן המטרה ומורכב ואז עובר לאורך הממברנה נקבובי ידי פעולה נימי. MAB JF5 משותקת באזור לכידת נקשר מורכבת זהב אנטיגן JF5-colloidal וכתוצאה מכך קו אדום במבחן. כל JF5-colloidal מאוגד זהבהמצומד נקשר הבקרה הפנימית המציין assay יש לפעול כראוי. התוצאה היא קו אדום השליטה.

הבדיקה היא מהירה, לוקח רק 15 דקות כדי לבצע, הוא זול לעומת בדיקות בסרום ו BAL המבוססים על GM ו-β גלוקן זיהוי, ואינו דורש ציוד יקר או מתקני המעבדה נרחב לרוץ. יתר על כן, מאב JF5 לא צולבות להגיב עם תרופות או מזהמים אשר הוכחו לגרום חיוביות שגויות התגובה GM ו-β גלוקן בדיקות ^1,4,6. יתרון גדול נוסף על בדיקות האבחון הנוכחי הוא היכולת LFDs לזהות פעילות מעיד על גידול פולשני של המין Aspergillus.

צעד קריטי בהליך LFD הוא צריך לקרוא את התוצאות 15 דקות לאחר היישום של המדגם סרום או BAL למכשיר. הבדיקה אסור להשאיר דקות יותר 15 לפני הקלטת את התוצאות, כמו זה עלול לגרום להטיה interpretatiב. תגובה חלשה לא תהיה משופרת על ידי הארכת תקופת הדגירה. טיפול בחום של נסיוב מן במודלים של בעלי חיים של זיהום נמצא כדי לשפר את הרגישות assay. המגבלה של המבחן היא שהוא איכותי, והוא מסתמך על המפעיל לעשות הערכה סובייקטיבית של חיוביות. עוצמת פס הבדיקה משתנה בהתאם לתוכן אנטיגן של דגימות נסיוב ו BAL (איור 1). עם זאת, כל תגובה חיובית (נקבע על ידי השוואה שליליות ידועות) מעיד על קיומו של אנטיגן Aspergillus ולכן זיהום. כדי להגביל את הסובייקטיביות של מבחני LFD, כף יד התקנים זמינים המאפשרים כימות של עוצמות קו LFD הבדיקה ולאפשר את הקמתה של ערכי סף לגילוי אנטיגן ^20.

התפתחויות עתידיות של LFD כוללים המסחור שלה ופיתוח LFD זמנית המאפשר זיהוי בו זמני של פתוגנים אחרים פטרייתיים פולשנייםבאמצעות מבז ספציפיים מאוד ^3.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Aspergillus LFD	אוניברסיטת אקסטר		זמין המחבר המתאים על פי בקשה
RPMI-1640	סיגמא	R0883
L-גלוטמין	סיגמא	G7513
העגל העובר סרום	Biosera	S9100	מקורות אחרים של נסיוב עגל העובר ניתן להשתמש בהכנת TCM
EDTA	פישר סיינטיפיק	BPE120-1