הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Summary

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא שיטה דה נובו זיהוי של אינטראקציות הכרומטין, להבנה טובה יותר של שליטה תעתיק.

Abstract

הגנום מאורגנים תלת ממדי מבנים, אימוץ מסדר גבוה תצורות בתוך מיקרון בגודל מקומות גרעיני ^{7, 2, 12.} ארכיטקטורות אלה אינן אקראיות, הכרוכה אינטראקציות בין היזמים הגן ואלמנטים רגולטוריים ^13. הכריכה של גורמי תעתוק ל רצפים רגולטוריים מסוימים מביא רשת של ויסות שעתוק ותיאום ^{1, 14.}

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) פותחה כדי לזהות אלו מסדר גבוה מבנים הכרומטין ^5,6. התאים הינם קבועים לוקוסים אינטראקציה נתפס על ידי קוולנטיים חלבון דנ"א חוצה קישורים. כדי למזער את הלא ספציפית רעש להפחית את המורכבות, כמו גם להגדיל את הספציפיות של ניתוח האינטראקציה הכרומטין, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש כנגד גורמים חלבונים ספציפיים כדי להעשיר את שברי הכרומטין של עניין לפני קשירת הקרבה. קשירת לערב חצאי linkers לאחר מכן יוצר קשרים קוולנטיים בין זוגות של קטעי ה-DNA קשורים זה לזה בתוך מתחמי הכרומטין בודדים. ההגבלה משני צדי MmeI האנזים אתרים את חצאי linkers לאפשר מיצוי של לזווג תגיות מקשר-Tag בונה הקצה (חיות מחמד) על העיכול MmeI. כמו חצאי linkers הם biotinylated, מבנים אלה חיות מחמד הם מטוהרים באמצעות streptavidin-מגנטיים חרוזים. חיות המחמד מטוהרים הם ligated עם הדור הבא של מתאמי ריצוף ו קטלוג של שברי אינטראקציה מופק באמצעות הדור הבא sequencers כגון Analyzer הגנום Illumina. מיפוי וניתוח ביואינפורמטיקה מתבצע מכן לזהות שבב מועשר אתרים מחייב שבב מועשר אינטראקציות הכרומטין ^8.

הפקנו סרטון להפגין היבטים קריטיים של פרוטוקול Chia-PET, במיוחד הכנת צ'יפ, איכות שבב משחק תפקיד מרכזי בתוצאה של הספרייה Chia-PET. כמו הפרוטוקולים הםארוך מאוד, רק השלבים הקריטיים הם רואים בסרט.

Protocol

א הכרומטין immunoprecipitation (שבב) (ראה תרשים 1)

1. Crosslinking כפול של הכרומטין הנכנס חלבונים והקציר Cell

(בשעה 02:10 של הסרטון)

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) היא השלב הקריטי 1 מעורב בבניית הספרייה Chia-PET. שלב זה חשוב כדי להפחית את רמת הרעש, מורכבות הרקע ולהוסיף הספציפיות. הכנת שבב צריך להיות מותאם לסוג התא גורם של עניין. פרוטוקול זה מבוסס על הספרייה השנייה RNA Chia-PET פולימראז מוכן MCF-7 מ ⁹ תאים שנבנו במעבדה שלנו. כדי להבטיח את הספרייה המתקבל הוא של מורכבות מספיק, מומלץ להשתמש 1 x 10 ⁸ תאים להכין את החומר שבב. בהתאם לקו היעד התא, השיג תשואה יכול להיות בין נ"ג 100 עד 300 ננוגרם. אנו ממליצים על מינימום של 100 ng שבב יש להשתמש כדי לשתףnstruct ספריה Chia-PET עם פחות מ -20 מחזורי ה-PCR כדי למזער יתירות במהלך רצף. כמויות גדולות יותר של חומר שבב תאפשר הפחתה נוספת יתירות, שיפור איכות בספריות.

1. לשטוף 1 x 10 ⁸ MCF-7 תאים (שווה ערך לחמישה 500 ² צלחות ס"מ מרובע של 2 x 10 ^-7 תאים) פעמיים עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) מראש התחמם ב 37 ° C.
2. Crosslink MCF-7 תאים עם 1.5 מ"מ מוכן טרי EthylGlycol BIS (SuccinimidylSuccinate) (EGS)) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) עם סיבוב בשכונה כימי קטר.
3. הוסף פורמלדהיד 37% ריכוז סופי של 1% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) עם סיבוב בשכונה כימי קטר.

4. להרוות את crosslinkers על ידי הוספת 2 מ 'גליצין לריכוז סופי של 200 מ"מ. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר(22 ° C) עם סיבוב.

5. מחק crosslinkers הרווה לתוך בקבוק פסולת ולשטוף תאים פעמיים עם PBS קר.
6. מחק PBS ותאי הקציר על ידי גירוד. שמור על תאים שנקטפו על הקרח. יש לשטוף את הצלחת עם PBS 5 מ"ל (עם מעכבי פרוטאז ("+ PI") נוסף על פי הוראות היצרן) על מנת למקסם את אוסף של תאים.
7. גלולה התאים XG ב 1800 (3,000 סל"ד) ל -10 דקות בכל 4 מעלות ג מחק supernatant והמשך תמוגה התא. לחלופין, לאחסן גלולה ב -80 ° C.

2. תא תמוגה

(בשעה 04:15 של הסרטון)

1. Resuspend גלולה ב 15 מ"ל מאגר SDS 0.1% תמוגה (50 HEPES pH7.5 מ"מ, 150 מ"מ, NaCl 1 mM EDTA, טריטון 1% X-100, Deoxycholate נתרן 0.1%, 0.1% SDS + PI) באופן יסודי על ידי pipetting. סובב במשך 15 דקות 4 ° C.
2. גלולה lysed תאים ב 800 xגרם (2,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. מחק supernatant וחזור תמוגה התא פעם אחת לפי צעד 2.1 ו -2.2.
4. מבודד גרעינית גלולה מוכן תמוגה גרעינית. לחלופין, חנות גלולה ב -80 ° C.

3. הגרעין תמוגה

(בשעה 05:00 של הסרטון)

תמוגה הגרעין מבוצעת לשחרר הכרומטין crosslinked לפני הפיצול הכרומטין. בהעדר קרום הגרעין, הכרומטין crosslinked ניתן sonicated באמצעות תנאים עדינים. לפעמים, כוח sonication לא יכול להיות מספיק כדי לשבור את קרום הגרעין במקרה כזה, הכרומטין פחות יושג כי גרעינים שלמים יימחקו לאחר צנטריפוגה. עם זאת, סוגי תאים שונים עשויים לדרוש תנאים שונים.

1. Resuspend גרעינים גלולה מבודד 15 מ"ל 1% SDS תמוגה חוצץ (50 מ"מ HEPES pH7.5, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1% טריטון X-100, נתרן 0.1% Deoxycholate, 1% SDS + PI). להעביר את ההשעיה גרעינים לצינור מהירות גבוהה צנטריפוגות (צנטריפוגה Oak Ridge Tube (פוליפרופילן)) ולסובב במשך 15 דקות ב 4 ° C.
2. גלולה lysed גרעינים גלולה ב XG 47,810 (20,000 סל"ד) במשך 30 דקות 4 ° C.
3. למזוג supernatant ו הפסקה גלולה עם קצה פיפטה p1000.
4. לשטוף גלולה עם 30 מ"ל 0.1% SDS תמוגה מאגר (+ PI).
5. סובב במשך 15 דקות 4 ° C.
6. גלולה הכרומטין ב XG 47,810 (20,000 סל"ד) במשך 30 דקות 4 ° C.
7. מחק supernatant וחזור לשטוף פעם אחת לפי צעד 3.4-3.6 לפני שתמשיך לפיצול הכרומטין. לחלופין, חנות הכרומטין גלולה ב -80 ° C.

4. הפיצול של הכרומטין

(בשעה 07:03 של הסרטון)

1. העברת הכרומטין גלולה לסיבוב 14 מ"ל צינור קלקר בתחתית הבדיקה.
2. הוסף 1 מ"ל 0.1% SDS תמוגה מאגר (+ PI) כדי הכרומטין PEllet. ודא שאין בועות התערובת כמו זה ישפיע על יעילות sonication.
3. שאר הכרומטין-DNA לגודל של 200 על 600 זוגות בסיסים עם דיגיטלית ברנסון Sonifer משבש סלולרי (משרעת 35%, 9 דקות (30 שניות, 30 שניות מעל)) ולשמור דגימות קר כל הזמן כדי למנוע התחממות יתר על ידי ביצוע sonication בחדר קר (ראה איור 2).
4. הפוך-crosslink aliquot של הכרומטין ולבדוק יעילות הפיצול בשלבים הבאים. (השלבים הבאים אינם רואים בסרט).
   • 10 aliquot μl של הכרומטין לאחר sonication.
   • צנטריפוגה sonicated הכרומטין ב XG 16,110 (13,200 סל"ד) במשך 5 דקות על 4 ° C.
   • העברת supernatant לצינור חדשה ולהוסיף 2 μl של הפתרון K proteinase.
   • דגירה של 30 דקות בשעה 50 ° C.
   • פתרון במהופך crosslinked הכרומטין על ג'ל agarose 1.5%.
   • Repeaלא sonication אם הגודל של ה-DNA גדולים מהצפוי.
5. סרכזת lysate הנותרים ב XG 16,110 (13,200 סל"ד) במשך 30 דקות על 4 מעלות צלזיוס, העברת sonicated הכרומטין (supernatant) לתוך צינור חדש לפני preclearing עם חרוזים מגנטיים. לחלופין, sonicated חנות הכרומטין ב -80 ° C עד הכרומטין מספיק נאסף להתחיל שבב.

5. , כביסה Preclearing ציפוי של נוגדנים חרוזים

(בשעה 08:17 של הסרטון)

1. Preclearing של הכרומטין
   1. השתמש 300 μl של חרוזים ז מגנטיים חלבון ה-IP 1.
   2. לשטוף חרוזים שלוש פעמים עם 5 מ"ל חרוזים לשטוף חוצץ (PBS, 0.1% טריטון X-100). זה ובעתיד שוטף מעורבים מגנטיים חלבון חרוזים ז מורכב מהשלבים הבאים. ודא חרוזים מגנטיים לא להתייבש.
      • לטיב חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים.
      • Discard supernatant.
      • Resuspend חרוזים עם המאגר.
      • סובב במשך 5 דקות על 4 ° C.
      • צנטריפוגה ב 129 XG (800 סל"ד) למשך דקה 1 על 4 ° C.
      • לטיב חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים.
      • מחק supernatant.
   3. שלב הכרומטין sonicated עם חרוזים prewashed, להסיר רקע המחייב של הכרומטין כדי חרוזים.
      • שמור על 10 μl של הכרומטין sonicated כמו "קלט" את החשבון העשרה לאחר מכן על ידי PCR כמותית (QPCR). לאחסן ב 4 ° C.
   4. סובב לילה ב 4 ° C.
   5. צנטריפוגה sonicated הכרומטין ב 129 XG (800 סל"ד) למשך דקה 1 על 4 ° C.
   6. הניחו צינור על concentrator החלקיקים מגנטי.
2. ציפוי נוגדנים חרוזים מגנטיים
   1. 300 aliquot μl של חרוזים ז מגנטיים חלבון צינור חדש.
   2. לשטוף חרוזים שלוש פעמים עם הצפת חרוזים 5 מ"ל Wash (PBS, 0.1% טריטון X-100).
   3. הוסף נפח שווה ערך (כצעד 5.1.3) של מאגר Wash חרוזים.
   4. הוסף 35 מיקרוגרם של RNA פולימראז II (8WG16) נוגדן חד שבטי.
   5. סובב לילה ב 4 ° C.
   6. לשטוף את הנוגדן מצופים חרוזים פעמיים עם הצפת 5 חרוזים מ"ל Wash.
   7. לטיב נוגדנים מצופים חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים.

6. הכרומטין immunoprecipitation

(בשעה 10:03 של הסרטון)

כדי להקטין את רמת המורכבות ואת רעשי הרקע, נוגדנים נגד גורמים חלבונים ספציפיים המשמשים להעשרת שברי הכרומטין ספציפיים של עניין לפני קשירת הקרבה ^6.

כאן השתמשנו RNA פולימראז II העכבר חד שבטייםנוגדן (8WG16) כי הכיר את הטופס חניכה של החלבון. לפי שברי דנ"א להעשרת הקשורים RNA פולימראז II, סגוליות של הספרייה ניתן להגדיל, המאפשר זיהוי ארוכי טווח הכרומטין אינטראקציות בין יזמים פעילים ואזורים הרגולציה המתאימים ^9.

1. מחק לשטוף חיץ בין נוגדנים מצופים חרוזים בעזרת concentrator החלקיקים מגנטי.
2. העברת sonicated הכרומטין (supernatant משלב 5.1.6) בעזרת concentrator החלקיקים מגנטי נוגדנים מצופים חרוזים (משלב 5.2.7).
3. סובב לילה ב 4 ° C.

7. כביסה ו elution של ה-DNA-חלבון מתחמי Immunoprecipitated

(בשעה 11:13 של הסרטון)

1. לשטוף את הכרומטין-immunoprecipitated חרוזים שלוש פעמים עם 5 מ"ל מאגר SDS 0.1% תמוגה.
2. לשטוף חרוזים פעם עם 5 מ"ל מאגר Wash גבוהה מלח (50 mM HEPES pH 7.5, 350 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1% טריטון X-100, Deoxycholate נתרן 0.1%, 0.1% SDS).
3. לשטוף חרוזים פעם עם 5 ליתיום מאגר מ"ל Wash כלוריד (10 mM Tris pH 8.0, 250 מ"מ LiCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, Deoxycholate נתרן 0.5%).
4. מחק לשטוף חיץ וחרוזים שטף resuspend עם הצפת 1 TE מ"ל.
5. סובב במשך 5 דקות על 4 ° C. מדגם מוכן quantitation והעשרה הסימון שבב. מרגע שהחומר שבב די כבר נאסף, מדגם מוכן להיבנות לתוך ספריית Chia-PET. שלב זה הוא קריטי, צריך לעשות על מנת להבטיח בנייה מוצלחת Chia-PET הספרייה. שבב מועשר חרוזים ניתן לאחסן עד 2 שבועות 4 ° C תוך עוברת quantitation, בדיקות העשרה שבבים, והצטברות של חומר מספיק.
   1. Elute ו הפוכה crosslink "קלט" דנ"א שבב מועשר חרוזים בשלבים הבאים. (השלבים הבאים אינם רואים בסרט.)
      • Elute 20% שבב מועשר חרוזים עם 200 מאגר elution μl שבב (50 מ"מ טריס pH 8.0, 10 mM EDTA, SDS 1%). סיבוב של 30 דקות בשעה 37 ° C. סרכזת חרוזים eluted XG ב 6100 (800 סל"ד) למשך דקה 1 על 4 ° C. העברת מתחמי שבב eluted (supernatant) לצינור חדש בעזרת concentrator החלקיקים מגנטי.
      • שבב מתחמי הפוכה crosslink "קלט" ו eluted עם 2 μl proteinase K (הריכוז הסופי של 0.2 גרם / מ"ל) עבור 2 שעות על 50 ° C.
      • העברת במהופך crosslinked "קלט" ה-DNA ו-DNA שבב eluted לתוך צפיפות 2 מ"ל MaXtract גבוהה (בהתאמה). הוסף 200 μl 25:24:1 פנול, כלורופורם, Isoamyl pH 7.9 אלכוהול על צינורות מכסה המנוע כימי קטר והפוך לערבב היטב. לסובב את המבחנות במשך 5 דקות על XG 16,110 (13,200 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
      • להעביר בשלב מימית העליון לצינור חדש לזרז להפוך שנינות DNA crosslinkedשעות 20 Acetate μl 3 מ 'נתרן pH 5.5, 200 isopropanol μl ו 1 μl 15 מ"ג / מ"ל ​​Glycoblue. דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות גלולה דנ"א למשך 30 דקות בכל XG 16,110 (13,200 סל"ד) בשעה 4 ° C.
      • לאחר צנטריפוגה של ה-DNA זירז isopropanol, לשטוף את ה-DNA גלולה עם אתנול קר כקרח 75% פעמיים resuspend DNA גלולה במאגר TE 20 μl.
   2. לכמת "קלט" ה-DNA (משלב 5.1.3) ו-DNA על ידי שבב picogreen assay ^10.
   3. בצע בדיקה העשרה באמצעות PCR איכותי (QPCR).

ב הכרומטין ניתוח אינטראקציה באמצעות מותאמים סוף תג הרצף (Chia-PET)

המחצית השנייה של וידאו ידגיש את השלבים המרכזיים בבניית הספרייה Chia-PET.

1. סוף להקהות של שברי ה-DNA שבב

פרק זה של הווידאו מדגיש 2 מ 'עין נקודות, הליך צעד אחר צעד של כביסה חרוזים מגנטיים להסיר אנזימים חציצה מלח התגובה הקודמת (שלב 1.1, 12:22-0:54 של הוידאו) ואת הליך הקמת תגובות אנזימטיות מעורבים חרוזים מגנטיים בתערובת התגובה (שלב 1.2, 12:54-13:25 של וידאו).

1. לשטוף את שבב מועשר חרוזים פעם עם מאגר TE קר כקרח. זה ובעתיד שוטף מעורבים חרוזים מגנטיים כוללים את השלבים הבאים.
   • סרכזת XG ב 6100 (800 סל"ד) למשך דקה 1 על 4 ° C.
   • לטיב חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים.
   • מחק supernatant.
   • הוסף חוצץ כדי חרוזים.
   • מערבבים עם חרוזים חיץ ידי מצליף פעולה.
   • סרכזת XG ב 6100 (800 סל"ד) למשך דקה 1 על 4 ° C.
   • לטיב חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים.
   • מחק supernatant.
2. כדי למלא את overha sonicatedNGS, להכין שני, לערבב עם הצפת 70 10 μl x עבור פולימראז ה-DNA T4, 7 μl 10 dNTPs מ"מ ו 615.8 המים μl nuclease חינם. מערבבים ביסודיות resuspend חרוזים שטף בתערובת-Master. הוספת 7.2 μl 9.7 U / μl DNA פולימרז T4 לנפח סופי של 700 μl. מערבבים דגירה במשך 40 דקות ב 37 מעלות עם סיבוב (באמצעות Palico ביוטק Intelli-מיקסר RM-2L, F8, 30 סל"ד, U = 50, u = 60). לבצע את כל תגובות אנזימטיות הבאים לבצע את הפעולות הבאות.
   • לדלל מאגרים התגובה עם מים nuclease חינם.
   • להוסיף את כל חומרים כימיים אחרים (למעט האנזימים) למאגר בדילול מלא.
   • מערבבים היטב. Resuspend חרוזים / גלולה בתערובת התגובה.
   • הוספת האנזים חרוזים resuspended / גלולה (שמור על אנזימים תיבת קריר benchtop בכל עת על מנת להבטיח פעילות אנזימטית מרבי).
   • לאטום צינור עם parafilm.
   • ודא חרוזים הם גם מעורב בכל incubatio כולוn.
3. מחק תערובת התגובה לשטוף את מלחי חיץ שיורית ואנזימים שלוש פעמים עם חיץ קר כקרח כביסה (10 mM Tris-Cl-pH 7.5, 1 mM EDTA, 500 מ"מ NaCl).

2. קשירת למוצרי linkers חצי Biotinylated ל-DNA שבב

פרק זה של הווידאו מדגיש את המאפיינים של חצי מקשר oligonucleotides המשמשים לבניית Chia-PET ושימוש הרכב ברקוד נוקלאוטיד להבחין בין מוצרים קשירת שאינם ספציפיים ספציפי (13:28-14:24) של וידאו). הפרק מציג גם את התהליך צעד אחר צעד של הקמת תגובה חצי מקשר קשירת (שלב 2.2, 14:24-15:54 של הסרטון).

שני סוגים של linkers וחצי biotinylated מוצגים בפרוטוקול זה, נועדו עם ברקוד פנימי של ארבעה נוקלאוטידים (TAAG או ATGT) ואתר הכרה סוג הגבלה IIS האנזים MmeI (TCCAAC). לאחר שבב להעשירment, sonicated שברי הכרומטין מחולקים באופן שווה לשני aliquots והם ligated 1 עם עודף של B או חצי מקשר או חצי מקשר ^5,9.

1. לחלק שבב מועשר חרוזים לשתי aliquots עבור קשירת ה-DNA של חצי מקשר ידי biotinylated למוצרי linkers וחצי או חצי linkers B בהתאמה. אלה שני linkers וחצי יש רצפי נוקליאוטידים זהים, מלבד ארבעה נוקלאוטידים באמצע המשמשים (חצי מקשר עם TAAG, חצי ב 'מקשר עם ATGT) כמו ברקודים נוקלאוטיד. בשילוב במהלך קשירת הקרבה, אקראי ולא ספציפיים ligations בין שני מתחמי שבבים שונים ניתן לזהות מתוך אוכלוסיית רצפים עם linkers heterodimer AB, לעומת ligations ספציפיים אשר ניתן לזהות מתוך אוכלוסיית רצפים עם homodimer AA או linkers צימרים .
2. ולקשור שבב מועשר חרוזים עם 140 μl 5 x חיץ ligase T4 DNA עם PEG, 3.5 μl 200 ng / μl biotinylated למוצרי linkers וחצי או ב ', 553.5 μl nuclease-מים חופשיים 3 μl 30 U / μl DNA ligase T4 (שמור ligase T4 DNA על תיבת benchtop קריר בכל עת כמו ligases אינם יציבים ואפילו על קרח). לאטום צינור עם parafilm ו דגירה לילה ב 16 מעלות עם סיבוב.

3. Elution ואת קשירת הקרבה של פיסות דנ"א שבב

פרק זה של הווידאו מסביר את תפקידו של מאגר EB, SDS ו טריטון X-100 במהלך elution של מתחמי הכרומטין של חרוזים וגם מראה את ההליך, שלב אחר שלב של הגדרת התגובה circularization (שלב 3.9, 15:54 עד 17:10 של הסרטון).

לאחר ligating את חצאי linkers את שברי הכרומטין, שברים בשתי משולבות eluted את החרוזים. קטעי דנ"א אינטראקציה לאחר מכן ניתן יהיה מחובר על ידי רצף מקשר מלאה במהלך קשירת הקרבה.

באמצעות הרכב ברקוד נוקליאוטידים, רצף ניתן לסווג לשלוש קטגוריות, כלומר רצפי Wiה heterodimer א.ב. linkers (ברקוד ATGT / TAAG) רצפים עם homodimer AA או linkers צימרים (ברקוד TAAG / TAAG או ATGT / ATGT) כדי להבחין בין מוצרים קשירת שאינם ספציפיים ספציפי בהתאמה ^9.

לפיכך, השימוש בשני חצאי linkers עם ברקודים נוקלאוטידים שונים מאפשר המפרט של ניסויים שונים או משכפל, כמו גם ניטור של קצב שאינו ספציפי קשירת chimeric בין מתחמי שבבים שונים ^5.

1. לשטוף חצי מקשר-ligated חרוזים שלוש פעמים עם הצפת קר כקרח Wash (10 mM Tris-Cl-pH 7.5, 1 mM EDTA, 500 מ"מ NaCl).
2. שלב שני צינורות של חצי מקשר-ligated חרוזים באופן הבא.
   • להשיב את אחד הצינורות של חצי מקשר-ligated חרוזים באמצעות concentrator החלקיקים מגנטית ("התחתית").
   • שמור את הצינור השני של חצי מקשר-ligated חרוזים על הקרח ("Tube B").
   • מחק לשטוף מאגר (משלב 3.2.1) FTube ROM ולהעביר חצי מקשר-ligated חרוזים (משלב 3.2.2) מ-B Tube לתוך צינור תוך צינור הוא עדיין אוסף חלקיקים מגנטיים.
   • הוסף 700 μl מאגר קר כקרח Wash ל-B Tube לאסוף את כל שאריות חצי מקשר-ligated חרוזים ולהבטיח את שני צינורות של חצי מקשר-ligated חרוזים משולבים כראוי. העברת מאגר לשטוף את א Tube מחק Tube ב ריקה
3. Phosphorylate חצי מקשר-ligated חרוזים עם 70 μl 10 x T4 DNA ligase חיץ (חוד), 616 μl מים nuclease-חופשית 14 μl 10 U / μl של קינאז DNA T4 Polynucleotide. דגירה של 50 דקות ב 37 מעלות עם סיבוב.
4. לטיב פוספורילציה חצי מקשר-ligated חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים וזורקים תערובת התגובה.
5. Elute חצי מקשר-ligated הכרומטין-DNA מורכב עם מאגר elution μl 200 מוכן טרי (TE מאגר, 1% SDS). דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (22 °ג) עם סיבוב.
6. העברת eluate לצינור טריים ולשטוף עם חרוזים EB 900 מאגר μl. העברת supernatant אל הצינור אותו לשלב את elutions.
7. העברת eluate שנאסף על כוסות סינון של שני פילטרים צינור צנטריפוגות ו צנטריפוגות ב XG 16,110 (13,200 סל"ד) למשך דקה 1 בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס).
8. הטמנת SDS על ידי הוספת 90 μl 20% טריטון X-100 ו להפוך לערבב היטב. דגירה שעה 1 ב 37 ° C.
9. Circularization מתבצע תחת תנאים מאוד לדלל כדי להעדיף אירועים קשירת בתוך צולבים מתחמי נפרדים הכרומטין תוך מזעור תופעות קשירת בין מתחמי הכרומטין שונים אשר להצמיח רצויים מולקולות דנ"א chimeric. עבודה על הקרח, להעביר eluate הרווה את צינור פלקון 50 מ"ל ולהוסיף מים 7776 μl nuclease חינם, 1000 μl 10 x T4 DNA האנזים חוצץ (חוד) ו 33.33 μl 30 U / μl ligase DNA T4. דגירה הלילה בגיל 16° C.

4. הפוך-Crosslinking ו-DNA טיהור

פרק זה של הווידאו מראה את ההליך, שלב אחר שלב של פנול: מיצוי כלורופורם (שלב 4.3, 17:11-17:59) ואת תקריב של ה-DNA pelleted לאחר צנטריפוגה בשלב 4.4.

1. הפוך-crosslink וחלבון להשפיל על ידי הוספת 100 μl 20 מ"ג / מ"ל ​​פתרון proteinase K. דגירה של 2 שעות 50 ° C.
2. העברת ה-DNA הכרומטין לתוך צפיפות 50 מ"ל MaXtract גבוהה ולהוסיף 9ml nuclease ללא מים כדי לקבל נפח סופי של 19 מ"ל.
3. הוסף 19 מ"ל 25:24:1 פנול, כלורופורם, Isoamyl אלכוהול pH 7.9 כדי צינור במנדף כימי קטר והפוך לערבב היטב. לסובב את המבחנות במשך 5 דקות על XG 1800 (3,000 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
4. להעביר בשלב מימית העליון למספר 50 מ"ל צנטריפוגות אלון צינורות רידג (טפלון FEP) ו-DNA המשקע הכרומטין עם 1.9 מ"ל 3 pH נתרן אצטט M 5.5, 19 מ"ל isopropanol ו 5 Glycoblue μl. Glycoblue נוסף כדי לשפר את הנראות של גלולה.
5. דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות. אפשר פתרון קפוא להפשיר לפני צנטריפוגה ב XG 38,720 (18,000 סל"ד) במשך 30 דקות ב 4 ° C.
6. לאחר צנטריפוגה של ה-DNA זירז isopropanol, לשטוף את ה-DNA גלולה עם אתנול קר כקרח 75% פעמיים resuspend DNA גלולה ב 34 EB מאגר μl. להעביר את תערובת ה-DNA כדי צינור 1.7 מ"ל LoBind DNA.
7. Resuspend DNA גלולה ב 34 EB מאגר μl.
8. (טיפול RNase היא אופציונלית כמו שטיפת לאחר צעדים טיהור בפרוטוקול Chia-PET לשרת להסיר זיהום רנ"א בדיקות ידניות של Chia-PET רצפים מספריות הבית ב-שלנו מוצג עקבות של זיהום RNA).
   • בצע RNase העיכול על ידי הוספת 10 μl RNase אחד 10 x התגובה מאגר, 55 μl מים nuclease-חופשית 1 μl 10 U / μl RNase ONE Ribonuclease. דגירה על 37מעלות צלזיוס במשך שעה.
   • העברת ה-DNA הכרומטין לתוך צפיפות 2 מ"ל MaXtract גבוהה. הוסף 100 μl 25:24:1 פנול, כלורופורם, Isoamyl אלכוהול pH 7.9 כדי צינור במנדף כימי קטר והפוך לערבב היטב. לסובב את הצינור במשך 5 דקות על XG 16,110 (13,200 סל"ד) בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס).
   • להעביר בשלב מימית העליון לצינור חדש המשקע הפוכה crosslinked DNA עם 10 pH μl 3 נתרן אצטט M 5.5 ו 100 isopropanol μl. דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות גלולה דנ"א למשך 30 דקות בכל XG 16,110 (13,200 סל"ד) בשעה 4 ° C.
   • לאחר צנטריפוגה של ה-DNA זירז isopropanol, לשטוף גלולה DNA עם אתנול קר כקרח 75% פעמיים resuspend DNA גלולה ב 34 EB מאגר μl.

5. חוסר תנועה של ה-DNA Chia-PET כדי חרוזים streptavidin

המבוא של הפרק הזה מדבר על הנוכחותהאתר הכרה MmeI ו T biotinylated הנוכחי של חצי מקשר oligonucleotides כדי להקל על החילוץ של תג-מקשר-Tag בונה ("חיות מחמד", 18:02-19:10 של וידאו). בנוסף, פרק זה של הווידאו גם נותן מבט כולל מהיר של 5.2 שלב, ההליך, שלב אחר שלב של הגדרת התגובה PCR (שלב 6.1, 19:10-20:00 של וידאו) ו כשהוא כורת מוצלחת Chia-PET-DNA (שלב 6.9, 20:00-20:30).

חצי linkers A ו-B מכיל איגוף אתרים MmeI הכרה, המאפשר את האנזים מסוג IIS הגבלת לחתוך 18/20 זוגות בסיסים במורד הזרם של אתרי היעד שלהם מחייב ליצור קצרים "תגיות" של שבר הכרומטין, ייצור לזווג תגיות מקשר-Tag בונה ("חיות מחמד").

כדי לאפשר את טיהור מבנים חיות מחמד ידי streptavidin מצופים חרוזים מגנטיים, גם חצי מקשר A ו-B הם שונה עם ביוטין, המאפשר לכידת וטיהור של Chia-PET בונה.

1. שחרור גה-DNA aptured Chia-PET ידי הוספת 5 μl 10 x NEBuffer 4, 5 μl הכין טרי 500 מיקרומטר (10 X) S-adenosylmethionine (SAM) ו 1 μl 2 U / MmeI μl ל-DNA resuspended. להרוות MmeI עודף ידי הוספת 5 μl לא biotinylated למוצרי linkers וחצי לתערובת התגובה במשך MmeI יכול להיות עצמי מעכבות העולה. דגירה של 2 שעות ב 37 ° C.
2. כדי ללכוד שפורסמו Chia-PET, ה-DNA העברת 50μl של M-280 חרוזים resuspended streptavidin לצינור LoBind DNA. לשטוף חרוזים פעמיים עם 2 x מחייב כביסה חוצץ (2 X B & W: 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 מ 'NaCl). חרוזים Resuspend ב 50 מאגר μl x B & W 2 ולהעביר 50 μl של תערובת העיכול (משלב 5.1) על צינור אחד. מערבבים היטב דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.
3. לטיב חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים וזורקים supernatant. שטפו פעמיים עם חרוזים 150 μl 1 x מחייב כביסה מאגר (1 x B & W: 5 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl).
4. ולקשור 454 GS20 מתאמי ל-DNA Chia-PET עם 5 μl 10 x מאגר האנזים T4 DNA (שים לב מאגר האנזים המשמש בשלב זה שונה צעד 3.9, מאגר האנזים המשמש בשלב זה היא מחברת זהה לזה אשר מספקת את האנזים T4 DNA), 4 μl 200 ng / μl 454 GS20 מתאם, 4 μl 200 ng / μl 454 GS20 B מתאם, 36 μl מים nuclease-חופשית 1 μl 30 U / μl ligase DNA T4. דגירה בין לילה ב 16 מעלות עם סיבוב. Chia-PET-DNA יכול להיות גם ligated עם Illumina-NN מתאמים, ובמקרה זה אנו ממליצים על הגברה של הספרייה באמצעות PCR פריימר PE1.0 ו PCR פריימר PE 2.0 לרכוש Illumina.
5. לטיב חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים וזורקים supernatant. לשטוף שלוש פעמים עם חרוזים μl 150 1 x B & W המאגר.
6. ניק לתרגם Chia-PET-DNA עם μl 5 10 x NEBuffer 2, 2.5 μl 10 dNTPs מ"מ, 38.5 מים μl nuclease ללא ו 4 μl 10 U / μl Escherichia coli DNA פולימראז ט דגירה בן לילה בביתטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) עם סיבוב.
7. לטיב חרוזים באמצעות concentrator חלקיקים מגנטיים וזורקים supernatant. לשטוף שלוש פעמים עם חרוזים μl 150 1 x B & W המאגר.
8. Resuspend חרוזים עם EB 50 מאגר μl.

6. הגברה של DNA Chia-PET

1. הגדרת PCR תגובות עם השעיה 2 חרוזים μl, 21 μl מים nuclease חינם, 1 μl 10 מיקרומטר פריימר Illumina 1-454, 1 μl 10 מיקרומטר פריימר Illumina 2-454 ו 25 Phusion μl גבוהה מיקס מאסטר פידליטי.
2. כדי לקבוע את מספר מחזורי הדרושים כדי לייצר מוצרי ה-PCR מספיק עבור ריצוף, להקים שלוש בדיקות PCR תגובות עם מחזורים 16, 18 ו 20. אין לעבור על 20 מחזורי כפי שמצאנו כי עושה תוצאות כל כך המורכבות ספריית נמוך מאוד.

שלב ראשוני	30 שניות	98 ° C	(Denaturation)
18 עד 25 מחזורים	10 שניות	98 ° C	(Denaturation)
	30 שניות	65 ° C	(חישול)
	30 שניות	72 ° C	(הרחבה)
שלב הגמר	5 דקות	72 ° C	(הרחבה סופית)

3. לקבוע את מספר המחזור הנמוך ביותר האפשרי על ידי הפעלת PCR תגובות על ג'ל 4-20% שיפוע TBE ו מכתים עם SYBR הירוק אני, על מנת להבטיח את נוכחותו של הלהקה מתוך 223 זוגות בסיסים, אשר אורכו של ה-DNA Chia-PET.
4. להגביר את שאר Chia-PET-DNA הנכנס חרוזים streptavidin ב בקנה מידה גדול כמו ה-PCR עם מחזורי ה-PCR מעטים ככל האפשר, תוך השגת תשואה מספקת על רצף.
5. מחדשהתביעה חרוזים מכל PCR תגובות באמצעות concentrator החלקיקים בריכה מגנטי supernatant לשני צינורות LoBind טריים DNA. להאיץ כל שפופרת של supernatant על ידי הוספת 60 μl Acetate 3 מ 'נתרן, 2 GlycoBlue μl ו 600 μl isopropanol לתגובות אספו.
6. דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. סרכזת ב XG 16,110 (13,200 סל"ד) במשך 30 דקות 4 ° C.
7. לאחר צנטריפוגה של ה-DNA זירז isopropanol, לשטוף DNA גלולה עם אתנול קר כקרח 75% פעמיים resuspend DNA גלולה במאגר TE 100 μl ו 5 μl 6 x צבע הטעינה.
8. הפצת מוצרי ה-PCR באופן שווה לתוך הבארות של ג'ל TBE 6%. הפעל את הג'ל במאגר TBE 1 X ב V 200 במשך 35 דקות, עם כתם ירוק SYBR א דמיינו ג'ל עם Transilluminator Reader כהה.
9. בלו בזהירות 223 נ"ב הלהקה ג'ל ולבצע "למחוץ ג'ל" ה-DNA החילוץ בפרוטוקול כדלקמן:
   • מניחים שברי ג'ל הכרותות ב 0.6 מ"ל microcentrifuge צינורות שעברו פירסינג בחלק התחתון עם מחט 21-G.
   • מניחים כל צינור בתוך צינור 1.5 בורג מ"ל כובע צנטריפוגות ב XG 16,110 (13,200 סל"ד) במשך 5 דקות על 4 ° C.
   • הוסף 200 μl pH TE חיץ 8.0 ל צינור אחד ולהבטיח את החלקים ג'ל שקועים באופן מלא למאגר.
   • להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   • העברת חלקים ג 'ל יחד עם המאגר בצינור לכל כוס פילטר המסנן של צנטריפוגות הצינור צנטריפוגות ב XG 16,110 (13,200 סל"ד) במשך 10 דקות 4 ° C.
   • יש לשטוף את כל צינור 1.5 מ"ל עם 200 μl חיץ TE pH 8.0 ו חיץ העברת שטיפה לכל יחידת סינון עם סיום הסיבוב הראשון.
   • בריכת מסנן דרך המשקע עם isopropanol.
   • Resuspend DNA גלולה עם חיץ 15 TE μl.

7. איכות בדוקהגברה D של ה-DNA Chia-PET

1. להמשיך עם הסימון איכות באמצעות דנ"א 1000 Agilent Assay או Agilent רגישות גבוהה DNA Assay על Agilent Bioanalyzer 2100.
2. Electropherogram של assay-DNA Agilent צריך להציג רק 1 שיא יחד עם בסיס שטוח לפני שתמשיך Illumina הגנום Analyzer IIx רצף.
3. לפני Illumina הגנום Analyzer IIx ריצוף, Chia-PET-DNA באופן אידיאלי צריך להיות ריכוז מינימלי של 10 ננומטר. לבצע 4 נקודות PCR כמותי על פי מדריך Illumina QPCR פרוטוקול כימות כדי לקבוע את כמות מדגם להעמיס על התא זרימה. לחלופין, לבצע 1 נקודות PCR כמותי כדלקמן:
   • לדלל את תבנית מלאה עד 100 PM, 10:00 ו - 13:00. כפי שתואר בפרוטוקול כימות QPCR Illumina, תבנית השליטה מוגדר בכל ספריית מוכן רצף בפלטפורמת Illumina ואת זה צריך להיות דומה ככל האפשר מבחינתגודל תבנית, תוכן GC וסוג הספרייה.
   • לדלל את ה-DNA Chia-PET עד השעה 10.
   • הגדרת ה-PCR triplicates של דילול כל אחד עם פריימר 0.1 QPCR μl 1.1, 0.1 פריימר QPCR μl 2.1, 5 DNA μl LightCycler480 SYBR הירוק אני מיקס מאסטר, 3.8 μl מים nuclease-חופשית 1 μl של תבנית עם רוש ומדע יישומי LightCycler 480 בזמן אמת מערכת ה-PCR. כוללים שני פקדים שליליות באמצעות 1 μl מים nuclease ללא כתבנית.
     • ראשוני denaturation
       • 95 מעלות צלזיוס 5 דקות 4.8 מעלות C / S
     • הגברה
       • 95 מעלות צלזיוס 10 שניות 4.8 מעלות צלזיוס / s
       • 60 ° C 1 דקה 2.5 ° C / S
       • 72 מעלות צלזיוס 30 שניות 4.8 מעלות צלזיוס/ S
     • ההיתוך Curve
       • 95 מעלות צלזיוס 5 שניות 4.8 מעלות צלזיוס / s
       • 65 ° C 1 דקה 2.5 ° C / S
       • 95 מעלות צלזיוס 5 רכישות בכל ° C
     • התקררות
       • 40 ° C 10 שניות 2.0 ° C / S
   • ודא כי הבקרות שליליות להראות לא הגברה, כי סטיית התקן של ערכי ה-CT הוא פחות מ 0.1 לפני חישוב ריכוז של תבניות הספרייה בהתבסס על עקומת הסטנדרט שנוצר משימוש דילולים תבנית שליטה.
4. ליצור אשכולות על פני השטח של תאים זרימת Illumina ידי טעינת int 01:05o Illumina הדור cBot Cluster המערכת על פי ההוראות על המסך.
5. המשך ל-DNA רצף Chia-PET על הגנום Illumina Analyzer IIx באמצעות Illumina 3-454 פריימר רצף ו Illumina 4-454 פריימר רצף בנתיב אחד כדי לראות את האיכות של הספרייה. אחסן שנותר Chia-PET-DNA ב -20 ° C. אם הספריה יש נתונים טובים, להכין את המדגם עבור ריצות נוספות של 4 עד 8 מסלולים לפי הצורך בהתבסס על תוצאות המדגם ליין להשיג 18-20000000 כניסות ייחודי.
   • כמות ה-DNA Chia-PET טעון על תאים הזרימה תלוי במידה רבה על הגירסה של תוכנת ניתוח הנתונים רצף, רצף של Illumina סטודיו הבקרה. לגרסה 2.9, טווחי הריכוז טעינה שליש למחצית הקיבולת המקסימלית של כל אריח, אשר משווה לעבור כ 21,000,000 סינון קורא עם כ - 9,500,000 קורא של חיות מחמד.
   • הטעינה מופחתת יש צורך להבטיח F הנכון בסיס שיחותאו רצפי ברקוד של linkers את. שגיאה זו מתרחשת כאשר מספר גבוה של נוקלאוטידים דומים רצף, כפי שקורה אם הוא מקשר רצף, כדי להשיג מידע barcoding. אם המידע barcoding אינו רצוי, ואת linkers לא לקרוא, ואז טוען ריכוז מלא ניתן להשתמש.
6. הקבצים המומרים qSeq ידי המתקשר הבסיס מחובר ניתן לנתח עוד יותר באמצעות כלי Chia-PET פי הוראות Chia-PET כלי ההתקנה (גרסה 4.1) ^8.

ג נציג Chia-PET תוצאות

בנינו בהצלחה Chia-PET ספריות באמצעות RNA פולימראז II נוגדנים (8WG16) ב MCF-7 תאים (CHM160 ו CHM163) ⁹ באמצעות 672 ng חומר שבב כפי שתואר לעיל. ג'ל אבחון ראשוני להפעיל את ספריית ה-PCR-הגברה זו, כאמור בשלב 6.2 של פרוטוקול Chia-PET, מוצג פס בהיר ומוגדר היטב עלהיקף משוער של 223 זוגות בסיסים לרכיבה על אופניים כל פעם PCR (ר 'איור 4).

16 מחזורי ה-PCR נעשה שימוש כדי להגביר את הספרייה Chia-PET ו תשואה כוללת של 17.1 ננוגרם הושג. שיא אחד, electropherogram אינטנסיבי נצפתה בגודל הצפוי של 223 זוגות בסיסים באמצעות ניתוח דנ"א 1000 Agilent כאמור בשלב 7.1 של פרוטוקול Chia-PET (ראה איור 5).

באיור 1. סקירה שבב. MCF-7 תאים הם כפול צולבים EthylGlycol BIS (SuccinimidylSuccinate (EGS) ו פורמלדהיד ברצף, וכתוצאה מכך קישורים קוולנטיים בין הכרומטין הסמוך מרחבית. הכרומטין צולבים התקבל את MCF-7 תאים קבוע על ידי תמוגה התא ו תמוגה גרעינית. הכרומטין היה נתון אז הפיצול למגוון גודל של 200-600 זוגות בסיסים. לאחר שלפני ניקוי הכרומטין sonicated עם Proteiנ ז חרוזים מגנטיים כדי להסיר שאינו ספציפי בדנ"א, מראש פינה את הכרומטין היה immunoprecipitated לילה עם נוגדנים מצופים חרוזים ללכוד הכרומטין של עניין.

איור 2. ג'ל ניתוח של שברי הכרומטין sonicated. הסולם 100 BP-DNA מוצג במסלול הראשונה והאחרונה לעיון גודל. הכרומטין sonicated מוצגים בעוצמה חזקה בין 200 עד 600 נ"ב שהוא אידיאלי לתפוס ארוכי טווח אינטראקציות הכרומטין.

איור 3. Chia-PET סקירה. שברי הכרומטין חלקיות הן הקצה הקהה ​​ו ligated כדי biotinylated למוצרי linkers וחצי המכילים משני צדי הגבלה אתרים MmeI. קומפלקסים שלמים הכרומטין הם eluted אז את החרוזים ואת נתון קשירת הקרבה תחת תנאים מאוד לדלל, כך שברי דנ"א אינטראקציה הם prefligated erentially זה לזה. לאחר הפוך cross-linking להסיר DNA הקשורים חלבונים, עיכול MmeI מתבצעת לשחרר תגיות מקשר-Tag (PET) בונה, אשר מטוהרים אז מחייב סלקטיבית חרוזים streptavidin. בונה את חיות מחמד הם ligated עם מתאמים עבור ריצוף תפוקה גבוהה.

באיור 4. ג'ל ניתוח Chia-PETS לאחר הגברה PCR. הסולם 25 BP-DNA מוצג במסלול 1 ו -5 לעיון גודל. מסלולים 2 עד 4 הם מוצרי ה-PCR שנוצר לאחר 16, 18 ו 20 מחזורים של PCR הגברה של μl 2 של תבנית חרוז, משותקת, בהתאמה. זוהי הספרייה מוצלח, כפי שעולה הבהיר, מוגדרים היטב להקות בגודל צפוי של 223 נ"ב. כתם שאינו ספציפי נוצר כאשר מספר מחזורי ה-PCR הוא גדל בעוד הלהקה הנמוך ביותר של תגובה לכל PCR מורכב הדימרים פריימר.

איור 5. Agilent 2100 Bioanalyzer ניתוח מטוהרים Illumina-454-מתאם ligated Chia להביא חיות מחמד. ללכידת מסך של Agilent 2100 electropherograms Bioanalyzer אפיון ספריה מצליחה, עם שיא חזק אחד בגודל הצפוי של 223 נ"ב. שים לב Bioanalyzer Agilent assay בדרך כלל מדווח על גודל מעט גבוה מהצפוי, במקרה זה, שיא הרצוי מוצג על 237 נ"ב במקום 223 נ"ב. זה נמצא בטווח טעות של 10% assay Agilent.

Discussion

Chia-PET היא שיטה שפותחה כדי לזהות ארוכי טווח אינטראקציות ויסות שעתוק. אחד הגורמים הקריטיים הקובעים את איכות ספריית Chia-PET הוא איכות החומר שבב.

פרוטוקול רואים בסרט משלבת את השימוש EGS ו פורמלדהיד לחצות קישור תאים. השימוש של פורמלדהיד, בשילוב עם מגיב cross-linking 2 נושאת זרוע spacer עוד עשוי לסייע מחייב של חלבונים אשר לא יכול היה להיות מחויב פורמלדהיד לבד ^3,11,15. בנינו ספריות בשיטה זו אשר הוכיחו אתרי הקישור חזקים ארוכי טווח אינטראקציות ^9. עם זאת, cross-linking ותנאי שבב צריך להיות מותאם עבור כל גורם של עניין, וזה חשוב לא יתר על המידה crosslink כמו יותר מדי cross-linking תגרום קשיים הפיצול על ידי sonication, ואולי ואולי לגרום אינטראקציות הכרומטין מזויף . הכרומטין אינטראקציותמזוהה על ידי Chia-PET יש תוקף בשיטה אחרת, כמו הכלאה באתרו הקרינה ^4.

אנו ממליצים על מינימום של 100 ng חומר הכרומטין. בעוד בנינו ספריות באיכות טובה מ 50 ng של חומר הכרומטין, ראינו כי כמויות גדולות של חומר המוצא אפשרה בניית Chia-PET ספריות עם פחות מ 16 מחזורים PCR, amplicons ובכך לצמצם ויתירות של כל ספרייה. זה מתואם עם יתירות נמוכה יותר תגיות ממופה ייחודיים גם אחוז גבוה של נתונים שימושיים, ובכך שהיא מאפשרת אינטראקציה מקיפה יותר הכרומטין מפה עם מסלולים פחות של רצף. נפח ארוז הסופי של חרוזים בצינור זה צריך להיות 50 μl של 100 μl של חרוזים מגנטיים Sepharose בהתאמה. אם נפח חרוז ארוז הוא פחות מ כאמור, להביא לנפח ארז מינימום עם חרוזים מגנטיים או Sepharose דומה מראש פינה ריקים כדי להקטין את איבוד של ה-DNA נושאות חרוזזה בשלבים הבאים. המקוצרות טיפים או גדול ליבות עצות יש להשתמש pipetting חרוזים Sepharose.

שינויים הבאים שולבו לאחר שפורסם קודם לכן Chia-PET פרוטוקול ^5. ראשית, חרוזים מגנטיים ז שימשו כדי להקטין את איבוד מדגם במהלך שוטף. בנוסף, זיהינו שאינם ספציפיים להקות עם משוערים של 100 BP ו 138-BP להיות amplicons של עצמי ligated למוצרי linkers וחצי ו / או מתאמים. לפיכך, צמצמנו את ריכוז biotinylated למוצרי linkers וחצי ו 454 GS20 מתאמי למזער שאינם ספציפיים להקות במהלך הגברה PCR. נפח קשירת הקרבה ירד מ 50 מ"ל ל 10 מ"ל כדי להקטין את איבוד מדגם במהלך השלבים הבאים טיהור וגם לחסוך בעלויות מגיב. כמו כן הגדילה את זמן הדגירה לשתק Chia-PET-DNA כדי חרוזים כדי להבטיח לכידת מקסימלי של ה-DNA Chia-PET על חרוזים streptavidin.

במהלך שלב קשירת הקרבה, ligations chimeric thaלא לא מייצגים אמת אינטראקציות ב vivo הכרומטין נוצרות באופן בלתי נמנע באופן בלתי ספציפי אקראי. לכן, כדי להעריך את איכות נתוני הניסוי Chia-PET בכלל, בשיעור של chimerism מוערך משימוש שני שונים linkers וחצי עם נוקלאוטיד ברקודים ספציפי TAAG ו ATGT ^5. לאחר רצף תפוקה גבוהה, Chia-PET רצפי מנותחים 1 להרכב ברקוד רצפים מקשר נגזר קשירת מוצרים ספציפיים שאינם ספציפיים מוצרי קשירת ניתן להבחין ^8. אחוז מפלצות הידועים (כלומר heterodimers linkers א.ב.) הנמצאים בבית שלנו, MCF-7 RNA פולימראז II Chia-PET ספריות הוא פחות מ 15%.

Chia-PET רצפים מסווגים לאחר מכן לשתי קטגוריות, כלומר עצמית קשירת חיות מחמד, קשירת בין חיות. עצמי קשירת חיות מחמד לקבל קשירת עצמית circularization של שברי הכרומטין תוך קשירת בין חיות מחמד נגזר אניnter-קשירת בין שני קטעי דנ"א שונים. זו האחרונה היא אז המשנה לחלק לשלוש קטגוריות שונות המבוססות על מרחק גנטי של כל תג על כרומוזום זהה (intrachromosomal קשירת בין PETS) או ששני תגיות ממופים שני כרומוזומים שונים (interchromosomal קשירת בין PETS). פיתחנו Chia-PET כלי תוכנה החבילה למיין את ⁸ קטגוריות שונות. זו תתבסס על שברי דנ"א הנמצאים בספרייה. באופן כללי, שברים שבב קטן יותר ייתן רזולוציה גבוהה יותר מנותקים אלה השנייה RNA פולימראז Chia-PET הספריות הוא כ 4 קילו.

בנוסף, אינטראקציות הכרומטין אמיתיים ניתן להבחין בין רעש אקראי על ידי ספירת מספר קשירת בין PETS באשכול אינטראקציה, כלומר, קבוצה של מספר PET גבוהה הוא אמר שיש סבירות גבוהה יותר להיות אינטראקציה אמיתית הכרומטין ⁸ .

לסינון תוצאות חיוביות שגויות שלנולעלות מ עוגנים מועשר שיכול ליצור קשירת בין PETS במקרה אקראי, במסגרת ניתוח סטטיסטי יש גם פותח על מנת להסביר את היווצרות אקראית של כל קשירת בין PETS בין שני עוגנים ^8.

לסיכום, הטכניקה Chia-PET מאפשר מיפוי רשתות אינטראקציה הכרומטין בקנה מידה עולמי. יישום שבב ב Chia-PET מאפשר הפחתת המורכבות ספריה רעשי רקע. כמו כן, שבב מוסיף הספציפיות כדי אינטראקציות הכרומטין, המאפשר בחינה של אינטראקציות הכרומטין ספציפיים הקשורים גורמי תעתוק מסוימים ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
4-20% שיפוע TBE ג'ל	Invitrogen	EC6225BOX	שלב ב ', 6.3
5 x-DNA T4 האנזים מאגר עם PEG	Invitrogen	46300018	שלב ב ', 2.2
6% TBE ג'ל	Invitrogen	EC6263BOX	שלב ב ', 6.8
Agilent דנ"א 100 Assay	Agilent Technologies	5067-1504	שלב ב ', 7.1
Agilent רגישות גבוהה DNA Assay	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	G2940CA
סרכזת מסננים תחתית (Spin-X)	קורנינג	CLS8160	שלב ב ', 3.7 ו - 6.9
Reader Dark Transilluminator	קלייר כימית מחקר	DR46B	שלב ב ', 6.8
Sonifier דיגיטלי נייד משבש	ברנסון	450D-0101063591	שלב א ', 4.3
DynaMag-2 מגנט (מרוכז חלקיקים מגנטיים)	Invitrogen	123-21D	שלב ב ', 7.5.1 שלב, לכל חרוזים מגנטיים כביסה צעדים
DynaMag-15 מגנט (מרוכז חלקיקים מגנטיים)	Invitrogen	123.01D	שלב א ', 5 ו 6
DynaMag-PCR (מרוכז חלקיקים מגנטיים)	Invitrogen	49-2025	שלב ב ', 6.5
Escherichia coli DNA פולימראז אני	חוד	M0209	שלב ב ', 5.6
GlycoBlue	Ambion	AM9516	שלב א ', 7.5.1 שלב ב', 4.3 ו - 6.5
Illumina הדור cBot Cluster מערכת	Illumina	SY-301-2002	שלב ב ', 7.4
Illumina הגנום Analyzer IIx	Illumina	SY-301-1301	שלב ב ', 7.5
Illumina PE primers	Illumina	PE-102-1004	שלב ב ', 5.4 (במידת הצורך)
Intelli-Mixer	Palico ביוטק	RM-2L	שלב ב ', כל incubations עם סיבוב
LightCycler 480 Real-Time PCR מערכת	רוש	04 640 268 001	שלב א ', שלב ב 7.5.3, 7.3
LightCycler480 DNA SYBR הירוק אני MasterMix	רוש	03 752 186 001	שלב ב ', 7.5.3
M-280 streptavidin Dynabeads	Invitrogen	11206D	שלב ב ', 5.2
מגנטית (Dynabeads) חלבון G	Invitrogen	100.03D	שלב א ', 5.1.1 ו 5.2.1
MaXtract בצפיפות גבוהה (2ml)	Qiagen	129056	שלב א ', 7.5.1
MaXtract בצפיפות גבוהה (50 מ"ל)	Qiagen	129073	שלב ב ', 4.2
MmeI	חוד	R0637	R0637
RNase ONE Ribonuclease	Promega	M426C	שלב ב ', 4.8
RNA פולימראז II (8WG16) נוגדנים חד שבטיים	Covance	MMS-126R	שלב א ', 5.2.4
Oak Ridge צינורות צנטריפוגות (פוליפרופילן)	Nalgene	3119-0050	שלב א ', 3.1
Oak Ridge צינורות טפלון צנטריפוגות (FEP)	Nalgene	3114-0050	שלב ב ', 4.3
Phusיון נאמנות גבוהה מיקס מאסטר	Finnzymes	F-531	שלב ב ', 6
Picogreen (קוואנט-IT) מגיב dsDNA	Invitrogen	P11495	שלב א ', 7.5.2
תחתית עגולה פוליסטירן Test Tube	BD Biosciences	352057	שלב א ', 4.1
מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות (מלא, ללא EDTA)	רוש	11873580001	שלב א ', 1.6 ואילך
Proteinase K פתרון (20mg/ml)	Fermentas	E00491	שלב א ', 4.4, 7.5.1 שלב ב ', 4.1
האנזים T4 DNA	Fermentas	EL0013	שלב ב ', 2.2, 3.9 ו - 5.4
T4 DNA האנזים חוצץ (חוד)	חוד	B0202S	שלב ב ', 3.3 ו - 3.9
T4 DNA פולימראז	Promega	M4215	שלב ב ', 1.2
T4 DNA Polynucleotide קינאז	חוד	M0201	שלב ב ', 3.3
TruSeq SBS ערכת V5-GA	Illumina	FC-104-5001	העוצרים עבור Illumina הגנום Analyzer IIx מערכת
TruSeq PE אשכול ערכת v2-cBot-GA	Illumina	PE-300-2001	להיות לשימוש עם מערכת Illumina cBot הדור אשכול
SYBR ירוק אני	Invitrogen	S-7585	שלב ב ', 6.3 ו - 6.8
XCell SureLock מיני נייד אלקטרופורזה מערכת	Invitrogen	EI0001	שלב ב ', 6.3 ו - 6.8

שם	רצף		תגובות
Biotinylated חצי linkers (200ng/μl)	ראש	5 "GG CCG CGA / iBiodT / ATC tta TCC AAC 3"	250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פנימי ביוטין DT (9)
	בוט	5 'GTT GGA ט.א.א. גת ATC GC 3 "	250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים
Biotinylated חצי linkers B (200ng/μl)	ראש	5 "GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3"	250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פנימי ביוטין DT (9)
	בוט	5 'GTT GGA ATG תאת ATC GC 3 "	250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים
ללא biotinylated חצי linkers (200ng/μl)	ראש	5 "GGC CGC גת ATC GGA TCC AAC 3"	250 nmole בהיקף PCR כיתה
	בוט	5 'GTT GGA TCC גת ATC GC 3 "	250 nmole בהיקף PCR כיתה
GS20 מתאם (200ng/μl)	ראש	5 "המרכז לאמנות עכשווית TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 "	250 nmole בהיקף PCR כיתה
	בוט	5'CTG AGA החטיבה GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG החטיבה GGA TGA גת GG 3 "	250 nmole בהיקף PCR כיתה
GS20 מתאם ב '(200ng/μl)	ראש	5 "CTG AGA CAC GCA ACA GGG גת AGG CAA GGC ACA החטיבה GGG ATA GG 3"	250 nmole בהיקף PCR כיתה
	בוט	5 "CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3"	250 nmole בהיקף PCR כיתה
Illumina-NN מתאמי	ראש	5 "ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3"	250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים ראה שלב ב ', 5.4
	בוט	5 "phos - גת CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3"	250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פוספורילציה סוף '5 ראה שלב ב', 5.4
Illumina 1-454 (קדימה) פריימר (10 מיקרומטר)	5 "AAT גת ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3"		250 nmole בהיקף PCR כיתה
Illumina 2-454 (הפוכה) פריימר (10 מיקרומטר)	5 "CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA גת CGG TCC ATC TCA TCC CTG מס רווחי הון GTC 3"		250 nmole בהיקף PCR כיתה
QPCR פריימר 1.1 (10 מיקרומטר)	5 "AAT גת ACG GCG ACC ACC GAG AT 3"		10nmole בהיקף PCR כיתה
QPCR פריימר 2.1 (10 מיקרומטר)	5 "CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3"		10nmole בהיקף PCR כיתה
Illumina 3-454 רצף צבע יסוד (100 מיקרומטר)	5'TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 "		100nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים
Illumina 4-454 רצף צבע יסוד (100 מיקרומטר)	5'GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3 "		100nmole בקנה מידהHPLC מטוהרים