סינתזה של<em&gt; ב-vivo</em&gt;-MRI לגילוי אפופטוזיס בדיקה

Summary

גילוי מוקדם של אפופטוזיס עשוי לזהות אוכלוסיות בסיכון סלולריים במגוון רחב של מחלות. כאן אנו מראים שיטה לקשר חלבון מוקדם אפופטוזיס איתור (Annexin V) כדי nanoparticle-MRI לגילוי תחמוצת ברזל (SPIO). שיטה זו עשויה להתארך עד חלבונים אחרים בעלי עניין לייצר-MRI לגילוי בדיקות הדמיה מולקולרית.

Abstract

אפופטוזיס נייד הוא מאפיין בולט של מחלות רבות, וזה מוות תאים מתוכנת מתרחשת בדרך כלל לפני הביטויים הקליניים של המחלה ניכרות. אמצעי לזהות אפופטוזיס הראשונים שלה, בשלבים הפיך היה להרשות לעצמו קדם קליניים "חלון" שבמהלכו אמצעי מניעה או טיפול שניתן לנקוט כדי להגן על הלב מפני נזק בלתי הפיך. אנו מציגים כאן שיטה פשוטה חזקים כדי להטות האדם Annexin V (ANX), אשר נקשר לתאי בשקיקה אותם בשלבים הראשונים הפיך של אפופטוזיס, לגהץ פאראמגנטי תחמוצת (SPIO) חלקיקים, המשמשים כסוכן-MRI לגילוי ניגוד. שיטת הצמידה מתחיל חמצון של חלקיקים SPIO, אשר מתחמצנים קבוצות carboxyl על הקליפה פוליסכריד של SPIO. מטוהרים חלבון ANX נוסף ואז במסגרת של פתרון נתרן borate כדי להקל על האינטראקציה קוולנטי של ANX עם SPIO במאגר צמצום. השלב האחרון עם ירידה borohydrid נתרןהדואר מתבצעת על מנת להשלים את הירידה, ואז התגובה היא הרווה. ANX Unconjugated יוסר תערובת ידי סינון microcentrifuge. גודל והטוהר של המוצר ANX-SPIO מאומת על ידי פיזור אור דינאמי (DLS). שיטה זו אינה דורשת בנוסף, או שינוי, פוליסכריד SPIO פגז, בניגוד צולבים תחמוצת ברזל החלקיקים שיטות לצמידה או ביוטין, שכותרתו חלקיקים. כתוצאה מכך, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה, חזקה כי ניתן להאריך את הצמידה של חלבונים אחרים בעלי עניין.

Protocol

מעובד מתוך מחקר לפני ^1.

1. נטיה של Annexin V כדי SPIO

1. לחמצן חלקיקים SPIO (האוקיינוס ​​ננוטק Inc, 5 מ"ג / מ"ל) עבור 1 שעה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בחושך בתמיסה עם 0.15 מ 'נתרן periodate (NaIO ₄₎ (4:01 משקל: יחס משקל) ^2.
2. דגירה SPIO חמצון במשך שעה עם 12 מטוהרים חלבון ANX (1:1 יחס, משקל: משקל) ב borate M 0.15 נתרן (Na ₂ B ₄ O ₇ 10 שעות ₂ O) בשעה 20 ° C.
3. מנמיכים את תערובת נוספת שעה 1 עם borohydride נתרן (NaBH ⁴⁾ מתחת למכסה המנוע קטר ואז להרוות עם 0.15 מ 'טריס-HCl.
4. הפרד ANX ללא ANX-SPIO ידי צנטריפוגה ב XG 14,000 (75 נקבוביות מיקרומטר Microcon מסנן, Millipore, Billerica, MA).
5. לחדד עוד יותר את המתחם על ידי הסרת זיהומים מאוגד באמצעות מכשיר מפריד מגנטי (האוקיינוס ​​ננוטק, Inc).
6. לכמת את retentate מסנן (ANX-SPIO) רמות החלבוןעל ידי assay חלבון ברדפורד וחנות ב -80 ° C ב 2 מ"ג / מ"ל ​​0.1 M Tris-HCl עם 1% מעכבי פרוטאז אלבומין בסרום (פרוטאז האלט מעכב, Thermo Scientific, 1-50 מ"ג / ANX מ"ג).

2. פיזור אור דינאמי

1. בנפרד לדלל את SPIO ANX ו-SPIO ב PBS צפיפות אופטית של 0.1 ולנתח ידי פיזור אור דינאמי על מכונת ננו DLS Zetasizer (Malvern בע"מ, ווסטרשייר, בריטניה) ^3.
2. להשיג פסגות monomodal (באופן אידיאלי) עבור המתחם, בגודל Z-הממוצע החלקיקים ואת ראשי polydispersity (PDI). תשוו את זה גודל לגודל DLS-מדודה של nanoparticle תחמוצת ברזל בלבד. ANX-SPIO תוצאות DLS הראה חלקיק המצומד הידרודינמית בקוטר של 78 ננומטר עם פ"ד של 0.13 ^1, המשקף הומוגניות ANX-SPIO המינים ^3.

3. תרבית תאים, אינדוקציה של אפופטוזיס בתרבות, ו-MRI של תאים בתרבית

1. למבוגרים תרבות העכבר מח עצם של mesenchymalתאים TEM (mMSCs) ב DMEM השלימו עם 10% ו 1% FBS פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, Inc), רצוי במעבר ^20-30 אפריל.
2. לגרום אפופטוזיס בתאי תרבית ידי טיפול עבור משתנה פעמים ב 37 ° C עם DOX (Sigma, 1 מ"מ מלוחים 0.9%, ריכוז 1 מיקרומטר בתקשורת) ^12.
3. לכמת את כמות אפופטוזיס בתרבות או באמצעות MRI עם ANX-SPIO (המתואר 3.4 להלן) או באמצעות מיקרוסקופ לאחר TUNEL כתם (APO-BrdUTM TUNEL Assay קיט, בדיקות מולקולריות / Invitrogen, יוג'ין, OR) או אחריו כתם עם ANX-FITC (Roche, שוויץ).
4. לתייג את התאים עם ANX-SPIO (10 חלבון / mL מ"ג בינוני למעט כאמור), או עם משקל שווה ערך חינם SPIO (5 מ"ג), במשך 15 דקות ב 37 ° C. לשטוף 4 פעמים עם PBS, וכן כיסוי עם 1 מ"ל של agarose 1% כדי למנוע דיפוזיה של חלקיקים SPIO. לבצע בדיקת MRI של המנות (כמתואר בהמשך). לחלופין, לשטוף את התאים לאחר trypsinize DOX ANX ו-SPIO תיוג, ואז לאפשר לתאיםיוצרים כדורי ב Eppendorf צינורות.

4. במבחנה MRI

1. השתמש 1.5 או 3 טסלה GE Signa סורק Excite עם סליל המקלט תקן הברך בניתוח MRI חוץ גופית.
2. מניחים את הכלים תרבות או צינורות לתוך רפאים אגר, ואת התמונה, תוך שימוש ברצף הדרגתי, הד שיפוע מפונק: זמן החזרה (TR) 550 מילישניות, זמן אקו (TE) 10 ms, זווית להעיף 15 °, מטריקס 256 x 256, שדה של נוף 3 ס"מ X 3 ס"מ, עובי פרוסת 1.3 מ"מ, מספר ממוצעים (NEX) 2, 0 המרווח ⁵ מ"מ. תמונה axially דרך שכבת תאים בצלחת על אובדן האות * T2, תוך שימוש באזורים של ריבית (ROIs) של אזור קבוע (למשל, 0.8 מ"מ ^2). להתאים את הרקע באמצעות אותות בקרה ROI מ רפאים אגר. למדוד את רעשי הרקע של האות האוויר המקיף את הפנטום.
3. חישוב יחס ניגודיות MRI לרעש (CNR: [SI SI-ROI מדגם השליטה ROI] / [SD של SI של רעשי רקע], שם SI היא עוצמת האות,SD הוא סטיית התקן) חושב על כל מאכל התרבות.

5. נציג תוצאות

מדידה של אובדן * האות T2 במבחנה דורש פנטום אגר הומוגנית וחוסר בועות אוויר, אשר תיצור חלל חפץ האות. ממצא זה קשה להבחין בין אובדן אמיתי * T2 האות של SPIO, הוא קריטי לתוצאות לפירוש. אנא ראה איור 1 למשל של חפץ האוויר כמו גם תחמוצת ברזל אמיתי T2 * אובדן האות.

עבור הדמיה מנה חוץ גופית התרבות, החל נפח מתאים של ג'ל אגר לצלחת בכל תרבות, כך מספיקות פרוסות ה-MRI צירית, שהם כ 1 מ"מ עובי, ניתן לבצע את התמונה כראוי את המנה כולה. איור 2 ממחיש את האות הצפוי MRI מצלחות תרבות בודדים אגר. יש בדרך כלל איזו וריאציה האות בשולי הצלחת, לכן ניתוח של אזורים של interest יש להימנע באזורים אלה לא אחידים.

באיור 1. ANX-SPIO מזהה אפופטוזיס בתרבית cardiomyocytes חולדה היילודים. איור 1 א מציג תמונה של cardiomyocytes היילודים pelleted שטופלו פתרון שליטה (צינור משמאל), ANX-SPIO (צינור באמצע), ו-DOX + ANX SPIO (צינורית מימין) . הערה צבע חום של DOX + ANX-SPIO תאים שטופלו, המשקף שמירה מוגברת של המתחם ANX-SPIO בתאים אפופטוטיים. 1B איור בתמונות חוץ גופית ה-MRI הראו אינטנסיבי T2 * אובדן האות של + DOX ANX-SPIO תאים. כמו כן, בועת אוויר נתפס בין ^ה 4 ו 5 ^th Eppendorf צינורות (אות קטנה חלל שחור), אשר דומה הריק את האות של ANX-SPIO, ואשר יכול להשפיע על ניתוח של CNR.

איור 2. ANX-SPIOמחייב הוא ספציפי של תאים אפופטוטיים בתרבות. 2A איור מדגים cardiomyocytes חולדה אפופטוטיים היילודים על הכלים תרבות, נתון מכתים ANX-FLUOS או ANX-SPIO מכתים, עם ריכוז נמוך וגבוה (ימינה ושמאלה, בהתאמה) של ANX-SPIO. הערה אחרת T2 * אובדן האות (סיגנל שחור) של תאים אפופטוטיים כי טופלו ANX ניאון (ANX-FLUOS) ורמות נמוכות לעומת רמות גבוהות של ANX-SPIO. יותר T2 * אובדן האות בצד ימין קשורה האות ANX-FLUOS מופחת במידה ניכרת, אשר התחרו את ידי ASX-SPIO ריכוזים גבוהים יותר. איור 2B מדגים מחייב התחרותי של ANX-SPIO לעומת ANX-FLUOS האות דיסוציאציה קבוע, K _i. ציר ה-X מציין את ריכוז החלבון Annexin בהיקף יומן.

סרט 1. לחץ כאן כדי להציג משלימההסרט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטת הצמידה תיאר לקישור SPIO כדי Annexin V מנצל את שרשרת לוואי אמין קבוצות Annexin ואת moieties carboxyl של nanoparticle SPIO. דרך הפחתת חמצון צעדים ספציפיים, הצמדה קוולנטי של תרכובות אלה ניתן להשיג, ואת nanoparticle פונקציונליות וכתוצאה מכך יכול להיות מבודד. שיטה זו עשויה להכליל את חלבונים אחרים חל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	קטלוג #
ברזל פאראמגנטי תחמוצת	האוקיינוס ​​ננוטק, Inc	איכס-40-005
דוקסורוביצין	סיגמא	D1515-10 מ"ג
SuperMag מפריד	האוקיינוס ​​ננוטק, Inc	N / A
Zetasizer ננו מכונת DLS	Malvern, Inc	N / A