קביעה מהירה של סף nociceptive תרמי בעכברים סוכרתיים

Summary

כאן אנו מתארים הליך אמין ופשוט מהירה כדי לקבוע את הטמפרטורה הנמוכה ביותר שבה חולדות או עכברים מראים התנהגות nocifensive, כלומר סף nociceptive תרמית (TNT). שיטה זו חל גירוי תרמית לאט להגדיל המאפשר הערכה מדויקת לשחזור של TNTs עם מינימום, אם בכלל, הלחץ על בעלי חיים.

Abstract

נוירופתיה סוכרתית כואבת (PDN) מאופיין hyperalgesia כלומר, רגישות מוגברת לגירוי מזיק, ו allodynia כלומר, רגישות יתר לגירויים לא מזיקים בדרך כלל ^1. Hyperalgesia ו allodynia נחקרו רבות מכרסמים מודלים שונים של סוכרת ^2. עם זאת, כאמור על ידי Bölcskei ואח', קביעת "כאב" במודלים של בעלי חיים הוא מאתגר בשל אופי סובייקטיבי שלה ^3. יתר על כן, השיטות המסורתיות ששימשו בקביעת תגובות התנהגותיות לגירויים תרמית רעילים בדרך כלל אין שחזור ו ³ רגישות תרופתי. למשל, באמצעות השיטה צלחת חמה של Ankier ^4, נרתע, ונסיגה / או ליקוק של או אחורית ו / או האסיפות כפות מכמתים כמו latencies רפלקס ב גירויים קבועים תרמית גבוהה (52-55 מעלות צלזיוס). עם זאת, בעלי חיים, כי הם hyperalgesic לגירוי תרמי לא reproducibly להראות הבדלים מחדשלהגמיש latencies באמצעות אלה לעיל סף בטמפרטורות ^3,5. כמו השיטה המתוארת לאחרונה Bölcskei et al. ^6, בהתאם לנוהל המתואר מאפשר קביעה מהירה, רגיש לשחזור של ספי nociceptive תרמית (TNTs) בעכברים וחולדות. השיטה משתמשת גירוי תרמית לאט להגדיל מיושם בעיקר על העור של משטח העכבר / עכברוש plantar. השיטה היא רגישה במיוחד ללמוד אנטי nociception במהלך מדינות hyperalgesic כגון PDN. הנהלים שתוארו לשאוג מבוססים על אלה שפורסמו בהרחבה על ידי Almási et al ⁵ ו Bölcskei ואח' ^3. הנהלים שתוארו כאן אושרו על בעלי חיים במעבדה טיפול ועדת שימוש (LACUC), רייט סטייט.

Protocol

TNTs של עכברים וחולדות נקבעים באמצעות מצטבר צלחת חמה, כאבים מטר [iHPAM, IITC חברת מדעי החיים (Woodland Hills, CA)]. הציוד כולל מספר מרכיבים: צלחת אלומיניום (10 x 20 ס"מ) עם מערכת חימום מתחת וחדר תצפית פרספקס לעיל; יחידת חום שליטה, תוכנה עבור רכישת נתונים (סדרה IITC החלק הרך # 8), מחשב (אישית מחשב) ו footswitch לתחילת מרחוק, להפסיק או לאפס את השליטה היחידה. מערכת החימום גם מאפשר להתחיל / לעצור / איפוס של תהליך חימום ידני באמצעות לוח המקשים מול הציוד. IHPAM ניתן להגדיר שיעורי חימום שונים, המתנה / הפסקת טמפרטורות.

1. ציוד Set-up

1. לפני חיות בדיקות, לבדוק ויזואלית את היחידה כדי לאשר את שיעורי חימום הנבחרים (למשל, 6 ° C / min), טמפרטורות המתנה והאחרון חתוכים הראשוניים (למשל, 28 ° C עד 55 ° C, בהתאמה).
2. בדוק את כל החיבורים. כדי לשמור עותק אלקטרוני של התוצאות, היחידה חייבת להיות מחוברת למחשב שבו פועל סדרה תוכנה 8. לחלופין, עותקים קשיחים של התוצאות ניתן להדפיס את דרך היציאה הטורית של היחידה.
3. לבדוק את הציוד. לחץ footswitch פעם אחת כדי לוודא סדרה תוכנה 8 רשומות הנתונים הראשוניים: המתנה, טמפרטורות גזורים האחרונים וזמן בשניות הנדרשים כדי להגיע לטמפרטורה חתוכים.
4. מבחן שליטה נוסף, החוקרים העוסקים בניסויים ייתכן שיהיה עליך לחוות את המכשיר על עצמם. הוצאת יד מהצלחת מתכת ברגע תפיסת הכאב (46-48 ° C) יש לא לגרום נזק לעור ולא לייצר שום אי נוחות מאוחר יותר.
5. פעם אחת יחידה נקבע והתוצאות של צעדים 1.3 ו 1.4 רשמה אפשר להשוות. זה עוזר לזהות בעיות פוטנציאליות שיכול לפסול את השימוש של היחידה. לדוגמא, התאמה בין ראשוני המתנה / Final Cut-off בטמפהratures ואת הקריאה בפועל של היחידה, ו / או ההבדלים בין הטמפרטורות המוצגות על ידי יחידת והטמפרטורה הצלחת בפועל נדרש לנסיגה יד.

2. בדיקת בעלי חיים נורמליים

או צעיר או מבוגר Wistar חולדות [שלאחר הלידה (עמ ') בגיל 21-25 ימים], או עכברים (p21-25) של רקע גנטי או כל מין יכול לשמש. העכברים ששימשו בניסויים שלנו הם C57BL/6J מתח.

1. בלילה שלפני הניסויים שיבוצעו, את בעלי החיים להסתגל ידי הצבת הכלובים שלהם על הספסל שם iHPAM ממוקם. שעתיים לפני ביצוע בדיקות, להפעיל את iHPAM להכיר את בעלי החיים עם רעש הרקע של היחידה. בשלב זה, iHPAM ניתן להגדיר נבדק כדי לוודא תפקוד תקין (ראה שלבים 1). מזון ומים מסופק libitum מודעות לאורך כל הבדיקה, אלא אם בעל החיים הוא בחדר תצפית (ראה שלב 2.1).
   הערה: שדortant לא להניח כי בתנאי מעבדה בניסויים התנהגותיים נשלטים על ידי מחדל. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם על גורמים גנטיים וסביבתיים שעשויים להשפיע על תוצאות של מחקרים התנהגותיים (בדיקה ב ^7).
2. בעדינות להניח עכבר עכבר רגיל / בתא פרספקס תצפית על גבי צלחת חימום של היחידה. אפשר חיה להסתגל לפני השטח החמים (נקבע על 28 מעלות צלזיוס) עד שהחיה מראה התנהגות נוח.
   הערה: בתנאים אלה חולדות בוגרות נורמליים להראות התנהגות גישוש ראשוני, לעתים בעמידה לכיוון מכסה תא תצפית תוך רחרוח. אחרי כמה דקות, חולדות עשוי להראות התקפי מזדמנים של הטיפוח ושל התנהגות רגועה. לפעמים, חולדות מוטלת על תנוחת גוף נינוחה (הארכת מועד) ואילו כלאחר מרחרח את הסביבה. עכברים רגילים הם בדרך כלל פעילים יותר חולדות. עם זאת, בעכברים הראו התנהגות גישוש רגועה לאחר כמה דקות אניעכ חדר התצפית. זה נדיר במיוחד לצפות התנהגויות משני הבורחים (למשל, קפיצה, מנסה להימלט מן החדר תצפית) או עמדות הגנתיות (למשל, לצווח). כמו כן, חשוב לציין כי עכברים יכולים לתקשר הכאב עכבר אחד לאחר ^8. לכן, זה עשוי להיות חשוב עכברים הבדיקה שהוטלו בכלובים נפרדים.
3. במקום מראות האחורי של חדר תצפית, כדי לאפשר תצפיות על הזוויות. החצובה מחזיקה מצלמת וידאו דיגיטלית יכולה לעזור לקבוע את הרגע המדויק שבו התנהגות nocifensive (כאב הימנעות) התרחש.
4. פעם חיה נוח בחום התצפית קאמרית את הצלחת על ידי לחיצה על footswitch. כאשר הטמפרטורה צלחת מתחמם בקצב של 6 דקות ° / C, בעלי חיים נורמליים התנהגות nocifensive מעורבים או רגלו האחורית-* בדרך כלל הטמפרטורות המשתוללות 46-48 ° C ^3,5,9,10. לכן, החיה היא להסיר בצורה אופיינית observation החדר לאחר כ 3 דקות.
   הערה: התבוננות בתגובה nocifensive אופייני כלומר חולדה או עכבר, רגלו האחורית, ללקק, תוך רעד ו / או הרמה, הוא מספיק כדי להפסיק את הגירוי תרמית. זו מושגת על ידי לחיצה על footswitch. ברגע זה, התוכנה רושמת הטמפרטורה של צלחת צלחת מיד מתקרר עד לטמפרטורה המתנה (28 ° C) הוא הגיע (~ 0.5 דק '). כלומר, זו הטמפרטורה, 1 המעוררת כל תגובה nocifensive נחשב סף החום מזיק (TNT) של בעל החיים (שליטה) רגיל.
   * לפעמים, בעיקר בעכברים, התנהגות nocifensive לטמפרטורה מזיק עלול 1 לצפות בעין אחת או בשתי כפות רגליו הקדמיות (למשל, ליקוק בזמן ישיבה), שניות לפני האחוריות הכפות. עם זאת, קדמי, כפה ללקק הוא מרכיב נורמלי ההתנהגות הטיפוח. לפיכך, רק האחוריות, כפות תגובות מוערכים. בהזדמנויות עכברים עשויה לטפח הכפות האחוריות שלהם גם כן. עם זאת, טיפוח רגיל לעשות nOT יותר לאחרונה מכמה שניות, אינו כרוך אינטנסיבית ללקק מסתיימת בדרך כלל לאחר הניקוי ציפורניו.
5. הוצא בעדינות את החיה מהצלחת ולשים אותו בכלוב שלו בהתאמה. מדידת סף החום חוזר על עצמו אז עבור בעל חיים אחר (רגיל).
   הערה: TNTs יכול להיקבע חיה אחת במרווחים של 1-2 דקות מבלי להסיר את החיה מחדר התצפית. קביעות TNT אצל חולדות או עכברים ניתן לחזור מספר פעמים במשך מספר ימים. תכונה זו שימושית במיוחד כדי לקבוע את TNT הממוצע של בעלי חיים הפרט, כמו גם וריאציה שלה עם הגיל.
6. TNT של חיות בקרת מבוטא ממוצע של שלושה או יותר ספי ± SEM.
7. ניתוח סטטיסטי של נתונים המתקבלים מתבצע להשוות בין קבוצות הטיפול השונות של עכברים או חולדות. נהלים פרמטריים כולל ניתוח שונות ניתן להשתמש בו כראוי נתונים מופצים בדרך כלל ואיפה קבוצות הטיפול הם הומוskedastic, כאשר התנאים מולאו הגישות הבאות ניתן ליישם. ניתוח שונות ואחריו מבחן ניומן, Keuls לזהות הבדלים מספר מדידות חוזרות ונשנות, כלומר TNTs בודדים עם / ללא טיפול או בנקודות זמן שונות (למשל, נתונים איור 3). הסטודנטים של זיווג מבחן t ניתן להשתמש כדי להשוות בין שתי קבוצות נתונים כלומר TNTs לפני לעומת אחרי טיפול תרופתי, מבחן t מזווג ניתן להשתמש כדי לקבוע הבדלים שינויים ב-TNT תחת טיפול תרופתי לעומת כלי רכב בעלי חיים המקבלים יחס (למשל הנתונים באיור 4).

3. בדיקת בעלי חיים סוכרתיים

Streptozotocin (STZ) הנגרמת עכברוש סוכרתית היא מודל החיה הנפוצה ביותר ללמוד מנגנוני PDN ולהעריך משככי כאבים וטיפולים ^11,12. חולדות עשה סוכרתית על ידי מנה בודדת של STZ intraperitoneal (60 מ"ג / ק"ג) יכול בדואר נבדק על hyperalgesia תרמית במהלך השבוע 3 ^rd לאחר הופעת סוכרת ^11. חשוב לציין כי לא כל חולדות סוכרתיות לפתח PDN. עם זאת, בעלי חיים, כי אין לפתח hyperalgesia (~ 50%) ניתן לזהות בקלות. אכן, TNTs שלהם נמוכים * נורמלי.

* כדי לקבוע TNTs של STZ סוכרת חולדות, טמפרטורה צלחת התחלתי של 15 מעלות צלסיוס במקום 28 מעלות צלזיוס משמש. הסיבה לשינוי היא כי בעלי חיים אלה סוכרתיים ביותר עם ​​PDN צפויים להיות ^2,11 hyperalgesic. לכן, הם יצטרכו נמוך מהרגיל ספי חום רעילים (למשל, <45 ° C).

1. עכברוש סוכרתית ממוקם בתא התצפית על גבי מתקן הבדיקה. בעלי חיים מותר להסתגל לפני השטח את הצלחת עד חיה מראה התנהגות נוח.
   הערה: בדרך כלל, חולדה חולה סוכרת לא מראה הרבה של התנהגות נורמלית. חולדות סוכרתיות הן hypoactive בדרך כלל, אדיש, ​​לעיתים קרובות מראהתנועות מוגבלות וטיפוח איטי. זה נדיר לראות טבלאות לכיוון מכסה תא התצפית. לאחר דקות ספורות, חולדות סוכרתיות יכול בשקט להישאר בפינה של החדר עם מזדמנים מרחרח של הסביבה.
2. פעם חיה סוכרתית נוח בתא המדידה, צלחת מחוממת בתור בשלב 2.3 חולדה חולה סוכרת יכול התנהגות nocifensive מעורבים או אחורית / קדמי, כפה. זה קורה בדרך כלל בשעה בלתי רעילים בטמפרטורות צלחת (למשל, <45 ° C), או לאחר לא יותר מ 5 דקות בתא עם עלייה ° C / min 6 הטמפרטורה.
   הערה: התגובה nocifensive של עכברוש צעיר חולה סוכרת אינה שונה מזו של עכבר רגיל. עם זאת, הטמפרטורה הנמוכה ביותר לעורר התנהגות כזו הוא הוריד באופן משמעותי.
3. ראה שלב 2.4
4. ממוצע של יותר משלושה ספי ביום הניסוי כפי שבאה לידי ביטוי ° C ± SEM נחשב סף החום מזיק של diabetiג חיה.
   הערה: הפרדיגמה דומה לזו הסביר לחולדות נורמליות או סוכרת יכולה להיות מלווה על מנת לקבוע את האפקט התרמי נגד nocifensive של משככי כאבים על סף החום.

4. בדיקות שיכוך כאבים

נגד nociceptive את המאפיינים של תרופות (כגון: משככי כאבים), כמו גם קביעת פרמטרים תרופתי כגון מינון אפקטיבי מינימלי ניתן להשיג בקלות באמצעות השלבים שהוסבר לעיל. הוא ניבא כי מינונים מתאימים של כאבים מנוהל על חולדות / עכברים היה להגדיל באופן משמעותי TNTs שלהם. זה רגיש במיוחד אצל בעלי חיים עם hyperalgesia תרמית ^3. עם זאת, כדי למנוע הטיה בפרשנות של התוצאות, החוקרים המעורבים תצפית התנהגותית של קבוצת בעלי חיים לא צריך לדעת או להיות מודעים אם החיות טופלו או לא. יתר על כן, סמים להיות מוזרק על ידי הצופה עשוי להיות מוכן על ידי חוקר אחר ומסומן, B, C, מינון וכו 'מסופק תדפיס, רישום מנות בודדות לכל בעל חיים מזוהים.

בהתאם התרופה הנבדקת, מינונים שונים של כאבים הפוטנציאל עשוי להינתן לבעלי חיים נורמליים או סוכרת 5-15 דקות לפני בדיקות התנהגותיות. בקרות מתאימות יש לכלול (כלומר, גיל מתאימים בעלי חיים הזריק עם הרכב לבד ו / או חולדות סוכרתיות ללא PDN) ונבדקו באמצעות תנאים זהים (למשל, הטמפרטורה מתחילה באותה צלחת). תופעות כרוניות של תרופות ניתן לבדוק גם כן.

5. נציג תוצאות

הטמפרטורה הנמוכה ביותר הצלחת לעורר תגובות nocifensive על רגלו האחורית, אחד הצעירים שאינם בוגרים שטופלו חולדות או עכברים נורמליים נקבעו השלבים הבאים 2-1 ל 2-6. כפי שניתן לראות בתרשים 1, TNT של הנורמה חולדות ועכברים בוגרים צעירים היו 47.2 ± 0.2 מעלות צלזיוס, 47.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס, בהתאמה.

יש לנו obseוריאציה rved לא יום משמעותי TNTs של הפרט (איור 2 א) ולא שינויים משמעותיים של TNTs בקרב אנשים בני אותו גיל (תרשים 2B). הבדלים TNT בגלל מין לא נצפו (לא מוצג).

TNTs של STZ סוכרת בעכברים צעירים למבוגרים נקבעו באופן דומה לחולדות נורמליות (שלבים 3.1 עד 3.3). עם זאת, הטמפרטורה צלחת של ההתחלה נקבע עד 15 ° C במקום 28 ° C. התנהגות nocifensive של STZ סוכרת חולדות הוערך לפחות שלוש פעמים אצל אדם ובצורה יומי החל 11 ימים לאחר STZ ההזרקה. כפי שניתן לראות באיור 3, ירידה משמעותית (p <0.01) ב TNT של STZ סוכרת בעכברים מתברר שבועיים לאחר STZ ההזרקה. TNT ממוצע של STZ סוכרת בחולדות היה 45.6 ± 0.1 מעלות צלזיוס (n = 16, אספו ערכים של 14-23 ימים).

חולדות סוכרתיות המציגים TNT נמוך משמעותית נורמהאני נחשבו יש PDN. חולדות אלה שימשו כדי לבדוק את חריפה נגד nociceptive המאפיינים של כאבים (מתחם). TNTs נקבעו עכברים נורמליים סוכרת הזריק עם מנה אחת או המתחם או ברכב לבד חמש דקות לפני הבדיקה. כפי שמוצג באיור 4, מנה בודדת תוך הצפק של המתחם גדל באופן משמעותי TNTs של חולדות סוכרתיות לעומת חולדות שטופלו הרכב בלבד (45.6 מעלות צלזיוס לעומת 47.6 ° C, בהתאמה). השפעה אנטי nocifensive של המתחם נצפתה גם בעכברים נורמליים, אם כי משמעותי (p <0.01), זה היה פחות מובהק (47.4 מעלות צלזיוס לעומת 48.0 ° C, בהתאמה).

באיור 1. קביעת TNTs של הנורמה חולדות או עכברים בוגרים צעירים: את TNTs של חולדות בוגרות צעירות (p21-24) או עכברים (P20-21) נבדקו iHPAM בעקבות הצעדים המפורטים ABOיש. סך של 12 חולדות ועכברים 25 נבדקו. מדידות שבוצעו במשך מספר ימים והתוצאות היו נקווה. תוצאות מבוטאות ממוצע ± SEM. מינימום ומקסימום ערכים TNT רשמה אצל חולדות אלה היו 46.2 ° C ו 48.6 ° C בהתאמה. במקרה של עכברים, ערכי מינימום ומקסימום TNT נרשמו 48.8 מעלות צלזיוס, 44.9 ° C, בהתאמה.

איור 2. גיל התלות של TNTs אצל חולדות ועכברים:) זממו הם TNTs של ארבעה עכברים נורמליים (n = 4) של 21 ימים בגיל שנקבעו לפחות שלוש פעמים ביום במשך 5 ימים ב ') TNTs של עכברים שגרים נקבע פעם אחת עולה. המון זמן. את המספרים על גבי כל נקודה נחישות מייצג את מספר להמלטה בשימוש.

איור 3. חולדות סוכרתיות להיות 3 hyperalgesic לנוeks לאחר הופעת סוכרת: TNTs של 6 (n = 6) בגיל בהתאמה צעירים STZ סוכרת בעכברים בוגרים נקבעו כל יום החל 11 יום לאחר גיוס של סוכרת. המוצגים הם היומיים הממוצעים TNT (ממוצע ± SEM). TNTs סוכרת שנקבעו בין הזרקת 11-13 לאחר STZ ימים היו בטווח התקין (קו אדום). שבועיים לאחר TNTs STZ הזרקת ירידה משמעותית 45.1 ± 0.4 מעלות צלזיוס, (p <0.05).

באיור 4. חריפה נגד nocifensive ההשפעות של B מתחם STZ סוכרת בעכברים וחולדות. צעירים נורמליים בוגרים (כחול קבוצת n = 12) וגיל מתאימים STZ סוכרת חולדות hyperalgesic (ירוק קבוצת n = 6) נבדקו iHPAM לאחר ההזרקה intraperitoneal של הרכב (ברים אפלים) או מתחם (עמודות אור). ממוצע TNT ± SEM עבור כל טיפול (שליטה ברכב או מתחם שטופלו) מוצגים. כוכביות לציין הבדלים סטטיסטיים(P <0.05).

Discussion

באופן דומה למבחן הצלחת קלאסי חם לכמת hyperalgesia תרמית ^4,13, assay של nociception המתואר כאן מאפשר דרך מהירה ואמינה לכמת התנהגות nocifensive בחולדות ועכברים. עם זאת, בניגוד מבחן קלאסי, השיטה המצטברת צלחת חמה אינו פולשני ולמעשה ללא מתח. למרות שחלק לרסן יש צורך לבצע את הבדיקה (כלומר,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	חברה	מספר קטלוגי
מצטבר חם פלייט שיכוך כאבים Meter	IITC מדעי החיים בע"מ	חלק # PE34
סדרת Soft 8	IITC מדעי החיים בע"מ	חלק # Series8
Streptozotocin	Calbiochem	572201