גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Summary

שחפת Mycobacterium מהווה biofilms סמים סובלניים כאשר בתרבית בתנאים מסוימים. כאן אנו מתארים שיטות culturing מ ' שחפת biofilms וקביעת תדירות persisters סמים סובלניים. פרוטוקולים אלה יהיה שימושי למחקרים נוספים לתוך מנגנוני עמידות לתרופה בתוך: מ ' שחפת.

Abstract

Mycobacterium שחפת, סוכן האטיולוגי של שחפת האדם, יש יכולת יוצאת דופן לשרוד כנגד לחצים סביבתיים, כולל אנטיביוטיקה. למרות הלחץ הסובלנות של מ ' שחפת היא אחד התורמים צפוי כימותרפיה 6 חודשים ארוכה של שחפת ^1, המנגנונים המולקולריים שבבסיס זה פנוטיפ אופייני הפתוגן עדיין אינן ברורות. מינים רבים של חיידקים פיתחו כדי לשרוד בסביבות מלחיצים על ידי הרכבה עצמית על פני השטח, מאורגן המצורפת, ו מטריקס מבנים כמוס קרא biofilms ^2-4. הגידול ביישובים נראה האסטרטגיה המועדפת הישרדות של חיידקים, והיא מושגת באמצעות רכיבים גנטיים המווסתים מצורף משטח, תקשורת אינטר, וסינתזה של חומרים פולימריים תאיים (EPS) ^5,6. עמידות ללחץ סביבתי הוא הקל ככל הנראה על ידי EPS, ואולי על ידי physioloההסתגלות של החיידקים gical הפרט microenvironments הטרוגניות בתוך הארכיטקטורה המורכבת של biofilms ^7.

בסדרה של מאמרים האחרונות הקמנו כי מ ' שחפת Mycobacterium smegmatis יש נטייה חזקה לגדול מבנים תאיים מאורגנים, קרא biofilms, שיכול לשאת יותר מ -50 פעמים הריכוזים מעכבות מינימלי של שחפת תרופות נוגדות isoniazid ו ^8-10 ריפאמפיצין. מ ' השחפת, לעומת זאת, מסקרן דורש תנאים מסוימים כדי ליצור biofilms בוגרים, ב 09:01 יחס מסוים של אמיץ: מדיה, כמו גם חילופי מוגבלת של אוויר עם אווירה ^9. דרישות של תנאי סביבה מיוחדים יכול להיות קשור לעובדה מ ' שחפת היא הפתוגן האנושי מחייבים ולכן יש להתאים לסביבות רקמות. בפרסום זה אנו מדגימים שיטות culturing מ ' שחפתbiofilms בבקבוק בתבנית של 12 גם צלחת, שהוא נוח מחקרים בקטריולוגי כמו גם גנטיים. תיארנו פרוטוקול זן מוחלש של מ ' שחפת, mc ² 7000, עם המחיקה בשני לוקוסים, panCD ו RD1, כי הם קריטיים עבור vivo בצמיחה של ⁹ הפתוגן. זן זה בטוח לשימוש על מנת להבין את הביולוגיה הבסיסית של הפתוגן שחפת וכך למנוע את הדרישה של מתקן BSL-3 יקר הכלה BSL-2. השיטה ניתן להרחיב, עם שינויים מתאימים בתקשורת, לגדול biofilm של מינים אחרים mycobacterial culturable.

באופן כללי, פרוטוקול אחיד של biofilms culturing mycobacterial יעזור לחוקרים המעוניינים ללמוד את המאפיינים הבסיסיים של mycobacteria וגמיש. בנוסף, שיטה ברורה ותמציתית של biofilms mycobacterial גדל גם יעזור Inv קליני התרופותestigators כדי לבחון את היעילות של התרופה הפוטנציאלית.

Protocol

1. Biofilms גידול של מ ' שחפת בבקבוק 250 מ"ל בורג כתרים

1. הכנה מדיה: ממיסים 0.5g של KH ₂ PO _4, 0.5g של MgSO _4, 4G של Asparagine-L, 2G של חומצת לימון, 0.05g של אמוניום ציטראט Ferric, 60mL של גליצרול ב 900mL של מים. להתאים את ה-pH 7.0 ל עם NaOH. , החיטוי קריר זמן קצר לפני תחילת הניסוי, להוסיף ZnSO סטרילית ₄ לריכוז הסופי של 0.1% w / נ מאז 7000 הוא mc ² auxotroph pantothenate זן זה דורש גם חומצה פנטותנית ב 10μg/mL הריכוז הסופי.

הערה: זהו ההרכב רמת התקשורת של Sauton המשמשים מ שחפת. עם זאת, אם נדרש מדיה מיוחדים אחרים יכולים לשמש גם עבור מינים mycobacterial אחרים.

2. הכנה Inoculums: לגדול מ ' שחפת 7H9OADC עם 0.05% Tween-80 למשך שבוע, או ₆₀₀ OD של 0.7-1.0. מ"קlture ניתן להשתמש ישירות על דילול 1:100 הבידוד.
3. לוותר 25mL של התקשורת Sauton כדי בקבוק 250 מ"ל קלקר כתרים בורג (Corning). הוסף 250μl של הבידוד עד בינוני, מכסה את הבקבוק בחוזקה ומניחים אותו ללא הפרעה humidified 37 ° C החממה למשך 3 שבועות. שים את הבקבוק פעם אחת בכל יום על מנת להבטיח כי יש זיהום לא.
4. בסוף השבוע השלישי, לשחרר את הפקק של הבקבוק כדי לאפשר צמיחה נוספת של מ ' שחפת על הממשק. אם הכובע לא משוחרר בשלב זה אז ריכוז חמצן מספיק במיכל יהיה לעכב צמיחה נוספת של חיידקים.

2. גידול של מ ' שחפת biofilms ב 12 גם צלחות

1. מכינים את התקשורת הבידוד של mc ² 7000, כמתואר בסעיפים A1 ו-A2.
2. מערבבים 60mL של התקשורת עם 600μl של הבידוד. לוותר על 4.5mL של התערובת לתוך כל אחד גם הצלחת. מכסים את הצלחת עם מכסה. לעטוף את הצלחת כמה פעמים עם parafilm. דגירה צלחת ללא הפרעה חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שבועות.

3. קביעת תדירות persisters סמים סובלניים בתוך: מ ' שחפת biofilms

1. לגדול מ biofilms שחפת בתבנית של 12 גם כמתואר בסעיף ב 'זה ייקח כולל של כ 5-שבועות.
2. לאחר biofilms הם התבגר (אחרי 5 שבועות של דגירה) להזריק בחירתך אנטיביוטיקה בריכוז הרצוי לתוך התקשורת שמתחת biofilms באמצעות microtip ב פיפטה.

הערה: היקף בתקשורת מתחת pellicles מפחית בכ 3.0mL. אז החוקרים צריכים בהתאם לחשב את כמות התרופה.

3. לערבל את הצלחת בעדינות כך אנטיביוטיקה היא מתפזרת היטב במדיום. לקבלת תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, להזריק antibiotic ארבע בארות. במקביל, להזריק באותו נפח של הממס שבו אנטיביוטיקה פורקה בארבע בארות אחרות, ולהשאיר האחרונים ארבע בארות של צלחת ללא שינוי. מכסים את הצלחת עם מכסה ולשים שכבות חדשות של parafilm סביב הצלחת. מניחים אותו בחזרה חממה פרק הזמן הרצוי.
4. בסוף הדגירה, פתח את צלחת ולהוסיף Tween-80 לריכוז הסופי של 0.1% (נפח / נפח) בכל אחת הבארות. לערבל את כל הצלחת בעדינות לפיזור אחיד של חומר ניקוי. דגירה צלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מערבבים היטב את התוכן של כל אחד מהם מספר פעמים פיפטה כך התוכן ניתן להעביר באופן אחיד על צינור חרוטי 15 מ"ל.
5. לסובב את התוכן של הצינור על 4000rpm במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ לשטוף טרי (PBS עם גליצרול 10% ו 0.05% tween-80). חזור על כביסה שלוש פעמים. Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ הכביסה. שמור את זה על כיסא הנדנדה של overnight ב 4 ° C.

הערה: למרות הטמפרטורה הנמוכה פותחה במקור עבור מ 'smegmatis (כדי למזער את צמיחתה במהלך פיזור) ושימשו שחפת מ' גם כן, מינים הגדלים איטי יכול כנראה להיות התנדנד בטמפרטורת החדר מבלי להשפיע על התוצאה. נדנדה בטמפרטורת החדר יכול להיות הכרחי אם עובדים במתקן BSL-3.

6. להכין מזרק סטרילי מצויד microtip (2-200μl) על ידי חיתוך קצה הרחב לגודל מתאים, הולם אותו מזרק, וכרך אותו עם parafilm. להעביר את כל התוכן של הצינור באמצעות מזרק קצה מצויד ולאסוף בעוד כמה צינורות 15 מ"ל טריים. חזור על שלב 5 עד 6 פעמים עד שאתה רואה ההשעיה הומוגנית למדי.
7. הכינו סדרה של דילולים ההשעיה ואת הצלחת דילולים על הצלחת 7H11OADC כדי לקבוע את מספר מושבות קיימא ב היטב כל אחד מהם. דגירה צלחות במשך שלושה שבועות 37 ° C חממה. קבע את frequenלסי של persisters באוכלוסייה biofilm על ידי חישוב היחס בין מספר המושבות שהתקבלו טיפול אנטיביוטי לאלו שהושגו על צלחות שטופלו ממס.

4. נציג תוצאות

כאשר בתרבית בבקבוק, גידול של מ ' שחפת ניתן לראות בבסיס הבקבוק עד סוף השבוע הראשון. בסוף השבוע השני, צמיחה של חיידקים בלתי סדיר על ממשק האוויר התקשורת ניתן לראות, אם כי הצמיחה בממשק אוויר מדיה גלוי באופן עקבי בסוף השבוע השלישי (איור 1 א). בשלב זה החיבור של החיידקים לדופן המיכל הוא ציין גם. מנקודה זו ואילך הצמיחה של התרבות מתרחשת בעיקר על ממשק האוויר בתקשורת. נוזלים מתחת לפני השטח הצמיחה הוא ברור. בדרך כלל, מבנה מתבגר עד סוף השבוע 5 (איור 1 ב). אם הדגירה ממושכת, מבנים יתחילו לשקוע בתחתית המיכל. מעניין לגלותהידוק המכסה עד סוף השבוע השלישי הוא שלב חשוב בתהליך, ומסיבות לא ידועות בקבוק רופף הכתיר מפגרים באופן משמעותי את תחילת הצמיחה בממשק ^9.

בתבנית של 12 היטב, biofilm חזק על הממשק אוויר התקשורת נתפסת בכל אחת הבארות בתום חמישה שבועות (איור 2 א). אם הצלחות אינן לכיסוי מלא ואז הצמיחה biofilm ההפרש הוא ציין. במקרה הגרוע ביותר, משמעותית אידוי התקשורת יכול לעכב את הצמיחה של החיידקים (איור 2 ב). לכן, גלישת הצלחת יש גם כדי למנוע אידוי וגם כדי לספק סביבה ליצירת biofilm (ראה סעיף קודם).

מספר החיידקים קיימא biofilms שנקבעו עם טכניקה זו היא לשחזור למדי. תגובת מ ' שחפת biofilms משתנה אופיו של אנטיביוטיקה. על אנטיביוטיקה bactericidal כגון ריפאמפיצין, אובדן הכדאיות כדלקמן bipha כך במקור מגמה ^9. ירידה מהירה של כדאיות במשך שלושה עד ארבעה ימים הראשונים ואחריהם שלב מתמשך שבו אחוז קטן מהאוכלוסייה נשאר הסרבן לחלוטין לאנטיביוטיקה ללא קשר ריכוז של אנטיביוטיקה או זמן החשיפה. איור 3 מציג את מספר החיידקים קיימא biofilms בוגרים לאחר חשיפה 7 ימים כדי 50μg/mL (50 פעמים גבוה יותר מאשר MIC) של ריפאמפיצין.

איור 1 א. הופעה מוקדמת של מ ' שחפת החיידקים בממשק אוויר התקשורת של החיידקים לאחר 3 שבועות של דגירה.

איור 1 ב. התבגר biofilms של מ ' שחפת בממשק אוויר התקשורת לאחר חמישה שבועות של דגירה.

820/3820fig2A.jpg "/>
איור 2 א. 5 שבועות biofilms הישנים של מ ' שחפת גדל בתבנית של 12 גם כן.

איור 2 ב. ניסיון כושל לגדל יג biofilms שחפת בצלחת 12 גם בלי parafilm.

איור 3. העלילה נציג מראה את שכיחות persisters סמים סובלניים בתוך: מ ' שחפת biofilms גדל בתבנית של 12 היטב חשופים 50μg/mL של ריפאמפיצין במשך שבעה ימים.

Discussion

שחפת (TB), נגרמת על ידי זיהום של Mycobacterium שחפת, נותר איום משמעותי על בריאות הציבור העולמית. כמעט שליש מאוכלוסיית העולם מוערך להידבק asymptomatically ידי פתוגן, כ -9 מיליון מקרים חדשים מופיעים במרפאה כל שנה עם תסמינים של שחפת פעילה על 1,700,000 מתים מזיהום מדי שנה ^11. נטל עצום ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	VWR international	Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles	Fisher Scientific	03-374-300
12-well tissue culture plate	VWR international	62406-165
50-mL conical tubes	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Chromatographic refrigerator	VWR international	55702-520
petri dish	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasic)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
citric acid	Sigma-Aldrich	C1857-100G
ferric ammonium citrate	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glycerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-pantothenic acid	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC Enrichment	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
250mL storage bottle	Corning	430281
12 well plates	Falcon BD	353043
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
methanol	JT Baker	9070-05
10mlLsyringe	BD Biosciences	301604
1-200μL pipet tips	VWR international	89079-458
parafilm M	VWR international	PM-996
15mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic)	Sigma-Aldrich	S0876-500G