JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

זוהי שיטה מהירה ומקיפה של immunophenotyping מיאלואידית תאים מדכאי נגזרות (MDSC) ומעשירה GR-1 + Leukocytes מ spleens עכבר. שיטה זו משתמשת cytometry זרימה נייד AutoMACS מיון להעשיר קיימא עבור GR-1 + Leukocytes שקדמו FACS המיון של MDSC לשימוש In vivo ו במבחנה מבחני.

Abstract

MDSC הם אוכלוסיה הטרוגנית של מקרופאגים בוגרים, אלא תאים דנדריטים ו גרנולוציטים המצטברים באיברים הלימפה במצבים פתולוגיים כולל זיהום טפילי דלקת, טראומה, השתל נגד מארח מחלות, סוכרת וסרטן 1-7. בעכברים, MDSC אקספרס Mac-1 (CD11b) ו Gr-1 (Ly6G ו Ly6C) אנטיגנים פני 7. חשוב לציין כי MDSC נלמדים גם בגידול נושאות צבאות שונים שם הם התרחבו באופן משמעותי ולדכא אנטי סרטניים התגובה החיסונית לעומת עמיתיהם נאיביות 7-10. עם זאת, בהתאם למצב פתולוגי, יש subpopulations שונים של MDSC עם מנגנוני ויעדים שונים של דיכוי 11,12. לכן, שיטות יעילות לבודד אוכלוסיות MDSC קיימא חשובים הבהרת המנגנונים המולקולריים השונים של דיכוי במבחנה in vivo.

לאחרונה, ה-Ghansah הקבוצה דיווחה על הרחבת MDSC ב מודל הלבלב Murine סרטן. MDSC הגידול נושאת שלנו להציג הפסד של הומאוסטזיס והגדילה את הפונקציה מדכאים לעומת MDSC תמים 13. אחוזי MDSC באופן משמעותי פחות תאים הלימפה של עכברים תמימים לעומת הגידול נושאת. זוהי אזהרה גדול, אשר לעתים קרובות מעכבת ניתוחים השוואתיים מדויקים של MDSC אלה. לכן, להעשיר GR-1 + leukocytes מעכברים תמימים לפני מיון Fluorescence Cell הופעל (FACS) משפר, הכדאיות טוהר מפחית באופן משמעותי את זמן המיון. עם זאת, העשרת GR-1 + leukocytes מן הגידול נושאות עכברים היא אופציונלית כמו אלה בשפע עבור FACS מהירים מיון. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה היעילה ביותר של immunophenotyping MDSC ומעשירה GR-1 + leukocytes מן spleens של עכברים תמימים למיון MDSC מבעוד מועד. Immunocompetent עכברים C57BL / 6, מחוסן עם Murine Panc02 לספירהlls מתחת לעור ואילו עכברים תמימים לקבל 1XPBS. כ 30 ימים לפרסם חיסון; spleens נקצרים ומעובדים מתא בודד השעיות באמצעות תא דיסוציאציה מסננת. Splenocytes הן מכן כדורית דם אדומה (RBC) lysed ו aliquot של leukocytes אלה מוכתמות באמצעות fluorochrome-מצומדות נוגדנים נגד Mac-1 ו-GR-1 לאחוזים immunophenotype MDSC באמצעות cytometry הזרימה. בניסוי מקביל, leukocytes שלמים מעכברים נאיביות מגואלות ניאון מצומדות GR-1 נוגדנים, מודגרות עם PE-microbeads נבחרים באופן חיובי באמצעות מיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (autoMACS) Pro מפריד. לאחר מכן, aliquot של GR-1 + leukocytes מגואלות Mac-1 הנוגדנים לזהות את הגידול באחוזים MDSC באמצעות cytometry הזרימה. עכשיו, אלה + Gr1 leukocytes מועשר מוכנים FACS המיון של MDSC לשימוש בניתוחים השוואתיים (נאיבי לעומת הגידול נושאת) ב in vivo ו in vitro

Protocol

לפני שמתחילים, להכין את הפתרונות הבאים:

3 מכתים% Media (SM):

עוברי -3% בסרום שור (FBS) ב 1X מאגר מלוחים פוספט (PBS)

מאגר MACS (MB):

- 0.5% אלבומין סרום מ שור (BSA) ב 1XPBS

1. קציר spleens של עכברים

  1. תת עורי להזריק 6-8 בשבוע של C57BL גיל / 6 עכברים (הרלן) עם 1.5 x 10 5 Murine Panc02 תאים תלויה 100 μl 1x PBS (גידול נושאת; TB). עכברים שליטה (נאיבי) מקבלים 100 1XPBS μl.
  2. כ 4 שבועות הזרקת הודעה, להרדים עכברים ידי מחנק פחמן דו חמצני.
  3. Spleens קציר מעכברים ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים ושוקלים באמצעות איזון. Spleens מקום ב נפרד, שכותרתו 50 מ"ל צינורות חרוטי המכילים 1 X PBS.

2. צור מתא בודד Suspension של Leukocytes מ spleens

הנהלים כל יש לבצע בסביבה סטרילית מתחת למכסה המנוע בטיחות ביולוגית תאים ונוגדנים שמרו על הקרח.

  1. להרכיב את התא דיסוציאציה מסננת ידי הוספת מסך רשת לתוך פתח הספל לתחתית. לאחר מכן, הכנס את הטבעת שמירה לאזור הליכי עם הצד מחוררת ולשימוש המפתח טבעת להדק את הטבעת שמירה, ובכך מחזיק את המסך במקום. מניחים את המסננת התאספו בצלחת פטרי שמכילה 10 מ"ל 1 X PBS.
  2. Spleens ביליארד וזכוכית ועלי שימוש לטחון spleens על המסך רשת של תאים דיסוציאציה מסננת לתוך צלחת פטרי. חזור על הפעולה עבור כל קבוצת טיפול של עכברים.
  3. תא ההשעיה מסנן לתוך צינור מ"ל 50 חרוטי באמצעות תא 70 מיקרומטר מסננת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית. סרכזת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות.
  4. הסר supernatant ו resuspend גלולה של 5 מ"ל 1 חיץ RBC x תמוגה לכל הטחול. Pipet למעלה ולמטה במרץ. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לעצור את התגובה על ידי הוספת 20 מ"ל של 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ. סרכזת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות.
  5. הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 20 מ"ל סטרילי 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ.
  6. ספירת תאים באמצעות trypan כחול hemacytometer ו resuspend בריכוז הרצוי SM 3% עד 50 μl שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 -7 תאים / מ"ל - 2x10 7 תאים / מ"ל).

3. על פני קרום התא מכתים / Immunophenotyping של MDSC באמצעות cytometry זרימה

  1. לתייג את הבארות של צלחת 96-V גם למטה לבקרה דגימות הניסוי וכתמים בודדים עבור פקדים פיצויים (לא כתם, NS, Mac-1-FITC, Gr-1-APC ו DAPI).
  2. הוסף 5x10 5-1x10 6 תאים שווה ערך ל μl 50 / היטב splenocytes לבארות שלהם בצלחת V-96-התחתונה גם כן. סרכזתצלחת ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות.
  3. הכן "מיקס מאסטר" (מ"מ) של עכבר BD Fc בלוק (אנטי עכבר עכברוש CD16/32 נוגדן חד שבטי) מדולל SM 3%, בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל על הקרח. כנקודת מוצא, השתמש 1 מיקרוגרם Fc בלוק ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לפי היטב.
  4. מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב על ידי צלחת היפוך במהירות מצד אל צד, על מיכל הפסולת או כיור ללא הפרעה של כדורי סלולריים.
  5. וורטקס, בקצרה סרכזת MM Fc חסום למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לכל כדורי בצלחת V-96-התחתונה גם כן. מערבבים היטב בעדינות pipetting למעלה ולמטה, והשאיר הדגימות בבארות שלהם. דגירה הצלחת במשך 15 דקות בחושך על הקרח. סרכזת צלחת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות.
  6. הכן "מיקס מאסטר" (מ"מ) של fluorochrome-מצומדות נוגדנים בדילול ב SM 3% בצינור microcentrifuge 1.5ml על הקרח, בעוד דגימות דגירה עם בלוק FC. נוגדנים יש טיטרציהכדי לקבוע דילולים אופטימליים מכתים ההליכים. כנקודת מוצא, לשלב דילול של 1:25 Mac-1-FITC ו 1:20 דילול של Gr-1-APC ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לדגימה גם כן.
  7. מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל.
  8. וורטקס, בקצרה סרכזת מ"מ ניאון מצומדות נוגדנים צביעה למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לשלוט כדורי ניסיוניים. מערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. עבור יחיד כתם פיצויים, להוסיף דילול של 1:25 Mac-1-FITC, 1:20 דילול של Gr-1-APC ו 75 ng / mL של DAPI, ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 דולר גם לבארות, בהתאמה. הוסף 50 μl SM 3% ל בלא כתם היטב (לא הכתם). מערבבים היטב דגירה תאים 96-גם צלחת V-התחתונה למשך 30 דקות בחושך על הקרח.
  9. FACS תווית צינורות (5 מ"ל, 12 מ"מ x 75 מ"מ קלקר עגולים צינורות למטה) כדי מתאימות גם כל צלחת גם 96-V-התחתונה. הוסף 200 μl SM 3% לכל אחד FACSצינור.
  10. סרכזת צלחת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות ולהסיר supernatants. לשטוף את כדורי על ידי הוספת 100 SM 3% μl לכל גלולה ומערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. סרכזת צלחת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. חזור על שלב לשטוף שוב.
  11. מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל. Resuspend כל גלולה ב SM 100 3% μl ומערבבים היטב.
  12. העברת 100 μl גלולה resuspended מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב צינור FACS שכותרתו בהתאמה שלהם.
  13. לפני ניתוח תזרים cytometry, להוסיף 75 ng / ml DAPI לשלוט דגימות ניסויים ובקרה DAPI אחת פיצוי הכתם.
  14. בצע cytometric זרימת נתונים רכישת אחוזי MDSC. לבצע באמצעות פיצוי שלילי (אין שליטה כתם) ואת בקרות חיוביות בודדות. הגדר את העלילה נקודה המציג פיזור קדימה (FSC) לעומת הצד (SSC) בהיקף התחבר כדי אוכלוסיות של ליקוציטעניין ניתן לזהות. צייר שער גדול על כל leukocytes, למעט פסולת גושים עם קדימה הנמוך ביותר ולפזר בצד. מהשער אב זה, ליצור עלילה נקודה חדשה המציגה SSC לעומת DAPI והשער על DAPI-(Live) תאים. בחר אוכלוסיה מגודרת החדש וליצור עלילה נקודה המציג Mac-1 לעומת GR-1 ושער חיובית כפולה על שלך (Mac-1 + GR-1 +) MDSC.

4. העשרה המגנטי של GR-1 + Leukocytes

  1. 1x10 aliquot 7 leukocytes בלא כתם הנותרים לתוך צינורות FACS שכותרתו כראוי צנטריפוגות ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות.
  2. הכן MM של נוגדנים Gr-1-PE בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 1:10 של נוגדנים Gr-1-PE ב -50 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך.
  3. הוסף 2 מ"ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant.
  4. הכן מ"מ אנטי-PE microbeads בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 01:04 נגד PE microbeads ב 200 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך.
  5. הוסף 2 מ"ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 3 מ"ל של SB. לסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש, שכותרתו 50 מ"ל חרוטית.
  6. להכין ראש אוטומטי MACS מפריד Pro. מילוי בקבוקים עם כל הפתרונות המתאימים ולרוקן בקבוק פסולת, במידת הצורך. הפעל על מכשיר ולבחון מעמדה של נוזלים מכלי ועמודה (ים) לאחר אתחול. כל הסמלים צריך להיות ירוק. בתפריט, בחר "הפרדה" מן העליון שורת התפריטים ואחריו "לשטוף עכשיו" משורת התפריטים נמוכה יותר. בחר "לשטוף" מן האפשרות מוקפץ ואחריו "הפעלה" כדי להתחיל את תהליך תחול. לאחר תהליך תחול הושלמה בהצלחה, המכשיר לאחר מכן להציג כי הוא "מוכן ההפרדה" תחת תפריט מצב.
  7. בחר צינור מתאים מדף מצונן עבור גדלים צינור ומקום 50 מ"ל צינור חרוטי עם תאים שכותרתו מגנטית ברציפות, 50 מ"ל צינור חרוטי עבור אוסף חלק שלילי ב שורה 15 צינור חרוטי מ"ל לאיסוף חלק חיובי בשורה ג
  8. בחר "POSSEL_S" הפרדת תאים תוכנית סלקציה חיובית של תאים היעד המוגדרים במצב רגיש דגימות. תאים היעד שכותרתו מגנטית נשמרות על עמודה האוטומטים, התאים שהוסרו מהן תוויות משתחררים לתוך צינור חלק שלילית האוסף ב 'בשורה על הכחשה אוטומטי של המגנט, התאים היעד שכותרתו ישוחררו לתוך צינור איסוף חיובי C שורה של הצינור מתלה.

> 5. לאחר מיון ניתוח GR-1 + Leukocytes מועשר

  1. לספר GR-1 + ו-GR-1 - שברים באמצעות trypan כחול hemacytometer. תאים Resuspend בריכוז הרצוי בינוני מכתים 3%, כך 50 μl הוא שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 7 תאים / מ"ל - 2x10 7 תאים / מ"ל) ולהעביר 50 μl לצינורות FACS שכותרתו בהתאם.
  2. הכן מ"מ Mac-1 בלבד, בדילול 1:25 ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 לדגימה. כתם תאים ולהכין פיצויים כתם יחיד של GR-PE, Mac-1 ו FITC DAPI לניתוח cytometry הזרימה. הוספת 200 SM 3% μl וצבע DAPI הכדאיות כפי שתואר לעיל.
  3. ביצוע הרכישה cytometric זרימת נתונים כדי לקבוע GR-1 + ו-GR-1 - אחוזים וכן גם להשוות את אחוזי MDSC העשרת לפני ואחרי-autoMACS.

6. נציג תוצאות

כאן אנו מראים R תוצאות epresentative עבור העשרת autoMACS של GR-1 + leukocytes מ, spleens אספו נאיביות עבור FACS הבאים המיון של MDSC (איור 1). 1x10 6 leukocytes נאיביות הוכתמו Mac-1-FITC ו Gr-1-APC הנוגדנים לזהות אחוזי MDSC באמצעות מכשיר LSRII BD, לפני מיון autoMACS. 1x10 7 leukocytes הנאיביים היו מוכתמים מכן עם אנטי GR-1-PE נוגדנים PE-microbeads עבור העשרת GR-1 + leukocytes באמצעות מפריד Pro autoMACS. לאחר autoMACS העשרה, GR-1 אחוזים ב GR-1 + ו-GR-1 - שברים אסף הוערכו באמצעות cytometry הזרימה. 1x10 6 GR-1 + leukocytes הוסרו מוכתם נוגדנים Mac-1-FITC לנתח ולהשוות אחוזים של MDSC מועשר, אספו leukocytes תמימים שאינם מועשר, נקווה הגידול נושאות leukocytes ידי cytometry הזרימה.

fig1.jpg "/>
1. איור AutoMACS העשרת נאיביות GR-1 + leukocytes עבור FACS MDSC מיון. Spleens נקצרו מעכברים הלבלב הגידול נושאות ותמים מעובד לתוך תא יחיד המתלים. Cytometry זרימה ניתוח של השטח leukocytes נאיבי מוכתם Mac-1 ו-GR-1 ניאון מצומדות נוגדנים, לפני העשרה autoMACS (א '). Cytometry זרימה ניתוח GR-1 + (ב) ו - GR-1 - (ג) שברים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leuckocytes נאיביות אספו מוכתמים GR-1-PE נוגדנים נגד PE microbeads. Cytometry זרימה ניתוח MDSC ו Gr-1 + אחוזים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leukocytes נאיביות אספו (ד ') לעומת הלא מועשר leukocytes אספו מן הגידול נושאות עכברים (ה) (עכברים נאיביות, N = 5 ; הגידול נושאות עכברים, N = 3). MDSC ו GR-1 אחוזים הם מגודרת בחלקות גובה ו היסטוגרמות מייצגים.

Discussion

זוהי שיטה מפורטת עיבוד immunophentyping אוכלוסיות MDSC כי הוא ישים הלימפה ברקמות שונות במודלים של בעלי חיים שונים. בפרט, להעשרת autoMACS יכול לשמש לבידוד של אוכלוסיות ליקוציט שונים, כולל דלדול-1 Gr של splenocytes 4, טיהור תת מיאלואידית מ splenocytes ובלוטות לימפה 5, בידוד של נויטרופי...

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgements

אנו מכירים cytometry זרימה USF Core Facility. ברצוננו להודות לד"ר דניס קופר על שיתוף משאבים. אנו רוצים גם להודות מאיה כהן, לורה פנדלטון ודיאנה לאטור על עזרתם בהקמת והסרטה של ​​סרט זה. NN נתמך על ידי גשר NSF FG-LSAMP כדי אחוות דוקטורט HRD # 0929435. עבודה זו מומנה על ידי האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מרכז המחקר גרנט # סרטן 93-032-13/Moffitt הוענק TG.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
מגיב החברה קטלוג # תגובות
פוספט 1X שנאגרו מלוחים Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca 2 + / 2 + Mg / פנול אדום ללא
אלבומין סרום מ שור (BSA) Sigma-Aldrich A7906 בואו BSA לפזר ללא הפרעה PBS, סביבה סטרילית
העובר שור סרום (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI מחממים מומת, סביבה סטרילית
אנטי עכבר חולדה CD16/32 נוגדנים חד שבטיים (FC בלוק) BD Biosciences 553142 סביבה סטרילית
נגד העכבר CD11b (Mac-1) FITC eBiosciences 11-0112 סטריליסביבה
נגד העכבר Ly6G (גרם-1) APC eBiosciences 17-5931 סביבה סטרילית
נגד העכבר Ly6G (גרם-1) PE eBiosciences 12-5931 סביבה סטרילית
DAPI Invitrogen D1306 דילול הסביבה סידורי סטרילי
תא דיסוציאציה Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT החיטוי לפני השימוש
70 מיקרומטר מסננת BD Biosciences 352350 סביבה סטרילית
1X RBC מאגר תמוגה eBiosciences 00-4333-57 חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש, סביבה סטרילית
פטרי מנות פישר סיינטיפיק 08-757-12 סביבה סטרילית
50 מ"ל קוןical צינורות Thermo Scientific 339652 סביבה סטרילית
5 מ"ל 12X75mm עגולים קלקר בתחתית צינורות BD Biosciences 352054 סביבה סטרילית, המכונה צינורות FACS
96 היטב V-התחתונה צלחות קורנינג 3897 סביבה סטרילית
Trypan כחול Cellgro 25-900-CI סביבה סטרילית
PE microbeads Miltenyi BIOTEC 130-048-801 סביבה סטרילית
AutoMACS מפריד Pro Miltenyi BIOTEC 130-092-545
AutoMACS עמודות Miltenyi BIOTEC 130-021-101
AutoMACS הפעלת מאגר Miltenyi BIOTEC 130-091-221

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

64MDSCImmunophenotypingcytometryAutoMACSFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved