ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

Summary

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

Abstract

חוט השדרה העובר מורכב רכיבה על אופניים ובתאים עצביים שיוצרים אחוז גדול של תאים עצביים ועל גליה של מערכת העצבים המרכזית (CNS). למרות הרבה ידוע על המנגנונים המולקולריים דפוס חוט השדרה לעורר בידול העצבית ^{1, 2,} חסרה הבנה עמוקה של האירועים הראשונים ברמה של התנהגות התא. זה קריטי, וכך ללמוד את ההתנהגות של אבות עצביים בזמן אמת כפי שהם עוברים neurogenesis.

בשנת הדמיה בעבר בזמן אמת, של רקמה עוברית בשלב מוקדם הייתה מוגבלת על ידי כדאיות התא / רקמות תרבות, כמו גם את ההשפעות phototoxic של דימות פלואורסצנטי. כאן אנו מציגים assay חדשנית רקמות הדמיה כגון על פרקי זמן ארוכים, תוך ניצול לשעבר רומן vivo פרוסת התרבות פרוטוקול שדה רחב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). גישה זו משיגה ארוך טווח זמן לשגות ניטור של העוברית של האפרוחpinal אב טבורי תאים עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן.

זה assay ניתן לשנות את התמונה בטווח של רקמות עובריים ^{3, 4} נוסף על התצפית של התנהגויות הסלולר משנה הסלולר, פיתוח של הרומן וכתבים רגישות גבוהה עבור פעילות הגן (למשל, Notch איתות ⁵⁾ עושה את זה assay כלי רב עוצמה שבאמצעותו אפשר להבין כיצד איתות מסדיר התנהגות התא במהלך ההתפתחות העוברית.

Protocol

1. הכנת המנה

1. הכלים המשמשים תרבות פרוסת הם תחתית זכוכית (עם coverslip כבסיס) (מנות WillCo). אלו ממוקמות על רקמת העדשה מנה 6 ס"מ רקמת התרבות לשמור על התחתונה זכוכית נקייה.
2. ביום שלפני הניסוי, הוסף 2 מ"ל 0.1% פולי-L-ליזין פתרון צלחת זכוכית דגירה תחתית ועל 5min בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את פולי-L-ליזין לצפות את תחתית הכוס.
3. הסרה של פולי-L-ליזין פתרון ולשטוף שלוש פעמים במים deionised ולאחר מכן פעם אתנול 70%.
4. להשאיר לייבוש למשך הלילה. המנות ניתן גם לייבש בעדינות על ידי חימום במיקרוגל על ​​צריכת חשמל נמוכה של 30-45 שניות.

2. העובר electroporation

1. דגירה ביצים על 37 ° C עד המבורגר, המילטון (HH) שלב 10 (~~~HEAD=NNS 36 שעות) (או בשלב אחר הרצוי).
2. לפני שמתחילים להכין מחטים זכוכית (אנו משתמשים לוהטים / דגם בראון p87 חולץ microcapillary) ולשבור את קצה needlדואר באמצעות מלקחיים עדינים תחת מיקרוסקופ לנתח. בסופו של המחט צריך להיות חד מספיק כדי לחדור את העובר בזמן לא להיות צר כך שהוא מעכב הזרקה של פתרון ה-DNA.
3. חלון ביצים אלקטרודות במקום (5 מ"מ זה מזה) בכל צד של העובר
4. להזריק DNA (~ 0.025-0.5 מיקרוגרם / μl במים deionised בצבע עם כמות קטנה של ירוק מהיר) לתוך הצינור העצבי.
5. החל הנוכחי - 12-17 V 3 פעמים, אורך הפולס 50ms עם 950 מילישניות בין הפולסים.
6. אנו משתמשים בריכוזים נמוכים של ה-DNA ומתחים electroporation נמוכים כדי להשיג ביטוי פסיפס, כדי שנוכל לעקוב אחר תאים בודדים.
7. לכסות את חלון קליפת הביצה עם cellotape ולוודא שהוא חתום.
8. אפשר לשחזר עוברים על 3-4 שעות או לילה בשעה 37 ° C.

3. קולגן והתרבות Slice הכנה בינונית

1. להכין תערובת קולגן תרבות בינונית פרוסה כשעה לפני חיתוך.
2. ל -300 לא μlype 1 קולגן להוסיף 100 הפתרון μl 0.1% חומצה אצטית ו - 100 μl 5 x L15 בינוני. מערבולת היטב לאחר כל הוספה. הפתרון צריך להפוך צהוב.
3. עכשיו להוסיף 15-20 נתרן ביקרבונט μl 7.5% ו מערבולת ביסודיות. הפתרון צריך להיות ורוד במקצת, את עוצמת הקול של סודיום ביקרבונט נדרש לכך עשויים להיות שונים. שמור על הקרח ולעשות את טרי בכל פעם.
4. בינוני עד 10 מ"ל neurobasal להוסיף תוסף B-27 ו Glutamax, לריכוז x 1 סופי 10 הפתרון גנטמיצין μl.
5. בינוני מקום 37 ° C חממה שנאגרו עם 5% CO _2. להשאיר את החלק העליון של המיכל רופף כדי לאפשר לו לאזן עם ₂ CO.

4. פרוסת תרבות

1. הסר עוברים מן הביצה ולשטוף במדיום L15.
2. מקום בצלחת רקמת התרבות בשכבת sylgard בחלק התחתון ולהדק אותם דרך חוץ עובריים ממברנות סביב כך הם מתוחים.
3. באמצעות מיקרופוןroknife, העובר פרוסת וישרים ככל האפשר דרך האזור של עניין. על חוט השדרה, פרוסות צריך להיות בין 1-2 somites עבים. להשאיר פרוסות המחוברות העובר בזמן שאתה חותך עוברים אחרים כדי שלא לאבד אותם.
4. הכן טיפ 200 micropipette μl ידי ניתוק ~ 1 מ"מ של קצה ו מצרף את זה P2 או P10. הטיפ הזה ישמש כדי להעביר את הפרוסות לצלחת בעמוד השדרה התחתון זכוכית. טיפ 10 μl אינה רחבה מספיק כדי להרים את פרוסות.
5. המעיל הפנימי של קצה עם קולגן על ידי pipetting 1 תמהיל קולגן μl הכין קודם לכן. להשאיר למשך 1-2 דקות ולאחר מכן לשטוף עם המדיום L15. זה ימנע את הרקמה להידבק לחלק הפנימי של קצה.
6. ניתוק פרוסת מעובר באמצעות microknife ולהסיר צלחת באמצעות P2 או P10 מצויד טיפ 200 μl ומוגדרת μl 1. נסו לקחת את כמדיום שפחות.
7. תערובת קולגן ירידה וורטקס 5-8 μl של זה על צלחת פולי-L-ליזין מצופה.
8. Immediaלשים פרוסת tely העובר לתוך קולגן העמדה למקום עם זוג מלקחיים עדינים. פרוסות יש למקם כך את הצד להיות צילמו הוא מיושר עם coverslip. רקמת צריך לדבוק ציפוי פולי-L-ליזין על coverslip.
9. חזור על פעולה זו עד שיהיו לך כמה פרוסות על coverslip. בדרך כלל אנחנו יכולים למקם 6-9 פרוסות על צלחת אחת.
10. ברגע שכל הפרוסות נמצאים במקום, מכסים את הצלחת ולאפשר קולגן להגדיר במשך 20 דקות. כמה קולגן להציב המוקדם ייתכן שכבר החלו להתייבש. כדי למנוע זאת להוסיף כמות קטנה של L15 אלה לפני כיסוי.
11. לאחר ההגדרה, בזהירות להוסיף פרוסת 2ml התרבות בינוני כי כבר equilibrated ב CO 5% ₂ ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות. יש להקפיד שלא לעקור את הקולגן coverslip.
12. מקום 37 ° / 5% ₂ CO החממה ולאפשר פרוסות לשחזר לפחות 3 שעות לפני הדמיה. אם אין, לחות במקום צלחת של שנינות תיבת פרספקסקצת חה של נייר לח בפינה אחת.

5. עובריים הדמיה Slices

1. אנו עושים שימוש רחב בתחום Core DeltaVision מיקרוסקופ מצויד בתא WeatherStation הסביבה פרוסות תמונה. החדר נשמר כל הזמן עם מנגנון ₂ CO זלוף על 37 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על הבמה מיקרוסקופ על 5% CO ₂ / אוויר 95%.
2. ההדמיה מתבצעת בדרך כלל תוך שימוש 40 x / 1.30 טבילה NA העדשה נפט תמונות שנתפסו עם HQ2 CoolSnap מקורר מצלמת CCD.
3. Z-קטעים נלכדים כל 1.5 מיקרומטר דרך רקמות 45 מיקרומטר. זמן חשיפה יש לשמור נמוך ככל האפשר. בדרך כלל אנחנו לחשוף עבור 5-50 MS-Z עבור סעיף זה. תמונות נלכדים כל 7 דקות, עד 9 פרוסות וניתן לבקר בו באמצעות נקודה מדויקת של מערכת DeltaVision ביקור לתפקד.

6. נציג תוצאות

זמן לשגות למשל רצף של תאים בעמוד השדרה אבי הואבאיור. 2 א 'ו - סרט המתאים 1. הדמיה החלה על פרוסת חוט השדרה של העובר (בשלב HH 12) יומיים בת. תא זה transfected עם מבנה ה-GFP-להביע αTubulin. בשלב מוקדם זה, ובתאים עצביים עוברים בעיקר אבי, אב חטיבות מצב שבו התאים מתחלקים על מנת ליצור שני תאים נוספים אב אופניים. איור. סרט 2b ו המקביל 2 מראה תא transfected עם GFP-GPI (GPI מעוגנת GFP), המציין את קרום התא. תא זה עובר חלוקה שבהן התהליך הבסיסי מתפצל לשניים בירושה שווה בשווה על ידי לתאי הבת.

באיור 1. תרבות Slice פרוטוקול הדמיה זמן לשגות.

איור 2. תא Behavior במהלך התפתחות תקינה חוט השדרה. (א) מסגרות נבחרים מהסרט 1. תא להביע GFP-טובולין מחלק עם מטוס מחשוף כי היא בניצב למשטח הפסגה (2 שעות 20 דקות), יצירת שני תאים המתחלקים הבת שוב (24 שעות 23 דקות ו 25 שעות 54 דקות). (ב) מסגרות נבחרים מהסרט 2. תא transfected עם GFP-GPI עובר חלוקת התא שבו התהליך הבסיסי הוא מפוצל (חיצים לבנים) ו ירש באותה מידה על ידי לתאי הבת.

סרט 1. לחץ כאן לצפייה בסרט .

סרט 2. לחץ כאן לצפייה בסרט .

Discussion

אנו מציגים כאן assay הרומן זמן לשגות הדמיה כדי לפקח על התנהגות התא בתרבות פרוסת עוברי תרנגולת. Assay זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמת החיים של עד 70 שעות, אף על פי טווחי זמן בין 24-48 שעות קל יותר לתפוס. השימוש אובייקטיבי NA גבוהה נפט בפרקי זמן קצרים יחסית בין מועד נקודות מאפשר רכישת התמונה ברזולוציה גבוהה, כמו גם מאפשר לנו לעקוב אחר התנהגות התא כי לעיתים קרובות מתרחשת במהירות, והוא יכול לפספס בקלות במהלך ההדמיה זמן לשגות קונבנציונאלי באמצעות confocal במיקרוסקופ.

היתרון העיקרי של assay זה הוא היכולת תאים התמונה על פני תקופות זמן ארוכות. שימוש רחב בתחום ⁶ במקום לייזר confocal סריקה מיקרוסקופית ⁷ הוא קריטי זה. מיקרוסקופיה confocal הציע באופן מסורתי מספר יתרונות על פני מיקרוסקופית שדה רחב, כולל היכולת לקחת חלקים אופטיים ולחסל את המידע ישירות המוקד ^{7, אבל השימוש של חריר מובילה לאובדן של אור גלאי 8, למעט כמות משמעותית של מידע, דבר המחייב זמני חשיפה ארוכים יותר. מיקרוסקופית שדה רחב, לעומת זאת, משתמשת בשדה תאורה מלאה לכל עובר אור דרך אובייקטיבית נשלח אל הגלאי. זה בשילוב עם יעילות קוונטית גבוהה מקורר יחד (CCD) מכשיר המצלמה מבטיחה הדמיה עם האות גבוה יחס רעש לעומת מיקרוסקופיה confocal 9, עם זמני חשיפה מהירה מאוד. ביישום שלנו, עלינו על התמונה להגדלה תקופות ארוכות, ערימות 3D שיא, ובסופו של דבר לפתור קטנים, כמעט עקיפה מבנים מוגבלים. למרות מיקרוסקופיה confocal מונע מחוץ מוקד האור להגיע אי פעם גלאי ובכך מפחית באופן משמעותי רקע עבים, בצפיפות, שכותרתו דגימות 7, 8, זה רק משיג יחס שמיש אות לרעש עם כניסת אור רב יותר מאשר רחב מיקרוסקופ שדה 10. עבור sparsel מאוד רגיש לאורדגימות ה-Y שכותרתו כמו פרוסות electroporated שלנו בעמוד השדרה, אם כן, שדה רחב מיקרוסקופיה מבצעת טוב יותר מאשר מיקרוסקופיה confocal. בשילוב עם שחזור תמונה ידי deconvolution, אשר מסיר את המידע מוקד ומשפר לעומת זאת, תחום רחב הוא אז טוב במיוחד לצורך זיהוי של עצמים קטנים, עמומים 11. אמנם לא מתאים לכל ניסוי הדמיה רקמות, גישה זו הייתה יעילה מאוד חי היישום שלנו הדמיה התא.}

הבחירה של חלבון פלואורסצנטי הוא גורם חשוב שיכול להשפיע על הישרדות התא. אנו מוצאים כי את התוצאות הטובות ביותר מתקבלים מבנים המשתמשים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ¹² כסמן. כרגע אנחנו בהערכת מגוון רחב של חלבוני ניאון אדומים, שניתן להשתמש בהם בצורה יעילה עם GFP עבור ערוץ כפול זמן של נסיגות בשילוב. יש מגוון של חלבונים כאלה זמינים ^13. למרות חלבונים רבים הם יציבים כמו fusions בחלבון פלואורסצנטי, חלבונים מסוימים עשויים להיות שניתנו על ידי היתוך לא יציב, וכתוצאה מכך כדאיות התא מופחת. במקרים כאלה, השימוש מבנים המכילים אתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) כדאי להפריד את החלבון עניין של חלבון פלואורסצנטי.

תאריך פרוסות הדמיה בעמוד השדרה, יש להקפיד למזער את החשיפה לאור ניאון. Eyepieces מיקרוסקופ יש להשתמש רק עם אור מסור (brightfield) כדי לאתר את המיקום פרוסות. תמונות פלורסנט תמיד צריך להירכש באמצעות התוכנה באמצעות מיקרוסקופ הזמנים חשיפה מינימלית. אלה צריכים להיות כל הזמן בטווח של 5-50 MS ושימוש במסנני צפיפות ניטרלי יש ניסויים. אמנם זמני חשיפה ארוכים יותר עשויים בתחילה להפיק תמונות ברורות יותר, את ההשפעות של חשיפה phototoxic אור ניאון עלולה לגרום מוות של תאים. מיקרומטר את 5-10 הראשונים של רקמת הקרוב ביותר coverslip אין הדמיה של אזור זה מכיל רקמות שאולי נפגעו במהלךחיתוך.

למרות הדוגמאות שהובאו כאן הן של עוברים electroporated בשלב HH 10 וצילמו 6-7 שעות מאוחר יותר, שיטה זו יכולה לשמש עוברים עד HH בשלב 18. בשלבים מאוחרים יותר, רקמת חוט השדרה הוא הרבה יותר גדול ולכן קשה לחתוך ביד. במקרים אלה, הטבעת עוברים נקודת התכה נמוכה agarose ו חתך עם vibratome עשוי להניב תוצאות טובות יותר. למרות שאנו מציגים זה assay כשיטה תאים הדמיה בחוט השדרה פיתוח, לגישה זו יש גם תמונה שונה לרקמות אחרות עובריים, כולל placodes חושי ^3.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
WillCo תבשיל	WillCo וולס	GWst-3522
פולי-L-ליזין	סיגמא	P8970	0.1% ב טריס
ההתכה של זכוכית בורו נימים	הרווארד מכשירים	GC100-10	1.0mm קוטר חיצוני, קוטר פנימי 0.58mm
אלקטרודות (Genetrodes, ב לג'ימי, L בצורת	BTX	10-001850-01	5 מ"מ מצופה זהב
ECM 830 כיכר גנרטור הדופק	BTX	45-0002	שכן electroopration לג'ימי
מהיר גרין	סיגמא	F7258
הקלד אני קולגן עכברוש	סיגמא	C3857
L-15 בינוני (אבקה)	סיגמא		2.76 גר '/ ל במים מזוקקים פתרון 5x
סודיום ביקרבונט	סיגמא	S8761	7.5% הפתרון
Neurobasal בינוני	Invitrogen	12348-017	ללא פנול אדום
Glutamax	Invitrogen	A1286001	100x פתרון
B-27 תוספת	Invitrogen	17504-044
גנטמיצין	Invitrogen	15710049	10 מ"ג / מ"ל
L15 בינוני (נוזל 1x)	Invitrogen	11415-049
Microknife	Altomed	A10102	15 מעלות שיפוע
נירוסטה סיכות בלי ראש	ווטקינס דונקסטר	E6871	A1 גודל
Sylgard 184 אלסטומר	VWR	634165S
המיקרוסקופ DeltaVision Core מערכת	יישומי Precision
Coolsnap HQ2 מצלמת CCD	Photometrics