ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

Summary

המחקר מתאר את התפתחות במבחנה Electroporation טכניקה המאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים שפתיים rhombic התחתון של עוברי midgestation.

Abstract

השפה היא rhombic neuroepithelium עובריים למוח האחורי ממוקם בצומת שבין הצינור העצבי ואת roofplate של החדר הרביעי (בדיקה ב ^1). השפה rhombic נחלקים השפה rhombic העליון (URL) הכולל rhombomere 1 (R1), ויוצר הנוירונים של המוח הקטן ואת השפתיים rhombic נמוך (LRL), אשר מעלה את מגוון שושלות גזע המוח נוירונים ^2-4. נגזרים LRL כוללים הנוירונים קולי של גרעינים שבלול ושל גרעינים precerebellar המעורבים בוויסות איזון ושליטה מוטורית ^5-8. Neurogenesis מ LRL מתרחשת מעל חלון הזמני גדול שמקיף ימים עובריים (ה) 9.5-16.5 ^{5, 9.} שושלות עצביים שונים לצאת מן LRL כמו תאים postmitotic (או נולדו) במהלך ימים התפתחותיים שונים במהלך חלון זה neurogenic.

Electroporation של מבנים ביטוי גנים יכולה לשמשלתפעל ביטוי גנים אבות LRL ואף עלולים לשנות את גורלם של נוירונים המופקים באזור זה ^10-12. ביטוי גנים שינוי של אבות LRL של העכבר באמצעות ב electroporation ברחם היה מוצלח מאוד עבור מניפולציה שושלות שנולדו ביום עובריים E12.5 או במאוחר ^{10, 12-14.} ב electroporations ברחם לפני E12.5 לא הצליחו בעיקר בשל הקטלניות קשור ניקוב roofplate החדר הרביעי, צעד הכרחי באספקת DNA אקסוגני אשר electroporated אל LRL. עם זאת, רבים שושלות הנגזרות LRL נובעים LRL לפני E12.5 ^9. שושלות אלו שנולדו לפני כן כוללים הנוירונים המרכיבים את הרשתית לרוחב, דמויי יתד? חיצוני, גרעינים olivary הנחות של מערכת precerebellar שבה לתפקד להתחבר כניסות מ חוט השדרה אל קליפת המוח הקטן ^5. על מנת לתפעל ביטוי LRLעוברים מתחת לגיל E12.5, פיתחנו במערכת במבחנה שבה עוברים ממוקמים בתרבות בעקבות electroporation.

מחקר זה מציג שיטה יעילה ואפקטיבית על מניפולציה של ביטוי גנים של אבות LRL ב E11.5. עוברים electroporated עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מונע מן האמרגן החטיבה פעילה רחב reproducibly הביע GFP לאחר 24 שעות של תרבות. היבט חשוב של assay זה הוא ביטוי גנים משתנה רק בגלל הביטוי של הגן אקסוגני ולא בגלל השפעות משניות הנובעות electroporation וטכניקות culturing. נקבע כי ביטוי את דפוסי גנים אנדוגניים להישאר ללא הפרעה עוברים electroporated ותרבותיים. Assay זה יכול להיות מנוצל כדי לשנות את גורלו של תאים המתפתחים מתוך LRL של עוברים מתחת לגיל E12.5 באמצעות הקדמה של פלסמידים עבור ביטוי יתר או להפיל (באמצעות RNAi) של אחר בעדגורמי שעתוק עצביים.

Protocol

1. ההכנות שקדמו electroporation

1. להגביר את ה-DNA על ידי electroporation הכנה מקסי (בפריים זה או Qiagen). הריכוז של ה-DNA צריך להיות מינימום של 1 מ"ג / מ"ל ​​לספיגה יעילה.
2. הסרה של 495 μL של ה-DNA ומערבבים עם μl 5 של גרין מהיר 0.01% ב 1 X PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) בצינור microcentrifuge.

2. העוברית קציר

1. להקים הזדווגויות זמן קבועים של CD-1 בעכברים (הרלן). יש לבדוק את הימצאותם של אטמי בנרתיק ורואים את התאריך תוסף הנרתיק הוא ציין כיום העוברית (E) 0.5. עוברים יהיה לקצור 11 ימים לאחר חזותי תקע (E11.5).
2. מניחים כלים סטריליים באתנול 70%. פנקו את הזרימה למינרית מכסה המנוע עם האור האולטרה סגול של לפחות שעה אחת לפני השימוש. מכסה המנוע ריסוס, מגש לנתח, וגם לנתח היקף עם אתנול 70%. חום לפני 1 X PBS על 37 ° C.
3. על E11.5 להרדים את הנקבה על פי התנאים שאושרו על ידי מכוןועדת לאומיים לטיפול ושימוש בעלי חיים (ICCUA). מניחים במגש לנתח בשכונה זרימה למינרית. לרסס את הבטן של הנקבה עם אתנול 70%.
4. פתח את חלל הצפק ולהצמיד את הקירות למגש לנתח. להוציא את קרני הרחם כך שהיא נשענת בתוך חלל הצפק.
5. בזהירות לחתוך לפתוח את הקיר של קרן הרחם. בעזרת כף 20 מ"מ (כלים מדעיים פיין) בעדינות כדי להוציא את העובר בתוך שק החלמון מן השליה. עוברים מקום לתוך צלחת 100 מ"מ רקמת התרבות prefilled עם 10 מ"ל של סטרילית 1 X PBS שהיה שחומם מראש ב 2.2.
6. חזור על הפעולה עבור כל עוברי הנוכחי.

3. Electroporation של עוברים E11.5 (איור 1)

1. בעזרת כף 20 מ"מ, להעביר את העובר הראשון מנה 100 מ"מ חדש prefilled עם 10 מ"ל של 1XPBS סטריליים שהיה שחומם מראש ל 37 ° C.
2. השתמש מלקחיים 11 ס"מ עם קצה 0.05 0.02 מ"מ x (כלים מדעיים פיין) בזהירות מחדשלהעביר וזורקים שק החלמון.
3. עובר קבוצה, כך בצד הגב שלה פונה כלפי מעלה, כך שהוא דומה הקריקטורה באיור 1 א. השתמש 7 אלקטרודה מ"מ משוטים (הרווארד Apparatus) בעדינות כדי להחזיק את העובר. האלקטרודות יש למקם בכל צד של הצינור העצבי ברמה של החדר למוח האחורי 4. החדר נראה לעין בלתי מזוינת, אך באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה יכול להקל על מיקום ההנעה מדויקת. המיקום של המשוטים הוא קריטי בקביעת האזור שמקבל את ה-DNA electroporated. אם השפה התחתונה rhombic (LRL) למוח האחורי של העוברית הגב הוא הרצוי, משוטים חייב להיות מקום כזה שהם ישירות לאגף את החלק הרחב ביותר של פתיחת החדר 4.
4. השתמש מזרק 1 סמ"ק להכין את ה-DNA פלסמיד מעורבב עם ירוק מהיר 0.01%. 500 μL של התערובת צריך להיות מספיק electroporation של לפחות 8-10 עוברים (ראה 3.5).
5. בעדינות לנקב OV roofplateerlying החדר 4 עם מחט טוברקולין 25 גרם 5/8 מצורף מזרק 1 סמ"ק להזריק את התערובת-DNA צבע לתוך החדר. זריקות מוצלחות מתאפיינות תערובת ה-DNA צבע מילוי המערכת חדרית שלמה (איור 1 ג). כמות תערובת ה-DNA צבע מוזרק בדרך כלל הוא פחות מ 50 μL. הסכומים המדויקים משתנים בין העוברים כמו חלק תערובת נוטה לדלוף לתוך החדר של PBS המקיף את העובר. אמצעי חלופי של מתן תערובת ה-DNA צבע תהיה דרך גישה למערכת חדרית ידי ניקוב וילונות שמעל המוח התיכון. שוב, זריקות מוצלחות מתאפיינות תערובת ה-DNA צבע מילוי המערכת החדר כולו.
6. לספק חמש פולסים מרובעים באמצעות גנרטור חשמלי הדופק (BTX) ו -7 אלקטרודה משוטים מ"מ. כל פעימה הוא 50 V לאורך 5 ms לכל הדופק עם 500 מילישניות בין הדופק בכל. רקמת הקרוב האלקטרודה במטען חיובי תאפשר טאקה את הפלסמיד.

4. תרבות של עוברים

1. בשכונה זרימה למינרית, למלא את בארות החיצוניים של מנה של 12 גם בתרבות עם 2 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת השלימו עם סרום 10% שור עוברית, 5% סוסים סרום, גלוטמין 1%, 1% פניצילין / סטרפטומיצין שהיה שחומם מראש עד 37 ° C. התנאים תרבות הותאמו מ דה דייגו ועמיתיו. ¹⁵
2. ב זרימה למינרית מכסה המנוע עוברים שלוחץ הבטן (מתחת ללב) עם מלקחיים ולהסיר החלק האחורי של העובר. מניחים את החלק הקדמי לאחת הבארות המלאים של מנה של 12 גם בתרבות.
3. חזור על הפעולה עבור כל העוברים. למלא רק את בארות החיצוניים של הצלחת 12-היטב כדי למנוע זיהום של תרבויות.
4. תרבות עוברים ב 37 ° C חממה עם 5% CO _2. ביטוי של הפלסמיד electroporated יש הנצפה בתוך 24 שעות.
5. צריך עוד פעמים תרבות להיות הרצוי, למלא את הבארות מתוך צלחת 12 חדש היטב עם 2 מ"ל שלהתקשורת המשמשים 4.1. בעזרת כף להעביר את העוברים עיקור היטב בצלחת החדש. מניחים בחזרה 37 ° C חממה. תרבות של עד 48 שעות אפשרי.
6. כאשר זמן תרבות הרצוי הוא הגיע, לתקן עוברים לניתוח (ראה להלן).

5. אופן ההכנה של עוברים לניתוח

1. יש לשטוף עוברים 1 X PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור.
2. תקן עוברים לניתוח paraformaldehyde 2% (PFA) ב 1XPBS עבור 2 שעות 4 ° C.
3. יש לשטוף עוברים 1 X PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור.
4. לאזן עוברים סוכרוז 30% ב 1 X PBS לילה ב 4 ° C.
5. שבץ עוברים בטמפרטורה אופטימלית מתחם (אוקטובר) חיתוך באמצעות אמבט קרח יבש / אתנול. עוברים ניתן לאחסן ב -20 ° C.
6. סעיף עוברים על cryostat (לייקה) ל -30 חלקים מיקרומטר ו הר בשקופיות (VWR, Superfrost פלוס). חנות ב -20 ° C.

6. Immunohistochemistry ניתוח

1. אימונוהיסטוכימיה בוצע כמתואר ^16. דילולים נוגדנים ראשוניים המשמשים במחקר זה כוללים ארנב α-GFP (Invitrogen) 1:2500, עכבר α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100, ארנב α-Ngn1 (ג'יין ג'ונסון) 1:5000, ארנב α-Ptf1a (ג'יין ג'ונסון ) 1:2500, ארנב Math1 (ג'יין ג'ונסון) 1:100. דגירה שטוח שקופיות, לצד הדגימה על מגש מכתים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. שקופיות נותחו על מיקרוסקופ מתחם (אולימפוס BX51).

7. נציג תוצאות

סכמטית באיור 1 א 'מתאר את הניסוי electroporation. 1B איור מראה נוף sagittal העובר E11.5 לפני מניפולציה. העובר גם לאחר הזרקה של החטיבה פלסמיד המכיל :: GFP בירוק מהיר 0.01% מוצגת באיור 1 ג ו העובר שאינו מקובע נציג מציג GFP חד צדדיתביטוי התרבות למוח האחורי הגב 24 שעות הבאה מוצג איור 1D. היקף בתחום LRL כי הוא electroporated בהצלחה הוא משתנה נראה תלויה מאוד המיקום של האלקטרודות. במחקרים שלנו נמצא כי 52 מתוך 65 (80%) של עוברי electroporated בהצלחה לידי ביטוי ה-GFP. רקמת נחשב להיות electroporated בהצלחה אם זה היה חיובי GFP באזורים מקומיים על כמה סעיפים לאחר ניתוח קיבוע immunohistochemical (ראה להלן). העוברים שלא הצליחו לענות על הקריטריונים דורגו כמו ניסיונות לא מוצלחים ב electroporation.

הערכה נוספת של יעילות electroporation ניתן לוודא על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה נגד ה-GFP על חלקים רוחביים של עוברי electroporated ברמה של החדר 4. תרשים 2 מציג חלקים סדרתיים נציג מעובר הצגת חד צדדיתה-GFP. איור 2 א הביטוי מראה סכימטי אידיאלית כי זה ממחיש את הצד השמאלי של העובר היה לכיוון האלקטרודה החיובית. חלקים רוחביים (ברמות המיוצגים על ידי קריקטורה אמצע איור 2 א) לחשוף את הביטוי GFP מקומי אך ורק בצד שמאל של רקמת למוח האחורי (איורים 2 ג ו 2 ד). אזור electroporated של LRL לא להאריך את ציר כולו הקדמי, האחורי של הצינור העצבי כמו בחינת סעיפים 300 מיקרומטר מקורי או יותר לזה שמוצג באיור 2 ג אין אקספרס GFP (איור 2 ב).

השירות של assay זה מניפולציה של ביטוי גנים תלוי ביציבות של תחומים ביטוי חלבונים אנדוגניים. LRL התאפיינה כבעל תחומים אב ייחודיים המאופיינים ביטוי ההפרש של גורמי תעתוק proneural (נבדקה ב ^1).תת קבוצה של גורמים אלה (Mash1, Math1, Ngn1, ו Ptf1a) נבחרו לניתוח בשל ו המוצע / או תפקידים שאפיינו במפרט של תת עצביים precerebellar ב LRL, נושא למחקרים עתידיים ^16-18. כל ארבעה חלבונים יש תחומים הביטוי האופייניות ביותר ב למוח האחורי הזנב ב E11.5 ^16-18. הבחנו כי עוברים שהונחו תרבויות הצליחו להגדיל את שטחו וגם לא ליזום הייצור של האפיתל מקלעת דמית העין ו invagination של אירועים, LRL ו roofplate מורפולוגיים המתרחשים בין E11.5 ו E12.5 ^5. בהתבסס על תצפיות אלה נקבע כי התפתחות תקינה של עוברים אלה הופסק או עוכב גסה ואת השליטה להשוות את העוברים בתרבית צריך להיות עוברים שאין להם תרבות ב E11.5.

על מנת להבטיח כי תרבות electroporation לא להפריע רמות של חלבונים אנדוגניים, ניתחנו ארבעה חלבונים שונים על ידי immunohistochemistry (IHC) ב -34 עוברים שונים שהיו electroporated ותרבותיים אז עבור שעות לפחות 24. לוח מראה את מספר העוברים ניתוח לכל הסמן כל אחוז העוברים ניתחו כי שמר על רמות חלבון נורמלי. איור 3 מציג נציג IHC נתונים מ 2 חלבונים ניתחו, Mash1 (איורים 3 א ו 3 ב) ו Math1 (איורים 3C ו 3D). הבחנו כי רוב העוברים שמר רמות נורמליות של electroporation הביטוי הבא ותרבות (איורים 3 ב ו 3D) לעומת העוברים הבקרה E11.5 (איורים 3 א ו 3 ג). חשוב לציין, תחומים הביטוי האופייני של חלבונים אלה לא היו מוטרדים.

באיור 1. Electroporation העוברים על E11.5. () סכמטי של הelectroporation דואר הניסוי. העובר E11.5 מופרד ביטוי פלסמיד בירוק מהיר 0.01% מוזרק לתוך החדר הרביעי. העובר הוא מוקף מכן על ידי משוטים האלקטרודה נתון 50 V הדופק לפני שיוצבו בתרבות (ב ') צפו sagittal העובר E11.5 לפני ההזרקה. (ג) העובר באותו E11.5 בעקבות הזרקת פלסמיד בירוק מהיר 0.01%. (ד) ביטוי למוח האחורי חד צדדי של ה-GFP שנצפתה העובר E11.5 לאחר 24 שעות של תרבות. MB-המוח התיכון, 4V-4 החדר.

איור 2. הביטוי של ה-GFP של רקמות Electroporated. (א ') קריקטורה משמאל מתאר את המיקום של אלקטרודות סביב העובר E11.5. הקריקטורה מתארת ​​את ספיגת התיכון ולהביא לידי ביטוי את ה-GFP קידוד פלסמיד בצד השמאלי של העובר. בקריקטורה מימין הוא סכימטי של סעיף רוחבי האידיאלי לקחת את העובר על levels כונה על ידי קווים שחורים הקריקטורה התיכון. (ב-D) אימונוהיסטוכימיה של ה-GFP על חלקים רוחביים באמצעות העובר E11.5 electroporated לאחר 24 שעות של תרבות. החיצים מצביעים על (RP) roofplate אשר מלכודות נוגדנים משני. תמונות נלקחים בהגדלה 10X. הרמות היחסיות של הסעיפים המוצגים מתוארים על ידי הקווים האופקיים באמצעות קריקטורה התיכון (). MB-המוח התיכון, 4V-4 החדר אני, RP-roofplate.

איור 3. ביטוי של חלבונים אנדוגניים השפה Rhombic תחתון אימונוהיסטוכימיה עבור Mash1 (A ו-B) או Math1 (C ו-D) השוואת חלקים רוחביים של עוברי E11.5 שלא היו מתורבת (C) עם העוברים שהיו electroporated עם החטיבה.: : GFP ותרבותיים עבור שעה 24 (B ו-D). תמונות שצולמו בהגדלה של 10X.

Proneural Transcriptiעל פקטור ניתחו	מספר העוברים ניתחו	אחוז שימור דפוסי הביטוי רגיל
Math1	15	86.7%
Mash1	12	83.3%
Ngn1	7	71.4%
Ptf1a	6	100%

לוח ט אחוז העוברים Electroporated ותרבותיים תמך רגיל Proneural גורם שעתוק דומיינים ב LRL.

Discussion

בטכניקה electroporation במבחנה הציג במחקר זה היא מתודולוגיה חדשנית יכול להיות מנוצל ביעילות לתמרן ביטוי גנים העוברים מתחת לגיל 12 ימים של הריון. המיקום של העוברים לתוך תרבות מאפשרת ביטוי של גן הציג עוקף הקטלניות נצפתה כאשר עוברים electroporated מותר להישאר in vivo. טכני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (לא חובה)
Cryostat	Leica	CM-1850
Biologie עצה Dumoxel טיפול דומונט מלקחיים	כלים מדעיים יפות	11252-30
20 מ"מ מוריה כף מחוררת	כלים מדעיים יפות	10370-17
ECM 830 electroporation כיכר Wave Generator	BTX (VWR)	47745-928
הרווארד Apparatus Tweezertrodes 7 מ"מ * אלקטרודות	BTX (פישר)	BTX450165
פישר Isotemp CO 2 החממה	דיג	1325525
NAPCO CO 2 גז הרגולטור	דיג	15497020
12 ובכן בתרבית רקמה צלחות	BD פלקון (פישר)	877229
HyClone נוזלי מדיה DMEM/F-12 (1:1), עם גלוטמין-L ו HEPES: 500 מ"ל	Thermo Scientific (פישר)	SH3002301
HyClone * תורמים סוסים סרום	Thermo Scientific (פישר)	SH3007402
העובר שור סרום, מוסמך, מומת חום	Invitrogen	16140-063
cellgro * 10,000 IU פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין	Mediatech (פישר)	MT-30-002-CI
HyClone * L-גלוטמין L-גלוטמין: 200mM ב NaCl 0.85%	Thermo Scientific (פישר)	SH3003401
מהיר גרין	דיג	AC41053-0250	0.01%