אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס

Summary

מעגלים עצביים מאורגנים מבחינה טופוגרפית עם פרופילים מולקולריים ספציפיים לתאים פונקציונליים. כאן, אנו מספקים את הצעדים המעשיים והטכניים של חשיפת הטופוגרפיה המוח העולמי באמצעות גישה צדדי wholemount מכתים immunohistochemical. אנו להדגים את התועלת של השיטה באמצעות cytoarchitecture מבינים היטב ואת המעגלים של המוח הקטן.

Abstract

ארכיטקטורת הסלולר חזר היטב הבין של המוח הקטן לעשות את זה במערכת מודל אידיאלי לחקר הטופוגרפיה המוח. בבסיס cytoarchitecture אחידה יחסית הוא מערך מורכב של תחומים parasagittal של גנים ביטוי החלבון. מידור המולקולרי של המוח הקטן ניצבת ארגון אנטומי ופונקציונלי של סיבים מביא. כדי להעריך במלואה את המורכבות של הארגון cerebellar מיקדנו בעבר הגישה מכתים wholemount לניתוח קצב העברת נתונים גבוה של מומים דפוסים במוח הקטן העכבר. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ריאגנטים, כלים וצעדים מעשיים מועילים בהצלחה לחשוף דפוסי ביטוי חלבונים במוח הקטן העכבר למבוגרים באמצעות immunostaining wholemount. הצעדים מודגשת כאן להדגים את התועלת של שיטה זו באמצעות ביטוי zebrinII / aldolaseC כדוגמה כיצד הטופוגרפיה קנס של המוח יכול להתגלות שלהקונפורמציה יליד תלת מימדי. מתואר גם הם עיבודים לפרוטוקול המאפשרים הדמיה של ביטוי החלבון תחזיות מביא ו cerebella גדול של מחקרים השוואתיים של הטופוגרפיה מולקולרית. כדי להמחיש יישומים אלה, נתוני מכתים מביא של המוח הקטן עכברוש כלולים.

Protocol

1. בעלי חיים זלוף ו Dissection המוח הקטן

1. בהתאם חלבון, זלוף עשוי להיות חיוני מכתים ^1,2 מוצלח. זלוף Transcardiac היא פולשנית, לא הישרדות הליך הדורש שימוש נכון של חומרי הרדמה. הכשרה נכונה, אישור מוסדי, ואישור IACUC כל הדרוש לפני שתנסה את ההליך. זה תמיד רעיון טוב להתייעץ עם וטרינרים המוסד לקבל עזרה בזיהוי דרישות הניסוי ורכישת אימונים נכונה. לפני ההליך, בעלי חיים צריך להיות בהרדמה עמוקה ולא מגיבים לגירויים כגון ברגל או קמצוץ הזנב. באמצעות מספריים לעשות חתך בעור הבטן הקיר שריר ואז להמשיך לפתוח את בית החזה על ידי חיתוך צמוד רק עצם החז....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תיארנו את הפרטים הטכניים הדרושים מכתים wholemount מוצלח באמצעות גישה immunohistochemical תכליתי עבור ביטוי חושפני חלבון במוח המתפתח ומבוגרים. על ידי שימוש בגישה זו, מורכבים דפוסי הביטוי מולקולרית ניתן לנתח והטופוגרפיה המוח מוערך ללא צורך מייגעים זמן רב נהלים חתך רקמות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
חומרים	פונקציה בפרוטוקול
זלוף המשאבה (פישר Scientific/13-876-2)	מאפשר טפטוף עקבי ואיטי.
חד עצה מספריים (FST/14081-08)	שימוש כללי זלוף ו לנתיחה.
בלאנט, עצה מלקחיים (FST/91100-12)	כדי לייצב את הלב על החדרת המחט זלוף.
מלקחיים (FST ידי דומון AA/11210-10)	לשימוש במהלך דיסקציה של המוח מהגולגולת כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח. אלה הם חיוניים, כי יש להם קצה מעוגל מעט, המסייע לצמצם פגיעה במוח הקטן במהלך לנתיחה.
Nutator (פישר סיינטיפיק)	משמש כדי לשמור על רקמת בתנועה בתקופות הדגירה.
1.5 מ"ל צינור (Sarstedt / בורג שווי מיקרו Tube)	כל הצעדים של שלוtochemistry פרוטוקול להתקיים microtubes אלה. תחתית מעוגלת מבטיח כי המוח הקטן נשאר בתנועה.
כף מחוררת (FST/10370-17)	נהג להחזיק wholemounts ב microtubes תוך בעדינות decanting את הפתרון בילו.
לייקה MZ16 מיקרוסקופ FA	נהג לבחון מכתים wholemount.
לייקה DFC3000 FX המצלמה	נהג ללכוד תמונות wholemount.

למשל לוח שנה לניסוי wholemount טיפוסי
יום 1	דנט של תיקון, בטמפרטורת החדר, 8 שעות				דנט של אקונומיקה, 4 ° C, בן לילה
יום 2	100% MeOH, בטמפרטורת החדר, 2x, 30 דק 'כל אחד			100 MeOH%, פריז / הפשרה, 4x, 30 דקות min/15			n = "2"> MeOH 100%, -80 ° C, בן לילה
יום 3	50% MeOH/50% PBS, בטמפרטורת החדר, 60-90 דקות	15% MeOH / PBS 85%, בטמפרטורת החדר, 60-90 דקות		100% PBS, בטמפרטורת החדר, 60-90 דקות		10μg/mL proteinase K ב PBS, בטמפרטורת החדר, 2-3 דקות	100% PBS, בטמפרטורת החדר, 3x, 10 דק 'כל אחד	PMT, 4 ° C, בן לילה
יום 4-5	PMT + 1 ° נוגדנים + 5% DMSO, 4 ° C, 48 שעות
יום 6	PMT, 4 מעלות צלזיוס, 2-3X, 2-3 שעות כל אחד			PMT + 2 ° נוגדנים + 5% DMSO, 4 ° C, 24 שעות (או להתחיל צעדים הגברה עם ABC מורכבים)
יום 7	PMT, 4 מעלות צלזיוס, 2-3X, 2-3 שעות כל אחד		PBT, בטמפרטורת החדר, 2 שעות			דגירה ב DAB טרי PBS עד מכתים האופטימלי הוא דמיינו

מתכונים (* = להכין טרי בכל פעם)
PBS (פוספט שנאגרו מלוחים)	0.1M פוספט שנאגרו מלוחים במים deionized. ה-pH 7.2 (טבליות סיגמא: P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	עשה קפוא מאוחסנים כפתרון 20% ולאחר מכן מדולל ל -4% ב PBS לפתרון העבודה (פישר סיינטיפיק, T353)
דנט של * מקבע 3	4 חלקים מתנול 1 dimethylsulfoxide חלק (DMSO, פישר סיינטיפיק, D159-4)
דנט של בליץ 3 *	4 חלקים מתנול 1 dimethylsulfoxide חלק (DMSO, פישר סיינטיפיק, D159-4) 1 30% מי חמצן חלק
עיכול אנזימתי	10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של proteinase K (Roche Diagnostics, 03115828001) ב PBS.
PBST	PBS המכיל: 0.1% tween-20 (Fisheמחקר מדעי, BP337, טריטון יכול לשמש גם במקום Tween-20 בכל המקרים).
PMT 25 *	PBS המכיל: 2% שומן אבקת חלב רזה (הציפורנים העדיף) 0.1% tween-20 (פישר סיינטיפיק; BP337)
PBT 25 *	PBS המכיל: 0.2% (Sigma, B9001S) אלבומין בסרום שור 0.1% tween-20 (פישר סיינטיפיק; BP337)
DAB *	ממיסים 1 ל -10 מ"ג של 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich, D5905) ב 40 מ"ל של PBS. הוסף 10 μl של מי חמצן 30% ליזום תגובה).
ABC קומפלקס פתרון	Vectastain KIT (וקטור Laboratories, Inc, PK-4000)