מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Summary

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות ב חיידקי Escherichia.

Abstract

פנוטיפים נקבעים על ידי סדרה מורכבת של אינטראקציות פיסיות (בין חלבונים לדוגמה) ופונקציונליות (גני גן או גנטי לדוגמה) (GI) ^1. בעוד אינטראקציות פיסיות יכולות להעיד שחלבונים חיידקיים משויכים כמתחמים, שהם לא בהכרח לחשוף relationships1 הפונקציונלי מסלול ברמה. מסכי מערכת עיכול, שבו הצמיחה של מוטנטים כפולים, ושני גנים שנמחקו או מומתים נמדדה והשוואה למוטנטים הבודדים המתאימים, יכולים להאיר תלות epistatic בין לוקוסים ומכאן לספק אמצעים לשאילתה ולגלות קשרים פונקציונליים חדשים ^2. מפות GI בקנה מידה גדולה כבר דיווחו לאורגניזמים האיקריוטים כמו שמרים ^3-7, אך מידע GI נותר דליל לפרוקריוטים ^8, אשר מעכב את הביאור הפונקציונלי של הגנום של חיידקים. לשם כך, אנחנו ואחרים פתחנו שיטות תפוקה גבוהה כמותיים חיידקים במערכת עיכול הקרנה ^{9, 10} כאן, אנו מציגים את השלבים העיקריים הנדרשים לביצוע ה כמותית coli מערך הליך סינטטי גנטי (eSGA) הקרנה על הגנום בהיקף ^9, תוך שימוש בנטייה טבעית חיידקים והומולוגיים רקומבינציה המערכתית כדי להפיק ולמדוד את הכושר של מספר גדול של מוטציות כפולות בפורמט מערך מושבה. בקצרה, רובוט משמש להעברה , דרך הצמידה chloramphenicol (CM) - מסומן אללים מוטנטים מHFR המהונדס (תדירות גבוהה של רקומבינציה) 'זנים תורמים' למערך מסודר של kanamycin (קאן) - זנים מסומנים F-נמענים. בדרך כלל, אנחנו משתמשים במוטציות אובדן של פונקציה בודדות נושא מחיקות גנים שאינם חיוניות (למשל, האוסף 'קיו' ¹¹⁾ ומוטציות גנטיות hypomorphic חיוניות (כלומר האללים מקנים ביטוי מופחת חלבון, יציבות, או פעילות ^{9, 12, 13)} כדי שאילתא העמותות הפונקציונליות של גנים שאינם חיוניים והכרחיים, מילpectively. לאחר הצמיד ותיווך חילופים גנטי שהתפתח על ידי הומולוגי רקומבינציה, המוטציות הכפולות כתוצאה מכך הם נבחרו על המצע מוצק המכיל גם אנטיביוטיקה. לאחר תולדה, הצלחות הם צלמו באופן דיגיטלי וגדלי מושבת כמותית מקבלים נקודות באמצעות מערכת בבית אוטומטית עיבוד תמונת ^14. החיילים אמריקאים מתגלים כאשר שיעור הצמיחה של מוטציה כפולה הוא גם באופן משמעותי טוב יותר או גרוע יותר מצפויים ^9. חיילים אמריקאים מחמירים (או שלילי) לעתים קרובות תוצאה בין מוטציות אובדן של פונקציה בזוגות של גנים ממסלולי פיצוי התלויים באותו התהליך החיוני ^2. הנה, אובדנו של גן יחיד נאגר, כך שגם מוטציה אחת היא בת קיימא. עם זאת, ההפסד של שני המסלולים הוא מזיק ותוצאות בהקטלניות או מחלה סינטטיות (כלומר צמיחה איטית). לעומת זאת, אינטראקציות הקלה (או חיובי) יכולות להתרחש בין גנים באותו מסלול או חלבון מורכב ² כמומחיקה של שני הגנים בלבד היא לעתים קרובות מספיק כדי לטרוד את התפקוד התקין של המסלול או המורכב כגון הפרעות נוספות שלא לצמצם את הפעילות, ולכן צמיחה, נוספת. בסך הכל, באופן שיטתי זיהוי וניתוח רשתות GI יכול לספק מפות משוחדות, גלובליות של קשרים הפונקציונליים בין מספר הגדול של גנים, שממנו מידע מסלול ברמה החמיץ ידי גישות אחרות ניתן להסיק ^9.

Protocol

1. בניית זני Mutant תורם קוואלי HFR ידי Recombineering ^{15, 16}

השלבים לבנייה את הכתמים התורמים eSGA מתוארים להלן. בקצרה, אנו משתמשים λ הממוקד - אדום מתווכים הומולוגי רקומבינציה ¹⁶ מתוך קלטת סמן מוגבר לבחירת ה-DNA שברים שנוצר על ידי PCR ליצור מוטציות שאינן חיוניות גני מחיקה (סעיף 1.1), או זנים חיוניים גני hypomorphic מוטציה תורמת (סעיף 1.2) ואז המשמשים כ "שאילתות" להגדרת רשתות עיכול.

הערה: במהלך תהליך פיתוח הטכנולוגיה, שהערכנו את האפקטיביות של שימוש בהעברת conjugative HFR בתיווך לשילוב מוטציות באמצעות לחץ תורם HFR מוגדר היטב (HFR קוואלי, HFR הייס, וHFR 3000). בדקנו (i) את היכולת יעילה לעשות מוטציות תורמות בשיטת recombineering חלוץ ידי יו et al. (2000) ^16, (ii) את היעילות היחסיתהעברת conjugative DNA של סמני כרומוזומליות שונים, וכן (iii) את ההשפעות של מיקום גן השאילתה ואורינטציה ביחס למוקד העברת HFR, אורית כרומוזומלית. מצאנו λ ש-- הומולוגית יעילות רקומבינציה אדומה בתיווך הייתה גבוהה הרבה יותר בHFR קוואלי מאשר בHFR הייז או Hfr3000. במידת צורך, תמרת P1 או מתח פסאודו HFR ^17, יכולה לשמש ליצירת מוטצית תורמים. יש לנו להתאים בהצלחה את כל השיטות הללו להכנה וסינון של מספר גדול של תורמים. מאחר בניסויי צמיד המשפט שלנו, את היעילות הכוללת של העברה ואת מספר התאים צמודים לשעבר נצפתה היה גבוה משמעותי עם HFR קוואלי, רקע זן המסוים הזה נבחר לבניית תורם וeSGA בקנה מידה גדולה. כל הנהלים למסכי eSGA באמצעות תורמי HFR קוואלי מתוארים.

1. מגביר את קטע DNA לrecombineering לאחר למחוק גן שאינו חיוני
   להעסיק שני שלבי PCR ampli המקונןfication (איור 1) כדי ליצור קלטת גן מחיקה להחלפת מסגרת היעד פתוחת קריאה עם סמן התנגדות סנטימטרים מpKD3 פלסמיד (GI: 15554330; מזהה חלבון: AAL02033.1) ^15. הסמן מוקף ^FRT-11 האתרים המאפשרים את הסרתו של גן ההתנגדות, במידת צורך, במעקב ניסויים.
   הערה: אין אנו מקוננים שני שלבים PCR כדי להסיר את הפלסמיד מהמוצר המוגבר המשמש לאחר מכן להפוך את תאי חיידקים. הסרת פלסמיד (בPCR הראשון) ולאחר מכן יצירת קלטת נוקאאוט הגן בPCR השני היא נחוצה משום השינוי בפלסמיד הוא הרבה יותר יעיל מאשר recombineering, והמטרה היא להשיג - ככל האפשר - זנים היחידים שמקיימים החליף את הדנ"א הגנומי הממוקד בהצלחה עם הסמן לבחירה. חלופה לPCR המקונן היא לבצע לעכל הגבלה מחוץ פלסמיד של האזור המוגבר בPCR 2צעד. אז המוצר של לעכל ההגבלה הוא מטוהרים ומשמש כתבנית בשלב PCR המקונן (1.1.2). אפשרות זו היא גם פשוט, אבל דורשת עוד עבודה עד שעה.
   1. השתמש על 45 ננוגרם של pKD3 כתבנית בPCR עם פריימרים R1 קדימה F1 והפוכים כדי לייצר מוצר 1070 נ"ב. לטהר את בר PCR באמצעות פרוטוקול טיהור PCR Qiagen, ולדלל את המוצר במים מזוקקים סטריליים עד 5 ng / μl ריכוז.
   2. שימוש במוצר ה-PCR המטוהר כתבנית, להגדיר PCR שני עם נוקאאוט (למשל) פריימרים ספציפיים לגן מקוננים, F2 ו R2, שיש (i) 45 nt אזורי הומולוגיה גנטית ספציפיים ב5'-מסתיים כדי לאפשר להומולוגי רקומבינציה מייד במורד זרם של גן המטרה להחליף אותו עם סמן סנטימטרי התנגדות וכן (ii) 20 nt בקצוות 3'-כדי להתניע את הסינתזה של סמן הסנטימטר. גודלו של בר הפיק הוא 1123 נ"ב. אזורי הומולוגית גן הספציפיים נועדו להסיר אופ היעדen קריאת מסגרת תוך השארה כל פרקים סמוכים או חלקי חופפים קידוד בשלמותה. אחרי הגברה זה, המשך לשלב 1.3.
2. הגברת קלטת תיוג ליצירת מוטצית hypomorphic גן חיונית
   1. לבנות זנים מוטנטים תורם hypomorphic, להוסיף תג פפטיד C-מסוף רציף זיקה (SPA) היתוך, אשר לעתים קרובות משפיע מעט תפקוד חלבון חיוני על ידי שפע מערער תמליל (מספר עותק חלבון כלומר) או מתקפל / פעילות חלבון. לשם כך, ליצור SPA-תג (SPA-סנטימטר) תבנית דנ"א לבחירה על ידי המרת סמן התנגדות קן בpJL148 ¹⁸ סנטימטרים לבאמצעות recombineering בין רצפי נוקליאוטידים זהים איגוף סמן קאן בpJL148 וסמן סנטימטרים בpKD3 ^15. תבנית כתוצאה מורכבת במסגרת SPA-תג אחרי סמן התנגדות סנטימטרים, והוא מתאים להגברת PCR, recombineering ולאחר ¹² eSGA.
      הערה: </ חזק> גנים חיוניים הם פוטנציאל המעניין ביותר ללימודי תפקוד גן. עם זאת, מכיוון שלא ניתן למחוק את הגנים האלה, שיטות חדשניות היו להיות מפותחות לחוקר את היחסים הפונקציונליים של גנים חיוניים. גישות מתאימות כמה מוצלחות ביותר שפותחו בתחילה בשמרים. לדוגמה, Davierwala et al. (2005) ¹⁹ מסכים GI שבוצע באמצעות פנל של 575 מוטציות גנטיות חיוניות טמפרטורה רגישה, וגילו כי גנים חיוניים הציגו בערך פי חמישה ממספר החיילים אמריקאים כגנים שאינם חיוניים. כמו כן, Breslow et al. (2008) ²⁰ פתחו "שפע ירד ב הפרעות mRNA" גישה ליצור ספרייה של אללים hypomorphic מכסים ~ 82% מגנים של שמרים חיוניים ללמוד מסלולים ומתחמים (לח). הגישה הלחה משנה 3'end של mRNA הביע, הפחתת רמת גן היעד ^6, ככל הנראה בשל חוסר יציבות mRNA. בדומה לגישה הלחה ^6, strategy היה לנצל את ההשפעות העדינות של perturbing סוף 3 'של ה-mRNA הביע של חלבונים חיוניים.
      כפי שנתואר להלן, התג על ידי עצמו אינו צפוי להשפיע קיפול חלבונים או פונקציה, אבל ההפרעות העדינות של mRNA על ידי התג מספיק, בשילוב עם גורמי לחץ סביבתיים או מוטציות אחרות, לגלות גני הסביבה תפקודית אינפורמטיבי ¹³ וגן ^{9-גן, 12} אינטראקציות.
      ראשית, עד היום, השתמש ספא תגים לטהר ~ 3000 חלבוני E. coli חיוניים ושאינם חיוניים ^21-23, עם מעל 80% מ307 חיידק חלבונים חיוניים שייצגו בין זנינו ספא ^{המתויג-8.} בגלל התג שהשתמש בהצלחה לבודד מתחמים ידועים חלבונים, אשר היו תקף הדדי (כלומר אותו הקומפלקס יכול להיות מבודדים על ידי תיוג וטיהור חלבונים שונים מאותו המתחם); והמתחמים המבודדים היו ביולוגי רלוונטיים, אנחנו סיבה שהתגים לעשותבדרך כלל לא משפיע על קיפול חלבונים או פונקציה ^12. בדומה לכך, התצפיות שלא פורסמו שלנו גילו כי התג על ידי עצמו אינו בדרך כלל משפיע על צמיחת מתח. עם זאת, הנחנו ששינוי 3'-UTR ידי שילוב התג וקלטת הסמן, כפי שדווח לזנים לחים ^6, יכול לערער תמלילים מסוימים ברמת RNA או, במקרים נדירים, לעכב מתקפלים או התפקוד התקין של חלבוני היתוך. לכן, אנו צופים כי שילוב כזה מוטרד האללים של גנים חיוניים עם מוטציות רלוונטיות תפקודיות אחרות במקום אחר בגנום יביא חיילים אינפורמטיבי, שאכן נצפו ^{9, 12.} אללים יתר על כן, SPA-מתויג של גנים חיוניים הציגו אינטראקציות גני הסביבה (למשל רגישות יתר בסמים) על פי עבודת האפיון הפנוטיפי על ידי ניקולס et al. (2011) ^13, שנתון משנה של זנים חיוניים SPA מתויג למגוון רחב של תנאי גידול. אותו confirme המחקרד כי רוב (54 מתוך 58 שנבדקו) SPA מתויג-זנים חיוניים הראו כושר לקוי בתנאי אחד או יותר, שתרבות ¹³ תומך ברעיון כי SPA-התג לעתים קרובות יוצר אללים hypomorphic קלים בגנים חיוניים שאינם שימושיים עבור רחב הגנום יישומי מסך מערכת עיכול לרבות eSGA.
   2. להגביר את קלטת התיוג מהתבנית SPA-CM באמצעות פריימרים S1 ו S2 גן ספציפיים, שכל אחת מכיל (i) 45 אזור nt גן ספציפי לrecombineering הומולוגי בקצה 5 ', ואחריו (שני) של 27 נ"ב SPA- רצף מסוים סנטימטר בקצה 3 '.
3. מאשר וטיהור מוצר PCR
   1. ודא שקלטת התיוג הוגברה בצורה נכונה על ידי חשיפה של 2-5 μl מוצר PCR לאלקטרופורזה ג'ל agarose ולטהר את הדנ"א שנותר בעקבות הפרוטוקול של היצרן הסטנדרטי PCR הטיהור (Qiagen). Elute מוצר PCR ב30 μl של מים מזוקקים סטריליים ולדלל ל~ 50 ng / μl ריכוז. Purifiמוצר ed ניתן להשתמש מייד בשינוי (שלב 1.5) ומאוחסן ב -20 ° C עד 6 חודשים עד לשימוש.
4. הכנת תאים מוסמכים HFR קוואלי לבניית תורם
   1. לחסן מ"ל אחד של תרבות הלילה הרוויה מתח של HFR קוואלי לתוך 70 מ"ל של וריא-Bertani בינוני טרי (LB) עם 35 μl של 50 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין בבקבוק 250 מ"ל. דגירת התרבות ב 32 ° C עם הרעד ב220 סל"ד עד צפיפות אופטית (OD) 600 ננומטר ~ של 0.5-0.6 מתקבל (~ 2 שעות).
   2. העברת התרבות לאמבט מים לזירוז חום של מערכת רקומבינציה _האדומה λ ¹⁶ על 42 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם הרעד של 160 סל"ד. עצור את האינדוקציה על ידי העברת התרבות לאמבטית מים קרות כקרח slurry ל10-20 דקות ב 160 סל"ד. הקפד לשמור על התאים קרים מנקודה זו עד לאחר שינוי; צינורות שימוש וcuvettes כי כבר קפוא על קרח במשך לפחות 15 דקות לפני שימוש.
   3. מחלק את גulture שווה ל2 50 צינורות מראש מצונני מ"ל פוליפרופילן (~ 35 מ"ל לשפופרת תרבות) וצנטריפוגות XG ב 4400 עבור 6 דקות ב 4 ° C.
   4. בטל supernatant, מחדש להשעות את התא הגלול ידי היפוך עדין ב~ 50 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים קרים כקרח. צנטריפוגה התאים שוב ב4400 XG ל6 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant מחדש להשעות כל תא גלול ב 20 מ"ל של גליצרול 10% קר כקרח סטרילית וסרכזת שוב כמתואר לעיל.
   5. למזוג supernatant מחדש להשעות את התא גלול ב 500 μl של קרח הקר גליצרול 10%. Aliquot התאים המוסמכים המוכנים ב 50 כרכי μl 1.5 לתוך צינורות בודדים, מראש מצונני מיליליטר מייקרו צנטריפוגות לשינוי מיידי. התאים עשויים להיות קפוא בקרח יבש או בחנקן נוזלי ואוחסנו ב -80 ° C עד 3 חודשים. עם זאת, יעילות גבוהה ביותר היא שינוי בתאים מוסמכים וטריים.
5. טרנספורמציה
   1. הוסף 100 ננוגרם של מוצר PCR מטוהרים מןצעד 1.3.1 לתאים המוסמכים. פליק הצינור ומאפשר השעיה לשבת על קרח למשך 5 דקות.
   2. להעביר את ההשעיה של תאים ו-DNA המוסמכים קרים כקרח לקובט electroporation מראש מצונן. Electroporate תערובת תא עם 2.5 קילו הוולט, 25 μF, 200 אוהם הגדרה ב2 מ"מ פער קובט (כלומר, אם באמצעות קובט שונה, עיין בהוראות היצרן עבור הגדרות electroporation), ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום SOC טמפרטורת החדר באופן מיידי. להעביר את תאי electroporated במדיום SOC לתוך צינור תרבות 15 מ"ל ולדגור על 32 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ההקפה רועדת ב220 סל"ד.
   3. לאחר הדגרה, צנטריפוגה התאים XG ב 4400 למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הסר כ 850 μl של supernatant, מחדש להשעות את התא הגלול בנוזל שנותר.
   4. מורח את התאים בצלחות LB מראש חממו המכילות 17 סנטימטר מיקרוגרם / מ"ל, ולדגור על 32 מעלות צלזיוס למשך הלילה. פיק שתי מושבות transformant בודדות ופס על LB-CM צלחות לאישור מוטציה. אנו ממליצים להימנע ממושבות transformant גדולות כדי לצמצם את הסיכוי להידבק בזנים עם מוטציות מדכאים נדירות. גם פס אותם transformants על LB קאן כדי לוודא שהם לא הזנים עמידים קאן.
      הערה: מאחר שסמן התנגדות הסנטימטרים משמש כדי להפוך את הזנים התורמים, אנחנו לא מצפים למוטציות התורמות להיות קאן עמיד. על ידי מצייר פסים על גבי transformants הן LB קאן וצלחות LB-סנטימטר, אנו מבטיחים כי מוטצית התורם עצמו לא איכשהו לגרום להתנגדות קאן. אם צעד זה לא בוצע ואת מוטציות היעד היו להשפיע על יכולתו של הזן לשרוד בקאן, מוטנטים כפולים לא יהיו בנויים בצורה יעילה באמצעות eSGA מאז זנים תורמים ישרדו את כל שלבי הבחירה. זה רק צעד הגיוני זהירות לתפוס פנוטיפים בלתי צפויים או בעיות אחרות שעשויים להפריע להשלמת מסכי eSGA. אם הצעד הזה היה מדלג על woul פקדים אחריםד עדיין לזהות מסכים נכשלו. עם זאת, גילוי מוקדם של תורם כי הוא עמיד לקאן היה מבטל שורה של צעדים לא יצרניים ולא נחוצים. סיבות אפשריות אחרות ללחץ לגדול על קאן יכול לכלול למשל פגו אנטיביוטיות, כמו גם את השימוש במוצר ה-PCR לא נכון או מאמץ לשינוי. כל הנושאים הללו ניתן לזהות ולטפל בשלב מוקדם בהליך בעזרת שליטה זו, שאינה חובה, אך מומלץ לeSGA.
6. המאשר את המחיקה שאינה החיונית הגן (צעד 1.6.1) או מוטצית hypomorphic גן חיונית (סעיף 1.6.2)
   הערה: כאשר מאשר את מחיקת הגן באמצעות PCR, הדנ"א הגנומי מזן פראי סוג צריך לשמש כביקורת.
   1. אישור מחיקת גן שאינו חיונית
      1. כדי לאשר את מחיקת גן באמצעות PCR, לבודד את הדנ"א הגנומי מהזנים, הפכו המשוערים נוקאאוט גודלו במדיום נוזלי LB-CM, בעקבות manufactההוראות של urer (Promega).
      2. כדי לאשר recombineering המוצלח, מגדיל את הדנ"א מכל transformant עם שלוש קבוצות שונות של פריימרים אישור נוקאאוט. בצע את התגובות עם ~ 150 ננוגרם של תבנית הדנ"א הגנומי, ולאשר את גדלי הבר הנכונים על ידי הפעלת מוצרי PCR המסונתזים על ג'ל agarose.
      3. הקבוצה הראשונה מורכבת של פריימר 20-NT פריימר איגוף, הממוקם במעלה זרם של 200 נ"ב אזור המיקוד (KOCO-F), ופריימר CM-R, אשר הוא משלים את רצף קלטת הסנטימטר. הגברה זו צפויה לייצר amplicon 445 nt במוטציה, אבל לא בלחץ הפראי הסוג (איור 1).
      4. הקבוצה השנייה כוללת פריימר קדימה (CM-F), חישול רצף קלטת הסנטימטר, והיפך 20-NT איגוף פריימר אישור (KOCO-R), אשר נועד כדי לחשל 200 מורד BP של תום 3 'של נמחק גן. תגובת הגברה זו צפויה לייצר amplicon 309 nt במוטציה, אבל לאלא בלחץ הפראי הסוג (איור 1).
      5. PCR השלישי מכיל KOCO-F וKOCO-R פריימרים. תגובה זו נדרשת כדי לאשר כי המתח שנבחר אינו merodiploid, עם שהוחלף לוקוס גן אחד על ידי הקלטת ועוד משוכפל אבל חוץ מעותק הגן פראי מסוג שעדיין קיים. הגברה זו ממוטצית מחיקה נכונה צפויה לייצר מוצר 1.4 ק"ג (איור 1).
         הערה: כאשר גן היעד בערך באותו האורך בזוגות בסיסים כקלטת מחיקת הגן, אחד לא יבחין בהבדל בין לוקוס שהוחלף בקלטת, ומוקד שבו יש שלא. לאישור סופי במקרים כאלה, מומלץ להשתמש בפריימרים ספציפיים נוספים כדי להגביר את מקטע ה-DNA בגנים יימחקו. במקרה זה, אם הגן נמחק, מוצר הגברה יהיה נצפה רק בלחץ שליטת הסוג הפרוע ולא במוטציה. פריימרים אלויכול להיות ידני או מחשוב שתוכנן במיוחד כדי להגביר מקטע של DNA בתוך האזור נמחק. אנחנו בדרך כלל להגביר 140 אזורי BP.
   2. מוטציה גנטית המאשר hypomorphic חיונית
      1. כדי לאשר את מוטצית hypomorphic באמצעות PCR, השתמש 20-NT גן ספציפי קדימה (KOCO-F) ופריימרים הפוכים (KOCO-R) הממוקמים במעלה זרם או במורד 200 נ"ב, בהתאמה, של אתר הכנסת SPA-התג (איור 2).
         הערה: שלב הגברה זה משמש כבקרה על מנת להבטיח העדר עותק לא מתויג של הגן החיוני היעד. כאשר רק גרסה מתויגת היא הווה, 310 נ"ב להקה אחת גדול יותר מamplicon SPA-CM הוא ציין. מוצר 400 נ"ב יאותת הנוכחות של הגרסה המתויגת של הגן.
      2. במקביל לאישור ה-PCR, השתמש מערבי סופג כדי לאמת את ההכנסה במסגרת של ספא התג באמצעות נוגדן אנטי-M2 דגל ספציפי לדגל אפיטופים של SPתג ^21.
7. אחסון מתח התורם אשר
   1. להעביר את תרבות הלילה של זן תורם מוטצית רקומביננטי אשר לcryovials כותרתו, להשלים עם גליצרול לריכוז סופי 15%, ומערבב היטב. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על cryovials ב-80 ° C.

2. Arraying E. coli מוטציות F-Recipient למסכי eSGA

1. Replica פיני E. coli אוסף קיו יחידה שאינם חיוני גן מחיקת מוטציה שנוצר על ידי המורים ואח'. (3968 זנים ^11; F-BW25113; ניתן להשיג הפתוח Biosystems) רובוט ל24 microplates 384 גם מכיל 80 μl של תקשורת LB הנוזלית לטוב , בתוספת 50 מיקרוגרם / המ"ל קנזס
   הערה: להערכת חיילים אמריקאים עם גנים חיוניים באופן שיטתי, נמען קיו ¹¹ האוסף ניתן להשלים עם ה-F-Kan-המסומנת הגן hypomorph החיוניזני IC מוטנטים עם C-מסוף ספא תגים ^{22, 23.}
2. כדי לפנות מקום למתח ביקורת הגבולות, שישמש כביקורת חיובית, בסיוע בתוך ובין normalizations צלחת, כמו גם בquantizations מושבה האוטומטית, להסיר את המדיה המחוסנת מהבארות החיצוניות של כל צלחת מהצעד וההעברה למעל צלחות חדשות, שוב השאירו את הבארות החיצוניות ביותר ריקות.
   הערה: מתח ביקורת גבולות JW5028 מאוסף קיו ¹¹ נמחק לגן פסאודו קטן שלא צריך, ולא בכל המסכים, הגנום שלנו, מציג חיילים אמריקאים עם כל תורמים. לכן, זה מתח ביקורת חיובית טוב לזהות מקרים נדירים שבי צמיד, נעיצה, או בחירות נכשלו, וכתוצאה מכך גידול זן גבול נעדר או לא סדיר. לדוגמה, אם מושבות ביקורת הגבולות לא צומחות לאחר בחירת המוטציה הכפולה, זן השאילתה אינו יכול להיות מסוגל הצמידה נטייה ייתכן שניסתהמצב na שמנע ממנה לקחת את המקום (למשל על צלחת המכילה אנטיביוטיקה), או אנטיביוטיקה שגויה אולי הוסיף לצלחת הבחירה. בדומה לכך, אם מעט מאוד מושבות, ספורדיות הם נצפו בכל הצלחת, כולל גבול, בניין או נעיצה אולי נכשל והמסך צריך להיות חוזר ונשנה. אם הצמיחה לא הסדירה הגבול הזה היא שחזור, זה עשוי להצביע על נטיית תורם עקבי עניה וכך המקרים בם מוטציות כפולות לא נצפו הנם ככל הנראה בשל כשל נטייה, לא חיילים אמיתיים. מסכים אלה היה צריכים להיות מושלכים מניתוח נוסף. יתר על כן, על ידי להיות נוכח בכל הצלחות, מתח ביקורת הגבולות מאפשר תוכנת קוונטיזציה מושבה כדי לקבוע עמדות מושבה על לוחות מוטציה הכפולים ולכן עמדות מושבה לא צריכות להיות מסומנות באופן ידני באופן אוטומטי. לבסוף, עזרי גבול בקרת מתח בנורמליזציה של גדלי מושבה (למשל בתוך שורות שונות בתוך צלחת) וbetwEen (צלחות נמענים שונות כגון הצמידו עם אותו התורם בזמנים שונים) צלחות.
3. כמו כן, ליצור נקודתי בקרה שליליות על ידי הסרת כל שני זנים ממיקום אחר בתוך כל צלחת (לא גבול) ולהעביר את הזנים לצלחת חדשה. מלא בארות ריקות האלה עם תקשורת LB המכילה 17 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סנטימטר. נקודתי בקרה שליליות אלה צפויים להיות ריקים בנמען וצלחות מוטציה לכן כפולות ולהבטיח שאין שום עיבוד או שגיאות טיפול צלחת כאשר מספור, הדמיה, או מצמיד את הצלחות.
   הערה: כתמים ריקים אלה נדרשים בקרה שלילית. פקדים שליליים עוזרים לזהות מקרים שבם בחירה נכשלה - כאשר זני בקרה שליליים לגדול במהלך בחירה. אנו ממליצים לבחור לא רק נקודתי ביקורת שליליות ייחודיות לכל אחת מצלחות הנמענים, אלא גם כדי לבחור מקומות בקרה שליליים בתוך אותו הרביע של הצלחת (למשל פינה ימנית תחתונה). בדרך זו, את הדפוסנקודתי בקרה שליליות הייתי לזהות טעויות טיפול כושל צלחת אפשריות (למשל צלחות שכהלכה או שהצמידו הפוך, שבו המושבת השמאלית העליונה נעוצה בעמדה ימנית תחתונה).
4. לחסן קיו מתח JW5028 ^11, עם מחיקת pseudogene, לבקבוק 500 מ"ל עם LB מ"ל 200, המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל של קנזס בהתבסס על המסכים שלנו כל הגנום eSGA, הצמיחה של המוטציה המסוימת הזה היא הקרוב ביותר לטבע סוג BW25113 והוא משמש אפוא כביקורת גבולות.
5. לגדל את זני מערך ed כמו גם JW5028 תרבות הלילה ב 32 ° C עם 190 סל"ד מסלולית הרועדים לOD של ~ 0.4-0.6 ב 600 ננומטר. לאחר הצמיחה בין הלילה, למלא את בארות גבול עם כ 80 μl של תרבות לילה JW5028.
6. הצלחות נאספו עשויות לשמש בשלב 3.2. לחלופין, עבור אחסון לטווח ארוך, להשלים זה את זה היטב בצלחות הנמען עם גליצרול 15%, לערבב את התקשורת וגליצרול, ולשמור על הצלחותב-80 ° C.

3. נוהל הזדווגות זנים בצפיפות גבוהה ליצירת ה מוטציות coli כפולות

1. לגדול מתח HFR התורם, הנושא את מוטצית השאילתה, מסומנים בסנטימטר, לילה ב 32 ° C בנוזל עשיר LB-CM (17 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סנטימטרים) עם הרעד ב220 סל"ד.
2. הצמד את אוסף הורה נמען מוטנטי בצפיפות 384 מושבה על צלחות LB המוצקות והשלמה עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של קנזס במקביל, להצמיד את מתח מוטצית תורם השאילתה בצפיפות 384 מושבה על אותו המספר של צלחות LB, בתוספת 17 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סנטימטר. דגירת צלחות הלילה ב 32 ° C.
   הערה: צלחות הנמען המשמשות לנעיצה עשויות לדרוש עד 36 שעות לקבלת מושבות גדולות מספיק לשלבים באים. כאשר גודל מושבת גבול ממוצע הוא בערך 2 מ"מ בקוטר (או יותר), הצלחות מוכנות לצמיד.
3. כדי להטות את הזנים, להצמיד את התורם מצלחת תורם לילה 384 במושבהלצלחת LB מוצקה. לאחר מכן להצמיד צלחת נמען יחידה 384 מעל מושבת התורם טרי הצמיד על הצלחת הצמידה. המשך מצמיד עד שכל צלחות תורם הנמען היו מצומדת על ידי מצמיד על צלחות צמיד LB מוצקות. דגירת צלחות צמיד הצמיד ב 32 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
   הערה: זנים תורמים אדם אחד מוטציה עשויים להראות שונות גנטיות לגן ביעילות זיווג בגלל ההשפעות הפוטנציאליות של מוטציות על נטייה, היעיל העברת DNA, או הכושר. צמיחה יכולה להיעצר בכל זמן שבין 16 ו 24 שעות, כאשר מושבות גדולות מספיק הושגו לצעדים משפדים באים. Conjugations שנמשך 16-24 שעות לייצר כמות מספקת של תאים צמודים-לשעבר לתוצאות eSGA לשעתק גם למוטציות של גנים המאוחרות העברה או מוטציות בעלי כושר נמוך במקצת.
4. הצמד כל צלחת הצמידה 384 בצפיפות על צלחת אחת מוצקה LB, המכילים סנטימטרים (17 מיקרוגרם / מ"ל) וקאן (50מיקרוגרם / מ"ל) עד ​​שכל צלחות צמידה כבר נצח. דגירת צלחות הבחירה הראשונה טרי הוצמדה ל- 16-36 שעות ב 32 ° C.
   הערה: בכל קשורים לצעדי הבחירה, כמויות שונות של זמן שתידרשנה למסכים תורמים שונים. מאז כל המוטציות הכפולות במסך נתון יש את אותה מוטציה תורמת, בממוצע, מוטציה תורמת גוברת איטית מעוררת מוטנטים כפולים נעשו אטי. לכן, בהתאם לכושר התורם, עשויים לדרוש צעדי בחירה בין 16 ו -36 שעות. צמיחת המוטציה הכפולה ניתן לעצור כאשר מוטנטים הכפולים הם גדולים מספיק לשלב הבא או מצמיד לאחר הבחירה או ההדמיה הראשונה אחרי השנייה. זה בדרך כלל מתרגם לתחום מושבות בקרה בממוצע עם לפחות 2 קטרי מ"מ.
5. Re-להצמיד כל צלחת בחירה הראשונה על תרופה שנייה, כפולה (סנטימטר וקאן), צלחת בחירה בפורמט 1536-מושבה, באופן שכל מושבת בחירה הראשונה מיוצגת על ידי ארבע מושבות עלצלחת הבחירה השנייה. דגירת הצלחות עבור 16-36 שעות ב 32 ° C. צלם את צלחות בחירה הסופיות כפולות מוטצית כמותית למדוד את כושר הצמיחה של המוטציה ולנתח את האינטראקציות בין הזוגות של גנים (איור 3).
   הערה: למרות שהתדירות של merodiploidy (כפילויות כרומוזומליות חלקיות) היא נמוכה בכ 1/1, 000 תאים ^24, merodiploidy יכול להסוות במערכת העיכול. לפיכך, אנו ממליצים לכלול ביולוגיים משכפל בכל מסכים eSGA. למרבה המזל, ניתן לעשות שימוש חוזרים צלחות חד פעמיות מסחריות ורפידות משפדות פלסטיק עד שלוש פעמים על ידי חיטוי החומרים כדלקמן: אגר מהצלחות נמחקת והצלחות, כמו גם הרפידות מעוקרות על ידי טבילתם באקונומיקת 10% בין הלילה, ואחריו לשטוף עם מים מזוקקים, שטיפה באתנול 70%, וייבוש באוויר-plasticware בברדס זרימה באור אולטרה סגול. הרפידות והצלחות סטריליות מאוחסנות בשקיות פלסטיק סטריליים אטומות עד שימוש.

4. עיבוד נתונים ונובעים ציונים במערכת עיכול

1. מדוד את המושבות על כל צלחת במצב יצווה או בנפרד באמצעות תוכנה מיוחדת מושבת הדמית ^{3, 9.}
   הערה: הדמיה מתאימה מבוססת ג'אווה תפוקה גבוהה מושבה ויישום ניקוד היא כעת זמין באופן חופשי לציבור גישה (http://srcollins77.users.sourceforge.net/). התוכנה עובדת על פלטפורמות שונות (כלומר Mac או PC) ויכולה להיות משוגר גם כקובץ הפעלה או מחלון מסוף.
2. לנרמל את מדידות גודל מושבת גלם על ידי תיקון להטיות שיטתיות בתוך ובין צלחות כגון אפקטי צלחת קצה, אפקטי וריאצית לוחיות בין תמונה לא אחידה, תאורה, חפצים עקב עקמומיות פיזית של המשטח אגר, אפקטי תחרות למושבות שכנות ופגמים משפדים אפשריים , כמו גם הבדלים בזמן הצמיחה p> 9. ממצאים שיטתיים אלה אינם תלויים בכושר המוטציה הכפול וצריכים לתקן כפי שהם מעוררים הערכות כושר צמיחה מזויפות.
3. המושבות בשורות ועמודות קצה נוטות להיות גדול יותר בשל תחרות נמוכה יותר לחומרים מזינים מנמצא במרכז הצלחת. לכן, כדי לתקן את האפקט הזה, מטפס על הגדלים של מושבות קצה כדי להיות כזה שהגודל החציוני באותה שורה או עמודה שווה לגודל החציוני של המושבות במרכז הצלחת.
4. לנתח את התוצאות סטטיסטיות כדי לקחת בחשבון את השחזור ואת השונות הסטנדרטיות מהגדלים החציוני של מדידות המושבה לשכפל. לפחות שלושה ניסויים לשכפל ביולוגיים עצמאיים הם צורך להעריך שחזור ניסיוני.
5. לבסוף, השתמש בגדלים המנורמלים חציון מושבת צמיחת הכושר לייצר ניקוד GI (S) עבור כל זוג גן תוך שימוש בנוסחא הבאה:

n 1 "src =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
איפה, S = _var (var _Exp x _(Exp n -1) + var _המשך x (n _המשך -1)) / _(Exp n + n _המשך -2); var _Exp = השונות המרביות של גדלי המושבה המנורמלות ל מוטציה כפול; _המשך var = חציון של הסטיות בגודל המנורמל הכפול מוטצית מושבה מקבוצת ההתייחסות; _Exp n = מספר המדידות של גדלי מושבת מוטציה כפולים, n = _המשך חציון המספר ניסויי משכפל על כל הניסויים; _Exp μ = גדלי חציון מנורמלים מושבה של מוטנטים הכפולים; _והמשך μ = החציוני של גדלי מושבה מנורמלות לכל המוטציות הכפולות הנובעות מלחץ שמוטצית התורם היחיד. S-הציון משקף גם את הביטחון הסטטיסטי של אינטראקצית digenic משוערת, כמו גם את הכח הביולוגי של האינטראקציה. S-ציונים חיוביים חזקים מצביעים על השפעות הקלה, suggesting שגני האינטראקציה להשתתף באותו המסלול ^9, ואילו שליליים משמעותי S-ציונים משקפים מחלה או קטלני, אשר לעתים קרובות מרמז על חברות במסלולים מקבילים יתירים ⁹ סינטתית. לקביעת יחסים הפונקציונליים מסלול ברמה, S-ניקוד אחת עבור כל זוג של גנים שנבדקו מופק ממאגר הנתונים הסופיים.
הערה: במחקרנו הקודם ^9, מצא כי רקומבינציה נוטה להתרחש בתדירות נמוכה יותר בין הגנים בתוך 30 KBP אחד על השני. לכן, לניתוח במורד הנחל, לאחר נורמליזציה ודור ציון, אנו מסירים את האינטראקציות בין הגנים בתוך 30 KBP אחד על השני. בנוסף לחיילים עצמם, יחסים פונקציונליים בין זוגות של גנים יכולים להיחקר על ידי התבוננות במידת השוני בין פרופילי מערכת העיכול של שני גנים. פרופיל GI של גן הוא הקבוצה של כל האינטראקציות של גן, כי עם כל שאר הגנים בגנום מחוץאזור ההצמדה של הגן. גנים דומים פונקציונליים נוטים להיות מתאם גבוה יותר של פרופילים גנטיים אינטראקציה ^{12, 25.} לכן, על ידי חישוב מקדמי מתאם לכל הגנים במערך הניסויי אחד יכול להשתמש eSGA לחקר יחסים פונקציונליים אפילו בין הגנים השוכבים קרוב זה לזה על הכרומוזום.

תוצאות

GIs reveal functional relationships between genes. Similarly, since genes in the same pathway display similar GI patterns and the GI profile similarity represents the congruency of phenotypes, we can group functionally related genes into pathways by clustering their GI profiles. Integrating GI and GI correlation networks with physical interaction information or other association data, such as genomic context (GC) relationships can also reveal the organization of higher-order functional modules that define core bio...

Discussion

נציין פרוטוקול צעד חכם לשימוש בהקרנת eSGA רובוטית לחקור פונקציות גני חיידקים ברמת מסלול על ידי חוקר במערכת עיכול. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור גנים בודדים, כמו גם מערכות ביולוגיות שלמות בE. coli. זהירות ביצוע צעדי הניסוי שתוארו לעיל, כולל את כל הבקרות המתאימות, וקפדנו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibiotics
Chloramphenicol	Bioshop	#CLR201
Kanamycin		#KAN201
Ampicillin		# AMP201
2. Luria-Bertani medium
LB powder	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Bacterial Strains and Plasmids
Hfr Cavalli strain λred system (JL238)	Babu et al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli F- recipient collection	National BioResource Project (NBRP) of Japan11
Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains	Open biosystems; Babu et al.14
4. Primers
pKD3-based desalted constant primers			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
Desalted custom primers			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'
Desalted custom primers			F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site
5. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Boric acid	Sigma	# T1503-1KG
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# B6768-500G
DNA ladder	NEB	#N3232L
6. DNA isolation and Clean-up Kits
Genomic DNA isolation and purification kit	Promega	#A1120
Plasmid Midi kit	Qiagen	# 12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning
Thermal cycler	BioRad, iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter
32 °C shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
RoToR-HDA benchtop robot	Singer Instruments
96, 384 and 1,536 pin density pads	Singer Instruments
96 or 384 long pins	Singer Instruments
8. Imaging Equipments
Camera stand	Kaiser
Digital camera, 10 megapixel	Any Vendor
Light boxes, Testrite 16" x 24" units	Testrite
9. Pads or Plates Recycling
10% bleach	Any Vendor
70% ethanol	Any Vendor
Sterile distilled water	Any Vendor
Flow hood	Any Vendor
Ultraviolet lamp	Any Vendor
10. Labware
50 ml polypropylene tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	# 29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	# 366052
Cryogenic vials	VWR	# 479-3221
Rectangular Plates	Singer Instruments
96-well and 384-well microtitre plates	Singer Instruments	Nunc
Plate roller for sealing multi-well	Sigma	#R1275
plates	ABgene	# AB-0580
Adhesive plate seals	Fisher Scientific	# 13-990-14
-80 °C freezer	Any Vendor