מכרסם איי הערכת שכפול של התא פונקציה בטא Adenovirally-transduced מבודדים

Summary

פרוטוקול זה מאפשר לזהות את הגורמים לווסת את תפקודי התא המוני ביתא למצוא מטרות טיפוליות אפשריות לטיפול בסוכרת. פרוטוקול מורכבת השיטה יעילה להעריך איון שכפול של התא פונקציה בטא עכברוש איים מבודדים בעקבות מניפולציה של ביטוי גנים עם adenoviruses.

Abstract

הומאוסטזיס הגלוקוז נשלטת בעיקר על ידי אינסולין האנדוקרינית ההורמונים גלוקגון, המופרש מן הלבלב ביתא מתאי אלפא, בהתאמה. מסת התפקוד תא הבטא נקבעת על ידי מסת תאים אנטומי בטא, כמו גם את יכולתם של תאים בטא להגיב עומס התזונתי. אובדן מסת בטא תפקודית תא מרכזי שני צורות עיקריות של סוכרת ^1-3. ואילו ירידה תפקודית תאים בטא תוצאות המונית התקפה אוטואימונית סוכרת מסוג 1, סוכרת מסוג 2, הפחתה זו מפתחת גם מחוסר היכולת של תאים בטא להפריש אינסולין כראוי והרס תאים בטא מתוך קאדר של מנגנונים. לפיכך, המאמצים לשקם תא תפקודית המוני ביתא הם עליונה לטיפול טוב יותר ותרופות פוטנציאל לסוכרת.

נערכים מאמצים לזהות מסלולים מולקולריים, שניתן לנצלן כדי לעורר את השכפול ולשפר את תפקוד תאים בטא.באופן אידיאלי, מטרות טיפוליות תשפר גם את גדילת התאים לתפקד בטא. אולי חשוב יותר אף היא לזהות אם האסטרטגיה מעורר צמיחת תאים בטא מגיע במחיר של תפקוד התא ופגיעה בטא (כמו עם אונקוגנים מסוימים), ולהיפך.

על ידי ביטוי בדיכוי שיטתי או overexpressing של גני מטרה של איים מבודדים חולדה, אפשר לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל הגדלת מסת תאים פונקציונלית בטא ^4-6. וקטורים adenoviral יכול להיות מועסק על חלבונים overexpress ביעילות או מציאה של איים מבודדים ^4,7-15 חולדה. כאן, אנו מציגים שיטה לתפעל ביטוי גנים ניצול התמרה adenoviral ולהעריך איון שכפול של התא פונקציה בטא עכברוש איים מבודדים (איור 1). בשיטה זו נעשה שימוש בעבר כדי לזהות מטרות חדשות, כי לווסת את שכפול התא בטא או פונקציה ^{5,6,8,9,16,17.}

Protocol

1. פרידמן וקיבל הד עולמי culturing adenoviral של איי עכברוש

1. הכן 6-גם רקמת לא הצלחת התרבות מצופה על ידי הוספת 2 מ"ל של התקשורת (RPMI 1640 Media המכילים גלוקוז 8 מ"מ, 10% בסרום שור עוברית, 50 יחידות למ"ל פניצילין, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין) למספר הנדרש של וולס. לדוגמה, בניסוי טיפוסי עשוי לדרוש משלוש בארות - אחד עבור כל וירוס, בקרת וירוס (למשל, ה-GFP-להביע adenovirus), וכן קבוצת הניסוי.
2. לחמם את הצלחת כדי 37 מעלות צלזיוס ידי הצבתו בתוך רקמת התרבות בחממה דקות לפחות 30.
3. מיד לאחר איון עכברוש בידוד ^18,19, במקום 100-200 איים לתוך בארות בודדים של צלחת רקמות בלתי-6-גם תרבות מצופה. איים שישים נדרשים עבור הפרשת אינסולין ההתאגדות מבחני תימידין. איים הנותרים ניתן להשתמש לצורך בידוד RNA לביטוי מחקרים גנטיים או בידוד חלבון עבור immunoblotting.

[הערה: מכאן ואילך, בצע פרוטוקולים מוסדיים לטיפול, שימוש וסילוק של חומרים ביולוגית מסוכנת.]

4. מערבולת בעדינות את הצלחת להביא את איים למרכז גם.
5. פיפטה adenovirus ישירות על גבי איים במרכז צלחת. השתמש 100-500 multiplicities של זיהום (משרד הפנים, היחס בין התאים היעד ל פלאק יוצרי יחידות ויראלי).
6. תן את שאר איים דקות 5.
7. מניחים את הצלחת התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).
8. לאחר 24 שעות, מערבולת בעדינות את הצלחת להביא את איים למרכזי הבארות ולהעביר את איים באמצעות micropipette P200 ל באר חדשה ובה התקשורת טריים. אם איים להתקשר לצלחת, הם יכולים להיות וחילצה בעדינות עם קצה פיפטה.

[הערה: כדי לוודא efficien התמרה נאותהסי, את השימוש של ה-GFP השליטה וירוס ביטוי מועיל, כמו איים לאחר מכן ניתן צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal לאמת את חדירת adenovirus לתוך הליבה איון.]

9. תרבות איים עבור שעות נוספות 24-72, תלוי העיתוי הרצוי של הניסוי ממחקרים טייס אופטימיזציה. כך, למשל, אינדוקציה של תגובת שגשוג עשוי לדרוש הזמנים החל 24-72 שעות או מציאה של הגן של עניין עשוי לדרוש 48 או 72 שעות. להעביר את איים למדיה טריים מדי יום.
10. עבור H 24 הסופי של הניסוי, תרבות איים בתקשורת המכילים 1 μCi ^[מתיל-3 H] -thymidine/ml התקשורת (בדרך כלל 1 μl תימידין / מ"ל התקשורת).

[הערה: מכאן ואילך, בצע פרוטוקולים מוסדיים לטיפול, שימוש וסילוק של חומרים רדיואקטיביים.]

2. הפרשת אינסולין Assay

1. להכין אתassay הפרשת חיץ (SAB) פתרון המניות 10X (1.14 M NaCl, KCl 47 מ"מ, 12 מ"מ KH ₂ PO _4, 11.6 mM MgSO ₄₎ ו - CaCl ₂ פתרון המניות 100x (0.25 מ 'CaCl _2). פתרונות אלו המניות עשוי להיות מוכן מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר.
2. טרי להכין 50 מ"ל של SAB עבודה (5 מ"ל של SAB 10X, 1 מ"ל של 1 HEPES M, 0.5 מ"ל של 100x CaCl _2, 0.28 מ"ל של BSA 35%, 0.11 גרם NaHCO _3, מים סטריליים עד 50 מ"ל) ב 50 מ"ל חרוטי הצינור חמים 37 ° C על ידי הצבת ב 37 ° C waterbath.
3. פיפטה 10 מ"ל של SAB עבודה לתוך צינור של 15 מ"ל חרוטי ולהוסיף 66.8 μl של 2.5 גלוקוז-D M להכין גלוקוז גבוהה (16.7 mM) SAB.
4. הוסף 44.8 μl של 2.5 גלוקוז-D M כדי מ"ל 40 הנותרים של SAB לעבוד כדי להכין גלוקוז נמוכה (2.8 מ"מ) SAB.
5. שלושה תווית 1.7-מ"ל microcentrifuge צינורות עבור כל אחד גם צלחת 6-גם ולהוסיף 1 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).

[הערה: איים הם רדיואקטיבי, בצע פרוטוקולים מוסדיים לטיפול, שימוש וסילוק של חומרים רדיואקטיביים.]

6. מניחים 20 איים לתוך צינור אחד microcentrifuge. נעשה כל ניסיון להוסיף איים בגודל comparably לצינור כל microcentrifuge. כך, למשל, צינור זה עשוי להכיל 5 בינוני, קטן, 10 ו -5 גדולה בגודל איים (ראה איור 1).

[הערה: איי ניתן דמיינו באמצעות אחת stereoscope לנתח או מיקרוסקופ רגיל.]

7. לאחר איים התיישבו על החלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה (~ 2 דקות), לשאוב PBS עם micropipette וזורקים.

[הערה: כחלופה ליישוב על ידי כוח המשיכה, את הצינורות ניתן centrifuged ב XG 300 דקות 1.]

8. על דגירה מראש, הוסף 400 μl של Glu נמוכהcose SAB, למקם את צינורות (עם כובעי שלהם פתוח) אל התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2), מראש דגירה של 60 דקות. Aspirate מראש הדגירה גלוקוז SAB נמוך וזורקים.
9. על הפרשת האינסולין הבזאלי, הוסף 400 μl של גלוקוז SAB נמוך, למקם את צינורות (עם כובעי שלהם פתוח) אל התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2), דגירה של 60 דקות. איסוף SAB גלוקוז נמוכה ולשמור על radioimmunoassay אינסולין.
10. על הפרשת אינסולין מגורה, הוסף 400 μl של SAB גלוקוז גבוהה, למקם את צינורות (עם כובעי שלהם פתוח) אל התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2), דגירה של 60 דקות. איסוף SAB גלוקוז גבוהה ולשמור על radioimmunoassay אינסולין.

3. התאגדות תימידין Assay

1. הוסף 1 מ"ל PBS, לאחר איים התיישבו על החלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה, לשאוב PBS עם micropipette, למחוק, ולחזור על זהלדרוך פעם אחת.
2. הוסף 500 μl קרח קר חומצה Trichloroacetic (TCA, 10% w / v) ו - דגירה על קרח למשך 30 דקות.
3. בצנטריפוגה צינורות ב 000 XG 16 דקות 3 על 4 ° C.
4. Aspirate TCA, הוסף 80 μl של 0.3 N NaOH, ו דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, מערבולת במרץ דגימות של 5-10 עבור כל 10 דקות.
5. הוסף 4 מ"ל של קוקטייל Econo כספת לספור עד 7 מ"ל נוזל צינורות נצנץ הספירה.
6. הוסף 50 μl של המדגם כדי צינור הנצנץ ספירה, מכסה את הצינור, ללחוץ בקצרה, ולספור על הדלפק נצנץ נוזלי.
7. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות חומצה assay bicinchoninic (BCA) ו - 10 μl של מדגם לפי הפרוטוקול של היצרן.

4. ניתוח נתונים

1. בצע radioimmunoassay אינסולין בעקבות פרוטוקול של היצרן.
2. לנרמל את הפרשת האינסולין ושילוב נתונים תימידין קונצרט כלשהו עם חלבוןentration.

5. נציג תוצאות

למשל הניסוי להעריך איון שכפול של התא פונקציה בטא איים חולדה מוצג באיור 2. דוגמה זו מראה כי overexpression adenoviral של "גן # 6" היפותטית וחסונה מגרה שכפול איון מבלי לשנות את תפקוד התא בטא. בלוח העליון, התוצאות assay שילוב תימידין להוכיח כי הגברת הביטוי של "גן # 6" מגביר סינתזה של DNA, כפי שנמדד על ידי שילוב של תימידין. כי רוב התאים איון עכברוש הם תאים בטא, סביר להניח כי עלייה זו מצביעה על שילוב תימידין עלייה שכפול התא בטא. עם זאת, ניסויים מאשרות יש לבצע ביסוס זה. בלוח התחתונה, התוצאות assay הפרשת אינסולין להוכיח כי ביטוי יתר של "גן מס '6" לא שינה אחד התפקידים העיקריים תא בטא, כלומר, אניnsulin על הפרשת גלוקוז נמוך וגבוה. איכות הבידוד איון והבריאות של איים בעקבות טיפול adenoviruses מצוין על ידי עלייה של פי הפרשת אינסולין בריכוזים גלוקוז נמוך וגבוה. אם מגדילים את ביטוי "# 6 ין" תפקוד לקוי תא הבטא, זה עלול לבוא לידי ביטוי כמו ירידה האינסולין מופרש על ריכוזי גלוקוז גבוהות, גירוי (16.7 mM). עקומת מנה תגובה עבור ריכוזים שונים הגלוקוז יכולה גם להתבצע.


באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול להעריך שכפול איון ותפקוד התא בטא עכברוש איים מבודדים בעקבות adenoviral בתיווך שינויים בביטוי הגנים. איים מבודדים עכברים שזה עתה נחשפים adenoviruses במשך 24 שעות ולאחר מכן בתרבית עד 96 שעות. שילוב תימידין מוערך ב 24 שעות הסופי, ואחריו המדידה של הפרשת אינסוליןנמוך וגבוה גלוקוז.


איור 2. תוצאות הניסוי באמצעות adenovirus מלאה adenovirus overexpressing גן היפותטי שכותרתו "גן # 6". הפאנל העליון מציג שילוב תימידין ואת הפאנל התחתון הפרשת אינסולין.

Discussion

מסלולים הקובע כי יכול להיות מאופנן כדי לעורר את השכפול ולשפר את תפקוד תאים בטא רלוונטיים בשתי צורות עיקריות של סוכרת. בגלל המסה התפקודית תא בטא תלויה בקיומו והתפקוד של האינסולין בתאים, להערכת הגורמים הללו בעת ובעונה אחת יש יתרונות משלה. פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול יעי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
RPMI 1640 התקשורת	Gibco	11879
פניצילין / סטרפטומיצין	Gibco	15140
6 גם צלחת	BD-Falcon	35-1146	Non-TC טיפול
[מתיל H-3], תימידין	פרקין אלמר	NET027Z001MC	1 mCi / ml
מיקרו צנטריפוגות צינורות	Denville	C2170	1.7 מ"ל
NaCl	סיגמא	59888
KCl	Acros	42409
KH 2 </ Sub> PO 4	Acros	20592
MgSO 4	Acros	41348
CaCl 2	Acros	34961
HEPES	סיגמא	H0887	1 M פתרון
35% BSA	סיגמא	A7979
NaHCO 3	Acros	42427
D-גלוקוז	סיגמא	G8769
TCA	פישר סיינטיפיק	SA9410-1	10% w / v
NaOH	Acros	12426
נצנץ לספור צינור	Sarstedt	58.536	7 מ"ל, PP
ספירת נצנץ צינור כובע	Sarstedt	65.816
Econo-Safe לספור קוקטייל	RPI	111175
אינסולין RIA	סימנס	TKIN2
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	23250
			ציוד
סרכזת	Eppendorf	5415R
נצנץ לספור מתלה צינור	Sarstedt	93.1431.001
נצנץ נוזלי נגד	פרקין אלמר	Tri-Carb 2910TR