Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

Summary

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Abstract

הגילוי של גזע עצבי ותאי אב (תאים מבשרים עצביים המכונים באופן קולקטיבי) (NPCs) במוח של יונקי הבוגרים הוביל לגופו של מחקר שהמטרה תוך ניצול תכונות multipotent ושגשוג של תאים אלו לפיתוח אסטרטגיות neuroregenerative. צעד קריטי להצלחה של אסטרטגיות כאלו היא התגייסות NPCs לכיוון אתר נגע לאחר השתלת אקסוגני או כדי לשפר את התגובה של מבשרי אנדוגני הנמצאים באזור periventricular של מערכת העצבים המרכזיים. בהתאם לכך, הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים שמקדמים, להדריך, ולשפר את הגירת NPC. העבודה שלנו מתמקדת בניצול של שדות חשמליים של זרם ישירים (dcEFs) לקידום והגירת NPC ישירה - תופעה הידועה בgalvanotaxis. שדות חשמליים פיסיולוגיים אנדוגניים לתפקד כרמזים קריטיים לנדידת תאים במהלך התפתחות תקינה ותיקון פצע. שיבוש תרופתיפוטנציאל צינור טרנס עצבי בעוברי האמביסטומה גורם מומים התפתחותיים חמורים ^1. בהקשר של ריפוי פצע, קצב התיקון של קרנית פגועה מתואם ישירות עם סדר הגודל של פוטנציאל פצע אפיתל שמתעורר לאחר פציעה, כפי שמוצג על ידי שיפור או שיבוש תרופתי של ^2-3 dcEF זה. אנחנו הוכחנו כי NPCs subependymal המבוגר לעבור הגירת cathodal מהירה וביים במבחנה, כאשר נחשף לdcEF לשימוש חיצוני. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות של המעבדה שלנו ליצירת assay galvanotaxis פשוט ויעיל לרזולוציה גבוהה, תצפית ארוכת הטווח של טרנסלוקציה ביימה תא בגוף (נדידה) ברמת תא בודד. assay זה יהיה מתאים לחוקר את המנגנונים המווסתים את תמרת dcEF לתנועתיות סלולרית באמצעות השימוש בעכברים מהונדסים או נוקאאוט, RNA התערבות הקצר, או אגוניסטים הקולטן ספציפיים / יריבים.

Protocol

כל ההליכים כרוכים בטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טורונטו ועדת טיפול בבעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיות (פרוטוקול לא. 20009387). השיטות הבאות יש לבצע באמצעות כלים וטכניקות סטריליות, במכסת מנוע זרימה למינרית היכן שאפשר.

בטקסט הפרוטוקול להלן, הביטוי "EFH-SFM" מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת עם גורם צמיחה אפידרמיס, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי והפרין. EFH-SFM משמש כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs עבר התמיינות בגלל mitogens אלה לשמור NPCs ^ב4 המדינה המובחנות שלהם. כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs המושרה להתמיין לסוגי תאים בוגרים, "FBS-SFM" מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת סרום שור עוברי 1%. FBS מקדם את הבידול של NPCs לפנוטיפים בשלים עצביים ^5.

1. בידוד ותרבות של מבשרים עצביים (לאשמוצג בסרטון)

1. לטשטש CD1 עכבר (6-8 שבועות) עם isofluorane והקרבה באמצעות פריקת צוואר רחם.
2. לכבות את הראש באתנול 70% ולערוף את החיה במספריים חדים נתיחה.
3. בעוד מחזיק את הראש עם מלקחיים כירורגיים, הסר את העור על פני שטח הגבו לחשוף את הגולגולת.
4. באמצעות אזמל ולא. 11 להב, להבקיע את הגולגולת בסינוס המצח לאורך ציר mediolateral, וגם לאורך תפר sagittal בכיוון rostrocaudal.
5. מקלף את העצמות הקודקודית מהראש ללא. 7 מלקחיים מעוגלים, נזהרים שלא לנקב את רקמת המוח.
6. הכנס מרית דקה מתחת למוח מתחיל מתחת למוח הקטן והתקדם לעבר נורות חוש הריח. בעוד מחזיק את הגולגולת במקום עם מלקחיים, משוך בעדינות את המוח מהגולגולת ולמקם אותו באופן מיידי בנוזל השדרתי מלאכותי קר כקרח (ראה מתכונים בהמשך).
7. תחת מיקרוסקופ נתיחה, באמצעות סטרילימספריים ומלקחי נתיחה יחתכו את המוח במחצית לאורך קו האמצע. סובב אונה כל כך שהמשטח המדיאלי (חתך) פונה כלפי מעלה.
8. בחר חצי כדור, ועם פני השטח המדיאלי פונים כלפי מעלה, אתר splenium של כפיס המוח (אזור אחורי של כפיס המוח).
9. עושה חתך מפני השטח של קליפת המוח לsplenium של כפיס המוח לאורך ציר dorsoventral.
10. קולף את הקליפה החרוטה כלפי נורת הריח לחשוף את הקירות המדיאלי וצדדיים של חדר הצדדי.
11. סובב את הכדור, כך שהמשטח הגבה פונה כלפי מעלה, ולהשתמש microscissors המעוגל לגזור ולאסוף את הקירות החשופים המדיאלי וצדדיים, שמכילים את האזור שבו periventricular NPCs מתגורר ^6.
12. חזור על שלבים 1.8-1.11 לאונה השנייה.
13. פיפטה הרקמות המבודדות ל7 מ"ל של פתרון טריפסין (ראה מתכון בהמשך) בצינור סמ"ק 15, ולמקם את הצינור על כיסא נדנדה ב37 מעלות צלזיוסחממה על 25 דקות.
14. צנטריפוגה הצינור ב1500 סל"ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ורקמות ב2 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין (ראה מתכון בהמשך).
15. עדינות triturate רקמות עם 30-50 פעמי פיפטה קטנות קידוח פסטר בזהירות כדי להימנע מבועות אוויר.
16. צנטריפוגה הצינור ב1500 סל"ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend וב1-2 מ"ל של SFM (ראה מתכון בהמשך) על ידי triturating הגלולה 3-5 פעמים.
17. צנטריפוגה הצינור ב1500 סל"ד ל3 דקות, לשאוב 1 מיליליטר supernatant ו resuspend בSFM + EFH.
18. ספירה לחיות צפיפות תאים עם haemocytometer וצלחת התאים בבקבוק תרבות T25 בצפיפות של 10 תאים לμl בSFM + EFH.
19. הרשה התרבות לצמוח במשך 7 ימים ללא הפרעה להניב neurospheres העיקרי צף מורכב מNPCs.

2. הכנת Galvanotaxis הקאמרית

1. הנח זכוכית מרובעת 3 לא. 1 תלושי כיסוי (22 x 22 x 0.17 מ"מ) אניבקבוק na של 6N חומצה הידרוכלורית בן הלילה.
2. למחרת, השתמשו יהלום קצה של כוס מחתך לחתוך 6 רצועות מלבניות (22 X 5 X 0.17 מ"מ) של זכוכית מלא מרובע. 1 תלושי עטיפה.
3. להעביר את התלושים המרובעים חומצה השטופות וחוטרים מלבניים למכסת מנוע זרימה למינרית. שוטף את הרצועות הראשונות עם אתנול 70% המלבניות ומרובעות, עם מי autoclaved תרבות כיתת רקמות, ולאפשר לו להתייבש על קים נגב (על סטריליות הוסיפה, הזכוכית ניתן לאפשר לו להתייבש באוויר).
4. למרוח משחת ואקום להיקף של פני שטח באחת שקופיות הזכוכית המרובעות, ולאטום אותם לבסיס של 60 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ.
5. למרוח משחת ואקום לאורך הציר הארוך של משטח אחד מרצועות הזכוכית המלבניות, ולאטום אותם לקצוות שונים של שקופיות הזכוכית המרובעות (כזה שהם מקבילים זה לזה) על מנת ליצור שוקת מרכזית.
6. UV-לעקר את התאים לפחות 15 דקות במכסת מנוע הזרימה למינרית.
7. 250-300 μl פיפטה של ​​פולי-L-lysiנה אל השוקת המרכזית של התאים ולדגור על טמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
8. כ 15 דקות לפני תום תקופת הדגירה, להכין פתרון Matrigel (ראה מתכון בהמשך).
9. לשאוב פולי-L-ליזין, לשטוף את השקתות המרכזיות עם 1 מיליליטר מי autoclaved, ו250-300 μl פיפטה של ​​פתרון Matrigel אל השקתות המרכזיות.
10. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
11. לשאוב את פתרון Matrigel ולשטוף בעדינות את השקתות המרכזיות עם 1-2 מ"ל של SFM.
12. 100 μl פיפטה של ​​EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות ולהעביר את תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה.
13. מיליליטר פיפטה 3-4 מתרבות neurosphere המכילה לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ ולהעביר את צלחת פטרי לבמה של המיקרוסקופ הספירה.
14. במטרת צפייה של 5x, השתמש P10 פיפטה להעביר 5-8 neurospheres השלם (עד 4 בכל פעם) אל השוקת המרכזית של כל אחד galvanotaxisתא ללא dissociating, ולהפיץ את neurospheres סביב השוקת המרכזית בזהירות מבלי לשבש את מצע Matrigel.
15. הוסף 150-200 μl נוסף של EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות.
16. העברת תאי galvanotaxis ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 100% חממת humidified ל17-20 שעות (אם הניתוח עבר התמיינות NPCs) כדי לאפשר neurospheres לדבוק במצע Matrigel ולנתק לתאים בודדים, כפי שמוצג באיור 1 . אם ניתוח NPCs בדיל, תקופת הדגירה צריכה להיות מורחבת ל69-72 שעות כדי לאפשר ההתמיינות של התאים.

3. חי הדמית תא זמן לשגות

1. אפשר למערכת הדמית התא החייה לאזן על 37 מעלות צלזיוס, CO ₂ למינימום של 30 דקות לפני התחלת הקלטת זמן לשגות% 5.
2. לחתוך שתי חתיכות 12 סנטימטר של 1 מ"מ קוטר חוט כסף, סלילם מקצה אחד, ולמקם אותם באקונומיקה ביץ ל20 דקות כדי ליצור אלקטרודות Ag / AgCl.
3. העברת תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה ובחר שחדר ישמש לניתוח הגירת הדמיה חי תאים בהתבסס על הקריטריונים הבאים: א) את neurospheres צריכה להיות כמעט ניתק לחלוטין לתאים בודדים וii) התאים אמורים להחזיק מורפולוגיות עגולות עם מעט-to-אין תהליכים המשתרעות מגופי התא.
4. העברה הקאמרית galvanotaxis נבחר לתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, יחד עם כיכר לא נפרד. תלוש 1 מכסה זכוכית וגריז ואקום.
5. שטוף את הכיסוי להחליק ראשון עם אתנול 70%, ולאחר מכן במי autoclaved, ולהחיל רצועת גריז ואקום בשני קצוות מקבילים של תלוש הכיסוי.
6. לשאוב את תקשורת התרבות מהשוקת המרכזית של החדר, ואז למקם את תגית הכיסוי (גריז בצד פונה כלפי מטה) במהירות על התא כזה ששאר רצועות השומן על שתי רצועות זכוכית המלבניות המקבילות, ביעילות יצירת גגלתא.
7. 100 μl פיפטה של ​​טרי EFH-SFM או FBS-SFM לתוך השוקת המרכזית באמצעות פעולת נימים.
8. השתמש בגריז ואקום כדי ליצור גבולות לברכות של מדיה תרבות בכל קצה של השוקת המרכזית, כפי שמוצג באיור 2.
9. לחתוך שתי חתיכות 15 סנטימטרים של צינורות PVC, ולהשתמש במזרק סמ"ק 10 עם מחט מד 18 להזריק בזהירות פתרון agarose לתוך הצינור, הבטחה ללא בועות נוצרות בצינורות, ולאפשר לג'ל לביסוס למשך 5 דקות.
10. העברה הקאמרית galvanotaxis למערכת הדמית התא החייה, יחד עם agarose ג'ל צינורות, Ag / AgCl אלקטרודות, וזוג 60 מנות מ"מ פטרי ריקות שתשמשנה כתרבות תקשורת והמאגרים יכילו Ag / AgCl אלקטרודות. אפשר הקאמרי galvanotaxis לנוח בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ סביבה ל20-30 דקות.
11. במהלך תקופה זו, להכין את המכסים של 2 צלחות פטרי הריקות והמכסה של צלחת פטרי של galvanotaxis הקאמרי על ידי קידוח חורהאליהם עם כלי Dremel או דומה כפי שמוצג באיור 3.
12. פיפטה 1-1.5 מ"ל של EFH-SFM או FBS-SFM על שני צדי התעלה המרכזית, ו7-8 מ"ל של SFM לכל צלחת פטרי ריקה. מקום פטרי צלחת אחת בכל צד של שוקת של הקאמריים galvanotaxis המרכזית ומקום אלקטרודה אחת Ag / AgCl לכל מנה. לגשר על הפער בין הקאמרי galvanotaxis וצלחות פטרי להקים המשכיות חשמלית עם גשרי agarose ג'ל, כפי שמוצג באיור 4.
13. חבור את האלקטרודות Ag / AgCl לאספקת כוח חיצונית, עם מד זרם בסדרה למדידת זרם חשמלי, ולהפעיל את אספקת החשמל. השתמש ולטמטר למדוד את עוצמתו של השדה החשמלי ישירות מול השוקת המרכזית, ולהתאים את הפלט של אספקת החשמל עד לעוצמת השדה החשמלית הרצויה מושגת (המבחנים שבוצעו במעבדה זו לנצל את כוח dcEF של 250 mV / מ"מ עם זרם חשמלי בין 1 ל 1.5 mA).
14. Initiaטה מודול זמן לשגות במערכת הדמית התא החייה, ולאפשר את הניסוי לרוץ לסכום הרצוי של זמן. לאחר השלים הבדיקה, לתקן את התאים בparaformaldehyde 4% לניתוח immunostaining סטנדרטי.

תוצאות

ניתוח kinematic מגלה כי בנוכחות dcEF 250 mV / מ"מ, NPCs עבר התמיינות תערוכת galvanotaxis ביים והמהיר ביותר לכיוון הקתודה (האיור 5A, סרט 1). בהעדר dcEF, תנועה אקראית של התאים הוא ציין (5B איור, סרט 2). בשדה הכח הזה,> 98% מNPCs עבר התמיינות להגר ל6-8 השעות כל שהם צלמו, ומאחר שתאים מ?...

Discussion

פרוטוקול זה הותאם מהשיטות המבוססות היטב של מחקרים קודמים ^7-9. תאי Galvanotactic ניתן לבנות תוך שימוש במגוון טכניקות שונות, כולל הבנייה של זכוכית נפרדת גם לכליאה של זריעת תא, או באמצעות אבלציה הליזר CO ₂ לmicrofabrication של השוקת המרכזית ^10,11. טכניקות מסוימות עשויות ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שמו של פריט	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
			בידוד תא מבשר עצבי
2M NaCl	סיגמא	S5886	11.688 גרם מומס 100 המ"ל DH 2 O
1M KCl	סיגמא	P5405	7.456 גרם מומס 100 המ"ל DH 2 O
1M MgCl 2	סיגמא	M2393	20.33 גרם מומס 100 המ"ל DH 2 O
155 המ"מ 3 NaHCO	סיגמא	S5761	1.302 גרם מומס 100 המ"ל DH 2 O
גלוקוז 0.5m	סיגמא	G6152	9.01 גר 'מומס ב100המ"ל DH 2 O
108 המ"מ CaCl 2	סיגמא	C7902	1.59 גר 'מומס 100 המ"ל DH 2 O
פניצילין סטרפטומיצין	Gibco	15070
טריפסין לבלב שור	סיגמא	T1005
כבשי אשכי hyaluronidase	סיגמא	H6254
חומצת Kynurenic	סיגמא	K3375
מעכב טריפסין Ovomucoid	וורטינגטון	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
גלוקוז 30%	סיגמא	G6152
7.5% 3 NaHCO	סיגמא	S5761
HEPES 1M	סיגמא	H3375	23.83 גרם מומס 100 המ"ל DH 2 O
L-גלוטמין	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	לשקם ב1 מ"ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl.
FGF	Invitrogen	PHG0226	לשקם ב0.5 מ"ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl.
הפארין	סיגמא	H3149
Apo-transferrin	מו"פ מערכות	3188-AT	0.1 גרם מומס ל 4 המ"ל DH 2 0
פוטרסין	סיגמא	P7505	ממס 9.61 מ"ג לApo-transferrin כךlution
אינסולין	סיגמא	I5500	להמס 25 מ"ג למ"ל של 0.5 0.1N HCl ולהוסיף עד 3.5 מ"ל של DH 2 0
סלניום	סיגמא	S9133
פרוגסטרון	סיגמא	P6149
כלי נתיחה סטנדרטי	כלי מדע פיין
מיקרוסקופ נתיחה	Zeiss	STEMI 2000
			הכנת Galvanotaxis הקאמרית
מגלשות כיסוי זכוכית מרובעות	VWR	16004
6N חומצה הידרוכלורית	VWR	BDH3204-1
גריז ואקום גבוה	Dow Corning
60 מנות מ"מ פטרי	הפישר סיינטיפיק	0875713A
פולי-L-ליזין	סיגמא	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	הפשר וaliquot לתוך 150 יחידות μl
FBS	Invitrogen	10082139	השתמש אך ורק אם תשכנע את בידול NPC, אחרת להשתמש SFM + תקשורת תרבות EFH כפי שצוינה לעיל
ספירת מיקרוסקופ	אולימפוס	CKX41
			חי הדמית תא זמן לשגות
חוט כסף	אלפא Aesar	11434
Ultrapure agarose	Invitrogen	15510-027
החום InactivFBS ated	סיגמא	16140071
צינורות PVC	הפישר סיינטיפיק	80000006	3/32 "מזהה x 5/32" OD
מלבין	Clorox
10 סמ"ק מזרק	BD	309604
מחט מד 18	BD	305195
תרגיל Dremel	Dremel	דגם 750
מיקרוסקופ ההפוך מצויד בתא humidified, דגר	Zeiss	Axiovert-200 מ'
			מתכונים פריט נפח 2M NaCl 6.2 מ"ל 1M KCl 0.5 מ"ל 1M MgCl 2 0.32 מ"ל קוטר 155 מ"מ 3 NaHCO 16.9 מ"ל גלוקוז 1M 1 מ"ל 108 המ"מ CaCl 2 0.09256 מ"ל פניצילין סטרפטומיצין 1 מ"ל מי Autoclaved 74 מ"ל נוזל השדרתי מלאכותי פריט נפח או מסה נוזל השדרתי מלאכותי 30 מ"ל טריפסין לבלב שור 40 מ"ג כבשי אשכי hyaluronidase 22.8 מ"ג חומצת Kynurenic 5 מ"ג <פתרון חזק> טריפסין פריט נפח או מסה SFM 15 מ"ל מעכב טריפסין Ovomucoid 10 מ"ג פתרון אינהיביטור טריפסין פריט נפח מי Autoclaved 37 מ"ל DMEM/F12 10X 10 מ"ל גלוקוז 30% 2 מ"ל 7.5% 3 NaHCO 1.5 מ"ל HEPES 1M 0.5 מ"ל Transferrin, פתרון פוטרסין 4 מ"ל פתרון אינסולין 25 מ"ג 4 מ"ל סלניום 100 & mu, אני פרוגסטרון 100 μl מיקס הורמון (100 המ"ל מוחלט, חנות ב -20 ° C) פריט נפח מי Autoclaved 37.5 מ"ל DMEM/F12 10X (3:1) 5 מ"ל גלוקוז 30% 1 מ"ל 7.5% 3 NaHCO 0.75 מ"ל HEPES 1M 0.25 מ"ל תמהיל הורמון 5 מ"ל L-גלוטמין 0.5 מ"ל פניצילין סטרפטומיצין 0.5 מ"ל הסרום חינם מדיה EFH-SFM: להוסיף 10 μl של EGF, 10 μl של FGF, ו3.66 μl של הפארין FBS-SFM: להוסיף 0.5 המ"ל FBS
פריט	נפח
Matrigel	150 μl
SFM	3.6 מ"ל

פריט	נפח או מסה
Ultrapure agarose	300 מ"ג ב10 המ"ל DDH 2 0
SFM FBS המומת חום	8 מ"ל 2 מ"ל