גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

Summary

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג'נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

Abstract

התפרצויות מגיפה של זני שפעת אלימים ביותר יכולות לגרום לתחלואה ותמותה נרחבות באוכלוסיות אדם ברחבי העולם. בארצות הברית בלבד, ממוצע של 41,400 מקרי מוות ו 1.86 מיליון אשפוזים נגרמים על ידי זיהום בנגיף שפעת בכל שנה ^1. מוטציות נקודתיות בחלבון למקטע 2 הבסיסי פולימראז (PB2) נמצאו קשורה להסתגלות של הזיהום הנגיפי בבני אדם ^2. ממצאים ממחקרים כאלה גילו את המשמעות הביולוגית של PB2 כגורם ארסיות, ובכך מדגישים את הפוטנציאל שלה כיעד תרופה אנטי.

תכנית גנומיקה המבנית אשר נקבעו על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) מספקת מימון לאמרלד ביו ושלושה מוסדות מערב האוקיינוס ​​השקט אחרים שיחד מרכיבים את מרכז ג'נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות (SSGCID). SSGCID מחויבת לספק לקהילה המדעית עם threמבנים חלבוניים דואר ממדי של פתוגנים NIAID הקטגוריה AC. מה שהופך את המידע כזה מבני זמין לקהילה המדעית משמש להאצת תכנון תרופות המבוסס על מבנה.

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי להוביל חדש על ידי מיקוד מסלול או משפחת חלבון כולו. אמרלד יו פיתחה צינור עיבוד מקביל תפוקה גבוהה, רב יעד (MTPP) להגדרת גן למבנה כדי לתמוך בקונסורציום. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים כדי לקבוע את המבנה של מקטע PB2 מארבע זני שפעת שונה.

Protocol

סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

ביולוגיה מולקולרית

1. לבנות עיצוב

השתמש בתוכנת מלחין ג'ין לעצב מבנה חלבון ורצפי גנים סינטטיים מהונדסים קודון. השימוש בתוכנת מלחין ג'ין כבר הציע בפירוט במקום אחר ^3.

1. להשתמש במודול מציג המערך ולבנות מודול העיצוב להשוות יישור רצף חלבון ולהגדיר מבנה חלבון. יישר רצף חומצות האמיניות היעד לשני האלמנטים המבניים היסודיים ו3D מhomologs בנתוני בנק החלבון (PDB), אם הוא זמין (איור 2).
2. השתמש במידע כדי להפוך את יישור עיצובים לבנות מבנה מונחים על ידי בחירת טרמיני החדש המבוסס על שימור של המבנה הראשי ומבני 3D של homologs.
3. עיצוב הוספת PCR (iPCR) וה-PCR (vPCR) amplimers וקטור (מסוף פריימרים).
4. שימוש בגן ​​cאלגוריתם חלבון ל-DNA של omposer, גב לתרגם את רצף החומצות האמיניות לבנות לתוך רצף חומצות גרעין מהונדס קודון.
5. השתמש בטבלת שימוש קודון המתאימה (חתך) כדי לייעל את הרצף לביטוי בE. coli.
6. כמעט לשכפל להכניס לתוך pET28 הווקטור שונה לשלב תג N-מסוף 6x היסטידין וחלבון היתוך Smt3/SUMO המאפשר לטיהור קלה.
7. בצע את הזמנת גן סינטטי עם DNA 2.0 פריימרים ולהזמין ממשולבי טכנולוגיות ה-DNA.

2. פולימראז הארכת שיבוט פריימר שלא הושלמו (צינור)

1. הכן את צבעי יסוד והגנים
   1. צנטריפוגה צלחות היצרן היה פריימרים המכילות ב 1000 סל"ד דקות 1.
   2. להביא לריכוז פריימר 100 מיקרומטר ולהוסיף 50 חיץ TE μl.
   3. לדלל פריימרים ל10 מיקרומטר עם המים deionized (DI) בצלחת V-96, גם תחתונה.
   4. צנטריפוגה גן היצרן היה בצינור 1.5 מ"ל ב1,300 סל"ד דקות 1.
   5. שימוש במאגר TE, להביא את ריכוז ה-DNA של כל צינור עד 50 ng / μl.
   6. בצינורות 1.5 מ"ל, לבצע דילולים של כל צבע יסוד ל10 ng / μl.
   7. פריימרים חנות וגנים ב -20 ° C כאשר אינו בשימוש.
2. הכן הוספת PCR (iPCR)
   1. הפשירי בקבוקון של מיקס מאסטר Pfu על קרח; לשמור על גנים ויחל בטמפרטורת חדר.
   2. יצירת מפת צלחת הקצאת בארות לקבוצה של פריימרים ולבנות.
   3. הוסף 13 μl של מים די לבאר כל צלחת PCR 96, גם.
   4. הוסף 5 μl של קדימה ושל 5 μl פריימר ההפוכה לכל תגובה בצלחת 96 היטב לפי מפת הצלחת, מה שמבטיח לשנות את הטיפים בין כל טוב.
   5. הוסף 2 μl של כל גן באורך מלא שלה מתאים היטב לפי מפת הצלחת.
   6. הוסף 25 μl של תערובת אמן Pfu היטב כל אחד, מה שמבטיח לשנות את הטיפים בין כל טוב.
   7. מחזור את התגובות המשתמשות לתנאים הבאים: PCR
      1. ° C 2 דקות 95

      2. 95 ° C 30 שניות
      3. 50 ° C 45 שניות
      4. 68 ° C 3 דקות
      5. 4 מעלות צלזיוס ∞
   8. חזור על שלבי BD במשך 25 מחזורים.
   9. העבר את 10 μl של כל תגובת iPCR לצלחת PCR 96, גם חדשה.
   10. הוסף 3 μl של צבע עומס 6X לכל דגימה.
   11. הפרד כל דגימה ב% טה EtBr agarose ג'ל 1 ב 110 V ליד סולם הדנ"א סל"ש 100-500 כדי לאשר הגברה שבר.
   12. מוצר iPCR חנות ב -20 ° C כאשר אינו בשימוש (למנוע הפשרת הקפאה עד כמה שניתן).

3. הכן וקטור PCR (vPCR)

1. התחל תרבות הלילה של א 'הפכה coli עם pET28 וקטור פלסמיד.
   1. שני צינורות לחסן 5 מ"ל של מרק 2-יט עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin.
   2. לגדול תרבויות לילה בשעה 37 ° C שבייקר ב 220 סל"ד.
2. ספין למטה תרבויות לאחר צמיחה בין לילה על ידי centrifuging ב -3,000 סל"ד במשך 15 דקות.
3. השתמש QIA Qiagenהכנת ספין Miniprep ערכה לחלץ pET28 וקטור מכדורי חיידקים על פי הוראות היצרן.
4. digestions אנזים הגבלת ההתקנה של חילוץ pET28 פלסמיד.
   1. הוסף 2.2 μl של חיץ BamHI 10X וμl 1 של BamHI וHindIII עד 20 μl של pET28 וקטור.
   2. דגירה תגובה עבור שעה 1 ב 37 ° C.
5. מוצר עיכול נפרד בג'ל.
   1. עיין בשלב 2.2.10.
   2. חותכים להקת וקטור מג'ל ולטהר אותו באמצעות ערכת חילוץ ג'ל QIAquick על פי הוראות היצרן.
6. שימוש NanoDrop, לכמת ריכוז ה-DNA.
7. לדלל לחתוך וקטור עד 10 ng / μl. חנות ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר אינו בשימוש.
8. הכן פריימרים vPCR.
   1. צנטריפוגה oligonucliotides סופק IDT 1 דקות ב1,300 סל"ד.
   2. להביא לריכוז במי DI 100 מיקרומטר.
   3. הכן 10 מיקרומטר דילול של שני פריימרים קדימה לאחור בצינור 1.5 מ"ל.
   4. פריימרים חנות ודילולי פריימר ב -20 ° C.
9. הפשירי מיקס מאסטר Pfu על קרח והפשרת תבנית ופריימרים בטמפרטורת חדר.
10. תגובות vPCR התקנה בצלחת PCR 96, גם:
    1. בשורה הראשונה של צלחת 96 היטב לשלב 60 μl של שני פריימרים vPCR קדימה לאחור ו24 μl של pET28 תבנית מתעכלת (10 ng / μl).
    2. באמצעות פיפטה רבה של 12 טיפ, להעביר 12 μl של פריימר ותערובת אמן תבנית לכל שנותר גם של הצלחת. זה אמור לגרום μl 12 של פריימר ותערובת אמן תבנית היטב בכל הצלחת.
    3. הוסף 13 μl של מים די היטב כל אחד.
    4. הוסף 25 μl של מיקס מאסטר Pfu היטב כל אחד.
11. מחזור את התגובות באמצעות PCR תנאי שימוש בשלב 2.2.7.
12. בריכת כל תגובות vPCR לתוך צינור פלקון 15 מ"ל.
13. ודא הגברה שבר על ידי הפרדת μl 10 של מוצר ה-PCR נקווה על ג'ל (אורך צפוי של pET28 וקטור מתעכלהוא כ 6 KB).
    1. עיין בשלב 2.2.10.
14. היכונו למזג צלחות.
    1. μl Aliquot 3 של מוצר vPCR לבאר כל צלחת V-96, גם תחתונה.
    2. צלחות חנות ב -20 ° C עד מיזוג עם מוצר iPCR.

4. מיזוג iPCR וvPCR מוצרים

1. מוצרי iPCR הפשר וvPCR מראש aliquoted 96, גם למזג צלחת בטמפרטורת חדר.
2. הוסף 3 μl של כל מוצר iPCR לטוב שלו בהתאמה של צלחת המיזוג.
3. להפוך את צלחת מיזוג לעשרה תאים מוסמכים כימי למעלה.
4. הוסף 2 μl של כל תגובה להתמזג לתוך צינור אחד 50 μl של תאים כימיים מוסמכים ידי יצרן ולהמשיך עם הפרוטוקול המצורף של היצרן.
5. הכן תרבויות לילה לכל אחד ממושגים מהפיכת צלחת.
6. מרק Aliquot 5 מיליליטר חפת (עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin) ממאגר סטרילי 25 מ"ל לבאר כל גוש גם עמוק.
7. שימוש Steriטכניקת le, לבחור מושבה מבודדת מכל צלחת שינוי ולחסן גם המתאים של הבלוק גם העמוק.
8. לכסות את הבלוק עם כיסוי Airpore.
9. Shake בלוק ב 220 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
10. תאי גלולה ידי צנטריפוגה לחסום למשך 30 דקות ב 4000 סל"ד.
11. יוצק את supernatant וללטף את החלק העליון של הגוש היבש עם מגבת נייר.
12. מיני הכנה באמצעות מנגנון ואקום Qiagen 96, גם בהתאם להוראות היצרן.

5. הכנת מניות גליצרול של מבנים משוכפלים בהצלחה

1. להפוך את ה-DNA משובט בהצלחה תוקף רצף לBL21 (DE3) כימי תאים מוסמכים בהתאם להוראות היצרן.
2. עבור כל אחד ממושגים, פיק מושבה מבודדת אחת מהשינוי (DE3) BL21 ולחסן לתוך 1 מ"ל של מרק 2-יט (עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin).
3. Shake תרבויות ב220 סל"ד עבור שעות 3-4 על 37 ° C.
4. תווית 1.5 מ"לבורג צינור כובע עם המספר הייחודי לבנות זיהוי, מתח תא, ותאריך. הוסף 500 μl של 50% גליצרול ו500 μl של תרבית תאים ולהפוך כמה פעמים. מייד לאחסן מניית גליצרול על קרח יבש או ב-80 ° C במקפיא.

6. בדיקת ביטוי

תמוגה buffe R	שטוף מאגר	הצפת elution
50 מ"מ אא 2 PO 4, pH 8.0 300 מ"מ NaCl 10 מ"מ imidazole 1% Tween 20 2 מ"מ MgCl 2 0.1 Benzonase μl / מ"ל 1 מ"ג / מיליליטר Lysozyme	50 מ"מ אא 2 PO 4, pH 8.0 300 מ"מ NaCl 20 מ"מ imidazole 0.05% Tween 20	25 מ"מ טריס, pH 8.0 300 מ"מ NaCl 250 מ"מ imidazole 0.05% Tween 20

* הוספת Benzonase, ליזוזים,ומעכבי פרוטאז מייד לפני תמוגה.

1. פס מדגם ממניות גליצרול על אגר סלקטיבי kanamycin ודגירת הלילה בשעה 37 ° C.
2. התחל מראש תרבות הלא וישכנע בבלוק 96, גם סיבוב תחתון; מרק חפת מ"ל 1.2 לחסן (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) בתוספת 0.5% גלוקוז עם א 'טרי גדל חיידק בודד. לגדול בין לילה רועד ב 220 סל"ד ב 37 ° C.
3. לאחר צמיחה בין לילה, להתחיל תרבויות אינדוקציה ידי inoculating 1.2 מ"ל של מרק שחפת (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) בתוספת Novagen לילה מערכת אקספרס 1 (על פי הפרוטוקול של היצרן) עם 40 μl של טרום התרבות.
4. לגדל את תרבויות אינדוקציה בקנה מידה קטנה על 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, רועד ב220 סל"ד.
5. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 סל"ד במשך 15 דקות, יוצקים את supernatant ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 לפני העיבוד.
6. בבלוק 96 גם, resuspend את כדורי התא ב300 מאגר תמוגה μl.
7. דגירה תאים במאגר תמוגה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ואחריו תמוגה מכאנית על ידי טלטול נמרץ למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
8. להבהיר lysate הגולמי על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 4000 סל"ד ב 4 ° C.
9. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 200 μl של lysate הבהיר (חלק קטן מסיס) למגש תחתון 96, גם שטוח (Qiagen). לכל המכיל גם מדגם, להוסיף 40 חרוזים Ni-נ.ת. ע מגנטי μl (Qiagen).
10. בעדינות להתסיס את הצלחת על כיסא נדנדה עבור שעה 1 ב 16 ° C.
11. מניחים את הצלחת על צלחת הודעה מגנטית (Qiagen) ולהסיר את החלק היחסי המסיס מאוגד. לדאוג שלא פיפטה את כל החרוזים Ni-נ.ת. ע.
12. הסר את הצלחת מצלחת הפוסט ובעדינות resuspended את החרוזים ב200 חיץ לשטוף μl. פיפטה מעלה ומטה למשך 30 שניות ולאחר מכן למקם את הצלחת בחזרה על צלחת הפרסום.
13. הסר את החיץ לשטוף ולחזור על שלב 6.12.
14. הסר את הצלחת מתפקיד הצלחת וelute Ni-נ.ת. ע מאוגד ת"אחלבון r קבל על ידי שטיפה עם 50 חיץ elution μl למשך 5 דקות.
15. לחזור צלחת תחתית שטוחה לצלחת הודעה מגנטית ולהעביר לצלחת elution V-תחתונה 96, גם טרי.
16. העבר את 20 μl של elution לצלחת V-תחתונה 96, גם טרי ומגיב עם ULP1 פרוטאז μl 1.
17. על פי הפרוטוקול של היצרן, לנתח + Ulp1 שבריר eluted וeluted ידי אלקטרופורזה נימים באמצעות LabChip 90.
18. לחלופין, ניתן לנתח את כל השברים מבדיקת הביטוי באמצעות-SDS.

7. תסיסה בקנה מידה גדולה

1. השתמש בקצה פיפטה סטרילית להשיג לגרד ממניות גליצרול, לחסן מרק TB 100 מ"ל (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) ולגדול בין לילה. Shake ב 220 סל"ד ו 37 ° C.
2. לאחר צמיחה בין לילה, להרחיב מראש על ידי תרבות inoculating 1 ליטר של מרק TB עם פתרונות autoinduction EMD (ראה פרוטוקול של היצרן) (עם 50 מ"ג / מיליליטר kanamycin) בבקבוק 2 ליטר מבולבל עם 10 מ"ל שלטרום התרבות (1:100 דילול).
3. לנער את תרבויות 1 ליטר המורחב על 37 מעלות צלזיוס, לשנות את הטמפרטורה של החממה הרועדת עד 20 מעלות צלזיוס, כאשר הוא הגיע צפיפות אופטית של 0.6 (OD _600).
4. לאחר צמיחה בין לילה, לוקח 10 מ"ל aliquot נציג מכל מבנה לבדיקת ביטוי.
5. תא קציר להדביק על ידי צנטריפוגה ב 5000 סל"ד במשך 15 דקות וזורקים supernatant.
6. תא ההקפאה להדביק ב -80 ° C.

טיהור חלבונים

מאגרים:

מאגר תמוגה	חיץ (איזון)	חיץ B (Elution)	שינוי גודל מאגר הטור
25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 0.5% גליצרול 0.02% בחורים 10 מ"מ imidazole 1 מ"מ TCEP ארגינין 50 מ"מ 5 Benzonase μl 100 מ 'גרם Lysozyme 3 טבליות מעכבי פרוטאז (EDTA-חינם)	25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 10 מ"מ imidazole 1 מ"מ TCEP ארגינין 50 מ"מ 0.25% גליצרול	25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 200 מ"מ imidazole 1 מ"מ TCEP	25 מ"מ טריס, pH 8.0 200 מ"מ NaCl 1% גליצרול 1 מ"מ TCEP

* הוסף Benzonase, ליזוזים, ולוחות מעכבי פרוטאז לכל דגימה 150 מ"ל מייד לפני תמוגה.

8. תמוגה תא

1. הפוך 2 ליטר של חיץ תמוגה; לא להוסיף ליזוזים, טבליות או מעכבי פרוטאז Benzonase (כל דגימה תהיה lysed בנפרד ב150 מ"ל של חיץ תמוגה).
2. הפשירו וresuspend תא להדביק במאגר תמוגה במסת 01:05: יחס נפח על ידי ערבוב נמרץ למשך 30 דקות ב 4 ° C. לשבור את הגושים רופפים מצדדים של כוס בעזרת מרית נקיות. במהלך פרק זמן זה להכין Ni וdialyחוצצי סים
3. על קרח, lyse התאים באמצעות sonicator Misonix (כוח 70%, 2 שניות ב/ 1 שניות את הפעימות במשך 3 דקות) ובעדינות מערבולת המכל כדי למנוע התחממות יתר. שמור aliquot (200 μl) קטן של lysate הגולמי לניתוח בעתיד.
4. להבהיר lysate הגולמי על ידי צנטריפוגה XG ב 18,000 עבור 35 דקות ב 4 ° C, לאסוף את supernatant ולשמור aliquot קטן (200 μl) לניתוח בעתיד. חנות גלולה ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא אישר את החלבון כבר lysed לשבריר המסיס.

9. התקנת אמצעים לחלבון לפני ריצה

1. עם יצרנית החלבון מופעלת והתוכנה פתוחה, לאתחל את המכשיר.
2. ברגע שאותחל, לצרף עמודה אחת 5.0 מיליליטר GE Healthcare HisTrap FF ניקל chelate (Ni עמודה) בשורה נפרדת של gantry לכל אחת מהדגימות.
3. הפעל כרכי 3-4 עמודות (קורות חיים) של חיץ איזון באמצעות כל עמודה.
4. להכין את קווי חיץ elution האיזון ו.
5. Equilibrאכלתי את העמודות על ידי aspirating חיץ דרך העמודה פעם אחת.

10. ניקל טור 1 (Ni1)

1. שטוף כל עמודה עם 20 מים מילי-Q מ"ל להסיר חיץ אחסון. לרוץ 5 מיליליטר חיץ חיץ 25 מ"ל לאיזון B ו.
2. טען lysate הבהיר המכיל חלבון solubilized לעמודות בשיעור של 2 מ"ל / דקה לאחר מכן בצעתי על ידי שטיפת 15 מ"ל עם החיץ א
3. Elute החלבון המאוגד בשיפוע צעד עם חוצצי A ו-B על ידי היחסים הבאים ביראת הכבוד: 5 95:5 מ"ל, 5 מ"ל 60:40, 10 מ"ל 0:100. לאסוף כל חלק elution בנפרד.
4. ניתוח: שברים eluted, lysate הגולמי, lysate הבהיר, וזרימה דרך ידי-SDS. ברי בריכת המכילים חלבון ולהשתמש Nanodrop למדוד ₂₈₀ כדי לקבוע את כמות חלבון בהווה בגסות.

11. ULP1 מחשוף

1. שמור aliquot קטן (250 μl) של בריכת עמודת Ni1 לניתוח ג'ל שלאחר מכן. להביא את שארבבריכת Ni1 עד 10 מ"ל ולהוסיף פרוטאז כמו היוביקוויטין 1 (ULP1) בμl 1/5 מ"ג של חלבון הכולל כדי להסיר את תג זיקתו-SMT.
2. Dialyze בריכת Ni1 + ULP1 נגד 2 ליטר של חיץ לשעה 4 על 4 מעלות צלזיוס ב10 kDa גזור משקל מולקולרי (MWCO) על צלחת ומערבבים ב 4 ° C.
3. לאחר דיאליזה, לרוץ-SDS של Ni1 בריכת וברכה Ni1 + ULP1 כדי לקבוע אם ULP1 המחשוף היה מוצלח.

12. ניקל עמודה 2 (NI2)

1. טען חלבון ביקע על אותה עמודת Ni וחזור על שלב 9.3 בקצב זרימה מופחת של 1 מ"ל / דקה. התג ביקע את יהיה לאגד את העמודה וחלבון מטרת tagless עכשיו יזרום דרכו. לאסוף את הזרימה דרכו במכל טרי.
2. שטוף עמודת Ni עם חיץ מ"ל 3 ואחרי 5 מ"ל של החיץ B לelute כל החלבון מתויג-ונכרך nonspecifically. לאסוף כל חלק בנפרד.
3. הפעל-SDS של NI2 זרימה דרך, לשטוף וNI2 השברים elution לאמת ULP1 מחשוף ושיחסי הציבורotein נמצא בזרימת הדרך. השתמש Nanodrop למדוד ₂₈₀ כדי לקבוע את נוכחותו של חלבון בגסות.

13. ריכוז

1. לרכז את הזרימה דרך NI2 (וNI2 elution אם חלבון הוא הווה) עד 5 מ"ל עם צינור Amicon Ultra 10 kDa MWCO צנטריפוגות. ספין במרווחים של 10 דקות ב 4000 סל"ד ב 4 ° C. מערבבים עם טפטפת בין כל סיבוב כדי למנוע מחלבון מעל להתרכז לאורך הממברנה.

14. כרומטוגרפיה גודל-הדרה (ה-SEC)

1. הגדר את ה-S-100 10/30 GL עמודת Sephacryl (GE Healthcare) על ידי equilibrating עם 200 מיליליטר חיץ-SEC בקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה במערכת AKTApurifier (GE Healthcare).
2. הכן 10 מ"ל superloops לשימוש בעמודת ה-SEC לפי הוראות היצרן.
3. באמצעות מזרק 5 מ"ל, טען דגימות על superloops ולהתחיל את ריצת ה-SEC.
4. לעקוב אחר עקבות UV-הספיגה ב 280 ננומטר תוך איסוף קטן נפח frפעולות.
5. הפעלה באמצעות שברי SEC-SDS.
6. הברכה שברי SEC מראים הלהקות בעוצמה הגבוהות ביותר.
7. להתרכז שברים SEC ויקוו. עיין בשלב 13.1.
8. חלבון Aliquot לתוך 100 דגימות μl, הקפאת הבזק בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C.

התגבשות

15. התגבשות חלבון

1. מראש למלא כל מאגר של צלחת התגבשות ג'וניור 96, גם קומפקטית (אמרלד ביו) עם 80 μl של מסך התגבשות (אמרלד ביו) של בחירה.
2. לדלל חלבון עם שינוי גודל מאגר כדי 2-20 מ"ג / מ"ל ​​ולאחסן על קרח.
3. לוותר על 0.4 μl של חלבון ו0.4 μl של מסך גיבוש לכל אחד מ96 הבארות ולכסות עם סרט איטום צלול (Manco).
4. אחסן את הצלחת על 16 מעלות צלזיוס במהלך בדיקת התגבשות חלבון מעת לעת במהלך השבועות הקרובים תחת מיקרוסקופ לנתח.

16. קציר גביש

1. צור cryoprotectant ממשקאות האמא ואתילן גליקול. חותכים את הקלטת ברורה מכסה היטב עם גביש חלבון המטרה. כדי גם ריק, להוסיף 1.6 μl של מצב ההתגבשות המקביל ולשלב עם 0.4 μl של אתילן גליקול מניב ריכוז סופי של 20% אתילן גליקול ו80% ​​גיבוש מצב. הערה: כדי לייעל את עקיפת גביש מנסה cryoprotectants שונה כגון: גליצרול, שמנים, glycols פוליאתילן MW נמוך, ו / או בשינוי אחוזי cryoprotectant.
2. לפני הקצירה להתקרר דיסקוס ALS בסגנון בדיואר מלא בחנקן נוזלי ומכסים במכסה.
3. קציר הגביש על ידי הצבת CryoLoop עם הקוטר הפנימי התאמת הגודל של הגביש בשרביט קריסטל מגנטי (Hampton מחקר) ולגרוף אותו ישירות מהפתרון גם.
4. מייד לטבול CryoLoop עם הגביש נקטף לאז לצלול cryoprotectant בדיסקוס ALS בסגנון פלאש להקפיא את גrystal. חזור על פעולה עבור מספר רצוי של גבישים.

17. אוסף הקרנה / נתונים קריסטל

1. ברגע קצירת הושלמה להשתמש שרביט דיסקוס למקם את המכסה דיסקוס cryo המגנטית על דיסקוס ALS. עם מלקחיים מכופפים, להפוך את הדיסקית במהופך.
2. העבר את הדיסקית לשחקן Rigaku דיואר, לדפוק Pusher פאק על דיסקוס, אגרוף ואת המכסה והשאירה אותו בדיואר עם סיכות עם פנים כלפי מעלה.
3. באמצעות תוכנת JDirector, מסך כל גביש תחת הפרמטרים הבאים: שסע קרן מוגדר 0.5 מעלות, מרחק הגלאי להגדיר עד 50 מ"מ, צעד תמונה עד 70 מעלות, ואורך חשיפה להגדיר עד 30 שניות.
4. הפעל Mosflm על התמונות שצלמתם עם בדיקת JDirector לקבוע מה הגביש והאסטרטגיה הטובים ביותר הוא לאיסוף נתונים.
5. איסוף מערך נתונים שלמים הבוסס על התוצאות שלך מMosflm.

18. עיבוד נתונים / קביעת מבנה

1. הפעל XDS / XScale ⁴ לעבד את הנתונים.
2. פתח את חבילת תוכנת CCP4.
   1. הפעל Phaser ⁵ לחשב פתרון החלפה מולקולרי תוך שימוש במודל חיפוש הומולוגיה גבוה, כאשר זמין. במקרה זה השתמשנו ב3CW4 PDBID כמודל חיפוש ^6.
   2. הפעל Refmac ⁷ לעדן המודל המולקולרי שלך נגד ההשתקפות הנצפית נאספה בבסיס הנתונים. החלטה סופית צריכה להיות מבוסס על הנחה של הפגז הגבוה ביותר ונקבעה על ידי הפרמטרים הבאים: R פקטור> 50%, אני / סיגמא> 2, ושלמות> 90%.
3. לבנות מודל צפיפות אלקטרונים 3 ממדים עם תוכנות גרפיקה מולקולריות הקרסול ^8.
4. לפני ההפקדה במבנה PDB לאמת אותו עם תוכנת MolProbity ⁹ כדי לוודא שאיכות של מבנה מתאים לתצהיר.

תוצאות

את התוצאות הבאות להמחיש את התוצאות הצפויות של הפרוטוקול המתואר, ובמקרה של PB2, את התוצאות שנצפו.

באמצעות מלחין ג'ין, חמישה רצפים של חומצות באורך מלא היעד של אמין PB2 מקטע פולימראז נגיף השפעת נועדו (איור 2). את PB2 הרצפים תורגמו בחזרה ונתונים לצעדים רבים הנדסי ^3, וכתוצאה מהרצפים ההרמוניים קודון המותאמים לביטוי בE. coli. ממוצרי iPCR (איור 3), סך של שלושים וארבעה מבנים היו משובט בהצלחה למערכת וקטור pET28 שונה ¹⁰ עם N-מסוף 6x תג ההיתוך שלו-SMT באמצעות שיבוט PIPE ^3, כפי שמוצג באיור 3 א. סיכום של העבודה השיבוט מוצג באיור 4.

אחרי שיבוט מוצלח, ביטוי חלבון בקנה מידה מייקרו של כל מבנה נבדק בBL21 (DE3) א 'קולי תאים. תאים גודלו במדיום שחפת בתוספת 1 בינונית Novagen לילה Express (על פי הפרוטוקול של היצרן) עבור 48 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בסט רועד חממה ב 220 סל"ד. לאחר צמיחה, תאים נקצרו ונבדקו לביטוי חלבון מסיס באמצעות electrophoreses הנימים עם LabChip Caliper 90. ארבעה עשר מהשלושים וארבעה המבנים PB2 הובילו לחלבון המטרה מסיס ונכנסו תסיסה בקנה מידה גדולה. תרבויות בקנה מידה גדולה של כל אחד מהמושגים שגדלו במדיום שחפת בתוספת בינונית אקספרס לינה של Novagen 1 על פי הפרוטוקול של היצרן. לאחר צמיחה, תאים נקצרו באמצעות צנטריפוגה ומאוחסנים ב -80 ° C. ביטוי חלבון בקנה מידה גדול של כל תרבות ותרבות אישר באמצעות SDS-PAGE ניתוח (איור 5) לפני שימשיך עם טיהור בקנה מידה גדולה.

אמצעים לחלבון שימש לביצוע טיהור מקבילה של הארבעה עשרה מבני PB2. את lysates הבהיר של אלמבני ליטר ארבעה עשר היו לרוץ דרך עמודת ניקל chelate. לאחר הקביעה שהכיל שברי חלבון המטרה על ידי-SDS, שברים המקבילים היו נקווה לכל דגימה והריכוז של כל אחד נקבע על ידי קריאה _280. ההסרה של תגו-SMT 6x נערכה על ידי התוספת של ULP1 אחרי דיאליזה הלילה ועמודה שנייה ניקל. אישור על הסרתו התג-SMT נערך על ידי-SDS (איור 6), ומדגם זה היה מרוכז עם צינור צנטריפוגות אולטרה 10 kDa Amicon. לאחר ריכוז באמצעות צינורות צנטריפוגה Ultra Amicon, כל דגימה נדרסה עמודה אומדת להשיג טוהר קריסטלוגרפיים. ריכוז שני נערך להגדיל את ריכוז החלבון לרמה הכרחית להתגבשות. כל ארבע עשרה המבנים היו מטוהרים בהצלחה ונכנסו לתוך ניסויי התגבשות.

הגיבוש נערך ביוזמת הפשרת FR בעברחלבון אוזן. הגיבוש נערך בחדר מבוקר אקלים על 16 מעלות צלזיוס עם צלחות, שתוכננו במיוחד (אמרלד ביו) לישיבת דיפוזיה אדי טיפה (איור 7). סינון ראשוני נערך עם ארבעה מסכי דלילים-מטריקס; JCSG +, ברית, אשף מלא, וCryoFull (אמרלד ביו), בעקבות אסטרטגיית ניומן מורחבת. 0.4 μl של תמיסת חלבון היה מעורב אז עם 0.4 μl של crystallant (או פתרון מאגר) מהמאגר המקביל באמצעות צלחות התגבשות ג'וניור 96, גם קומפקטיות (אמרלד ביו). מהארבעה עשר הדגימות מטוהרות תשעה מהם הניבו גבישים מתאימים ללימודים עקיפה (איור 8). ערכת נתונים עקיפה בבית נאספה בחמישה מתוך תשעת המבנים התגבשו בCu Kα אורך הגל באמצעות גנרטור Rigaku superbright FR-E + מסתובב-האנודה רנטגן המצויד Osmic VariMax אופטיקה HF ו 944 + גלאי CCD שבתאי (איור 9 ). כל סט הנתונים מעובד עם XDS / XScale ^{4 <} / Sup> וטפס להחלטה סופית. ניסיונות לפתור את המבנים על ידי החלפה מולקולרית בוצעו עם Phaser ⁵ מCCP4 חבילת ^7. הדגמים הסופיים התקבלו לאחר העידון בREFMAC ⁷ ובנייה מחדש ידנית עם ¹¹ הקרסול. המבנים הוערכו ותיקן לגיאומטריה וכושר עם MolProbity ^9. כוללת של ארבעה מבנים של מקטע PB2 נקבעו (איור 10) והופקד לPDB. איור 11 מדגים את התוצאה הכללית בכל שלב בצנרת MTPP.

איור 1. סקירה כללית של מסלול גן למבנה SSGCID לעיבוד מקביל מרובה היעד באמרלד ביו.

תוכן "עבור: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 2. מציג יישור וחלבון לבנות מודול עיצוב בתוכנת מלחין ג'ין. בסיס חומצה אמינית לבנות של היעד מוצג בירוק (חלון באמצע) ואת truncations מודרך המבנה של מבנים חלופיים מוצגות בזהב (חלון תחתון). יישור של רצפים נגיפיים שפעת PB2 מרובים מוצג בהשוואה לרצף ואלמנטי מבנה משניים של התחום בטרמינל C-מ3CW4 PDBID. ידע של מבנה התחום ואלמנטי מבנה משניים מאפשר truncations N-מסוף להיבחר בתוך מודול עיצוב מלחין הגן על ידי לחיצה ימנית על שאריות חומצת אמינו הרצויה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

ithin עמודים = "תמיד">
איור 3 א. שיבוט צינור מאויר בי להכניס את הגן הסינטטי (כתום) מוגבר על ידי תוכנן קדימה (קווים אדומים כתומים) ופריימרים (קווים כחולים, כתום) הפוכים כדי ליצור להכניס חומר PCR. וקטור הביטוי מוגבר עם קווים הפוך (אדומים שחורים פריימרים) וקדימה (קווים כחולים שחורים) כדי ליצור חומר PCR וקטור. מוצרי iPCR רצפי מסופים משלימים לרצפי הטרמינל של מוצרי vPCR (האדום של iPCR משלים אדום של vPCR והכחול של iPCR משלימים כחולים של vPCR). זה מאפשר את מוצרי iPCR וvPCR כדי לחשל כדי ליצור פלסמידים שמשוכפלים על הפיכתו מארח BL21 (DE3) א 'כימי המוסמכת קולי תאים.

איור 3. ניתוח agarose ג'ל של iPCR produc כישלונות iPCR ts ממקטע PB2. ניתן לראות להקות חלשות או מוכתמות, ואילו מוצרי iPCR מוצלחים מיוצגים על ידי להקות חזקות. איכות מוצר בדרך כלל iPCR יכולה להיות מתואמת עם הצלחה שיבוט. סמני משקל מולקולריים הם בkiloDaltons. איור הוא לשכפל מריימונד et al., 2011 ^12.

איור 4. צעדי הנדסה גנטיים של חלבוני היעד PB2 בוצעו באמצעות תוכנת מלחין ג'ין. לאחר רצף חומצות הגרעין המהונדס הוקם עבור כל יעד, מבני חלבונים חלופיים 6-7 נועדו לכל אחד. עיבוד מקביל רב היעד בשלבים הראשוניים של עיצוב גן והביא לשיבוט 34 מבנים, 14 מהם היו מטרות קיימא שמיוצרות חלבונים מסיסים בE. coli.

מחדש 5 "src =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
איור 5. SDS-PAGE ניתוח נציג של תסיסה בקנה מידה גדולה מראה ביטוי חלבון חזק (גודל צפוי של 25.76 KDA), מחשוף בערך 50% מסיס (מסלול 4) וכ -50% מתג שלו 6x-SMT מחלבון eluted (מסלול 7).

איור 6. תוצאות-SDS לשלושה מבנים של מקטע PB2 פולימראז 1 ליין, סמנים מולקולרי משקל (מסומן בצד השמאל בKDA); נתיבים. 2, 6, ו -10, חלבון ונקווה מעמודת ניקל 1; 3 נתיבים, 7 ו 11, זרימה דרכו של חלבון ביקע במאגר מניקל 2; נתיבי 4, 8, ו -12, הסרת התג 6x-SMT בB החיץ מניקל 2.

d/4225/4225fig7.jpg "/>
איור 7. סכמטית של דיפוזיה אדים בשיטת הטיפה יושבת. שיטת הטיפה יושבת להתגבשות חלבון נופל תחת הקטגוריה של דיפוזיה האדים. שיטה זו כרוכה במדגם של חלבון מטוהר ונמהר כדי לאזן עם מאגר גדול יותר המכיל תנאים דומים בריכוז גבוה יותר. כמו מים מאדים ממדגם החלבון וההעברות למאגר, הריכוז נמהר מגביר לרמה אופטימלית להתגבשות חלבון.

איור 8. גביש חלבון של מקטע פולימראז PB2 מזן של נגיף השפעת.

איור 9. תמונת השתברות קרן ה-X של המקטע מפולימראז PB2זן של נגיף השפעת.

איור 10. דיאגרמות של רצועת הכלים של המולקולות ביחידה אסימטרית קריסטלוגרפיים של 4 PB2 מבני מבנים משניים. צבעוניים בדפוס קשת עם קודי PDB מתאימים. (א) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (ב) 3KHW (/ מקסיקו / InDRE4487/2009/H1N1) (ג) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (ד) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).

איור 11. ניתוח תוצאות למטרות שפעת PB2 על ידי השיטות שתוארו. structurצינור נחישות הדואר בא לידי ביטוי בחמישה שלבים: שיבוט, מסיסות, טיהור, התגבשות מבנה ונחישות.

Discussion

עיבוד מקביל רב יעד

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בגילוי תרופות. SSGCID מחויבת לספק לקהילה המדעית עם מבנים חלבוניים תלת ממד מפתוגנים NIAID הקטגוריה AC. הפיכת מידע לזמין לציבור רחב כגון מבני תשמש סופו של דבר להאצת תכנון תרופות המבוסס על מבנה.

הצעד הקריטי הראשון של גישת MTPP הוא עיצוב מבנה. בונה מרובות של כל חלבון המטרה מגדילה את ההסתברות של קביעת מבנה מוצלחת ותפנית עליות. זה בלתי נמנע שכמה מבני חלבונים ייכשלו במהלך שלבים שונים של הצינור. יישום שיטת שיבוט PIPE תומך בשיטת MTPP כך שהוא מאפשר את הדור של מבנים רבים בתבנית 96, גם ללא צעדי טיהור עתירי עבודה. שיוך שיבוט צינור עם היכולת לנתח ביטוי חלבון באותה מתכונת 96, גם (Caliper המעבדהשבב 90) עוד יותר מזרז את הזרימה הכוללת. הזיווג של שיטות אלה מאפשר זיהוי מהיר של מבנים המייצרים חלבון מסיס אשר מבטיח את ההצלחה של ייצור חלבון בקנה מידה גדול וטיהור.

היבט חיוני להצלחה של התפוקה גבוהה MTPP הוא אמצעים לחלבון (פטנט אמריקאי מס 6,818,060, אמרלד ביו) מכשיר. אמצעים לחלבון הוא מערכת כרומטוגרפיה נוזלית במקביל ערוץ 24 שפותחה במיוחד כדי להגביר את היעילות של ייצור חלבון תפוקה גבוהה ויישומי מחקר הגנומי צינור המבני בנושא. באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם לכן להכנת החלבון, היתרונות ניכרים בהשוואה למערכת FPLC שורה אחת. אדם אחד יכול לטהר עד 48 מטרות במקביל בתוך תקופה של שמונה שעות ביממה. בניגוד לכך, אדם יחיד באמצעות מערכת FPLC שורה אחת יכול רק לטהר את מקסימום של ארבע מטרות בתוך פרק הזמן זהה. הרמות הגבוהות של טוהר לכל יעדלהשיג עם אמצעים לחלבון הם גורם קריטי בהצלחה בהמשך של גבישי חלבון גוברים לניתוח מבנה.

מגבלות ופתרון בעיות

פתרון מבנים תלת ממדי על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן הוא מאמץ רב מבוים עם אתגרים רבים, שאחד מהם הוא חוסר היכולת להשיג כמויות גדולות של חלבון המטרה מסיס. אסטרטגיה אחת שיכול להיות מיושמות כדי להתגבר על הבעיה המסיסות היא השימוש בביטוי מארח כחלופת א ' קולי תאים אינכם מצליחין לבצע כמה שינויים לאחר translational אוקריוטים חשובים. ביטוי בשמרים שונים, שורות תאי חרקים ויונקות, כי הם מסוגלים לבצע לאחר translational השינויים הללו הם לעתים קרובות חלופה מתאימה. חלבוני יעד לפעמים באים לידי ביטוי אך לא מסיס לחלוטין בתנאי תמוגה הסטנדרטיים. אמצעים לחלבון יכול להיות משאב יקר ערך עבור הבדיקה המהירה של תנאי תמוגה תא חלופייםכפי שמתואר בסמית et al. 2011 ^13. אסטרטגיה זו היא לעתים קרובות הכרחית כדי לשמור על מטרות נעות דרך הצינור. בכל צינור גנומיקה מבני, פרוטוקולים סטנדרטיים לא יכולים להיות מתאימים לכל יעד שמגיע דרך הצינור ומטרות עשויות להזדקק לאופטימיזציה של פרט. לדוגמה, בחרו להשתמש 20% אתילן גליקול לכל cryoprotectant. במקרים שהמצב הזה הוא לא מתאים, או ריכוזי cryoprotectants החלופיים ייתכן שיצטרכו להיבדק.

בשל האופי הייחודי של כל יעד חלבון בודד, שער הגבלת וצעד בלתי צפוי בקביעת מבנה הוא התגבשות. את קיזוז צינור MTPP שיעור ההצלחה הנמוך בדרך כלל מהתגבשות חלבון עם אופטימיזציה ממסכי המטריצה ​​הדלילות הראשוניים. כל גביש ראשוני נפגע ממסכי מטריצה ​​דלילים זמינים מסחרי הוא מותאם יותר עם בונה דואר מסך (אמרלד ביו). לאופטימיזציה של המסך נועד ARound מצבו של להיט הגביש הראשוני, לשנות את הריכוזים של המאגרים, המלחים, ותוספים. מסכי אופטימיזציה מוצלחות להניב גבישים המתאימים לעקיפים מחקרים וקביעת מבנה.

תכנית גנומיקה המבנית אשר נקבעו על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) מספקת מימון לאמרלד ביו ושלושה מוסדות מערב האוקיינוס ​​השקט אחרים שיחד הם SSGCID (אמרלד ביו, SeattleBiomed, אוניברסיטת וושינגטון וPacific Northwest National Laboratory) . כל אחד מחברי הקונסורציום נבחר למומחיות שלהם ביישום טכנולוגיות מדינה-of-the-art הנדרשות להשגת המטרות של תכנית גנומיקה המבנית NIAID. נכון להיום, SSGCID הפקידה 461 מבנים לדירוג PDB כתורם הגדול ביותר השביעי בעולם, ובשנת 2011, הפורה ביותר. הפרוטוקולים ומתודולוגיות של SSGCID מסופקים עם הכוונה לטובתקהילה מדעית ומנציח את המחקר במחלות זיהומיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers	IDT
Genes	DNA 2.0
TE buffer	Qiagen	provided in kit
96-well half skirt PCR plates	VWR	10011-248
PFU Master Mix
6X Orange Loading Dye	Fermentas	R0631
10X TAE	Teknova	T0280
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414-10G
pET28 vector
2-YT Broth	VWR	101446-848
Kanamycin	Teknova	K2151
Restriction Enzymes	Fermentas
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Top 10 chemically comp cells	Invitrogen	C4040-06
Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)	VWR	89094-662
Airpore covers (Rayon films for bio cultures)	VWR	60941-086
24-well blocks	VWR	13503-188
QIAvac 96	Qiagen	19504
BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)	NEB	C2527H
50% Glycerol	VWR	100217-622
TB Media	Teknova	T7060
IPTG	Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
5 M NaCl	Teknova	S0251
Glycerol	Aldrich	G7893-4L
CHAPS	JT Baker	4145-01
Imidazole	Sigma	56749-1KG
TCEP	Amresco	K831-10G
L-arginine	Amresco	0877-500G
Benzonase	EMD	70746-3
Lysozyme	USB	1864525GM
10 kDa MWCO dialysis tubing	Thermo	68100
Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators	Millipore	UFC901024
HisTrap FF columns	GE	17-5255-01
HiTrap Chelating columns	GE	17/0408-01
Compact Jr crystallization plates	Emerald Bio	EBS-XJR
Crystalization screens	Emerald Bio
Ethylene Glycol 100%	Emerald Bio	EBS-250-EGLY
Crystal Wand Magnetic Straight	Hampton Research	HR4-729
Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm	Hampton Research	HR4-955
ALS style puck
Puck Wand
Bent Tongs
Puck Pusher