מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

Lars G. Eckerle; Stephan B. Felix; Lars R. Herda

doi:10.3791/4237

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.

Abstract

קרדיומיופתיה המורחבת (DCM) היא האחד הגורמים העיקריים לאי ספיקת לב במבוגרים הצעירים ^1. למרות נטייה גנטית וחשיפה לחומרים רעילים ידועות סיבות למחלה זו כבשליש מהחולים, מקורו של DCM נותר במידה רבה בלתי ברור. במספר לא מבוטל של חולים אלה, נוגדנים העצמיים נגד אפיטופים לב שכבר זוהה וחשודים לשחק תפקיד מרכזי בתחילת ההתקדמות של המחלה ^2,3. החשיבות של נוגדנים עצמיים לב מודגשת על ידי שיפור המודינאמית נצפה בחולי DCM נטרול נוגדנים עצמיים על ידי immunoadsorption ^3-5. מגוון רחב של אנטיגנים ספציפיים כבר זוהה ^2,3 ונוגדנים נגד יעדים אלה עשויים להיות מזוהים על ידי immunoassays. עם זאת, המבחנים הללו אינם יכולים להבחין בין הגירוי (ולכן פונקציונליים יעיל) וחסימת נוגדנים עצמיים. יש גובר evidence כי הבחנה זו היא חיוני ^6,7. כמו כן, ניתן להניח כי היעדים למספר נוגדני cardiotropic עדיין לא מזוהים ולכן אינו ניתן לגילוי על ידי immunoassays. לכן, הקים שיטה לגילוי נוגדנים תפקודיים פעילים cardiotropic, עצמאיים של אנטיגן החוקי. הרקע לשיטה הוא ההומולוגיה הגבוהה בדרך כלל נצפתה לאזורים פעילים של חלבונים בלב בין יונקים ^8,9. הדבר מצביע על כך נוגדני לב הופנו נגד אנטיגנים אנושיים יחצו-מגיבים עם תאי המטרה שאינם בני אדם, המאפשרים בדיקה של נוגדנים מחולי DCM על cardiomyocytes חולדות בוגרות. השיטה שלנו כוללת 3 שלבים: הראשון, IgG מבודד מפלזמת מטופל באמצעות נוגדני sepharose מצמידים אנטי IgG מתקבלים מעמודות immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, גרמניה). cardiomyocytes שנית, למבוגרים מבודדים על ידי זלוף collagenase במנגנון זלוף Langendorff באמצעות aprotocol שונה מעבודות הקודמות של ^10,11. את cardiomyocytes מתקבל מצורפים לcoverglasses הקבורים laminin המצופה ומוכתם בFura-2, צבע פלואורסצנטי סידן סלקטיבית אשר יכולה להיות מובא בקלות לתוך התא כדי לבחון הסידן תוך תאי (Ca ^{2 +)} תוכן ^12. בשלב האחרון, ההשפעה של מטופל על IgG קיצור התא וCa ^{2 +} ארעי של cardiomyocytes שדה מגורה מנוטר באופן מקוון באמצעות מערכת ניטור התכווצות (IonOptix, מילטון, מסצ'וסטס, ארה"ב) סיד myocyte מסחרי ומחובר לניאון הפוך סטנדרטי מיקרוסקופ.

Protocol

1. בידוד נוגדנים מדגימות מטופל

הכן עמודות המיני immunoadsorption ידי מילוי 3 מ"ל אנטי IgG sepharose לכל 2 מיליליטר מטופל EDTA פלזמה לעמודה ריקה Econo פאק. IgG בידוד דורש לפחות 2 מ"ל של פלזמת חולה.
הנח על גבי מסנן אנטי IgG sepharose, חתכת את הקצה התחתון של העמודה ולחץ על המסנן להגיע לקצב זרימה של כ 1 טיפה / שנייה. בואו פתרון השימור הנגמר של העמודה.
לשטוף את העמודה עם 3 כרכים 0.9% NaCl לנפח הפלזמה.
פיפטה פלזמה על העמודה. כאשר הפלזמה שקועה לחלוטין באנטי IgG sepharose, לשטוף עם אותו הנפח 0.9% NaCl.
נפח פיפטה 1 פלזמה של 0.2 M HCl גליצין, 2.8 pH על העמוד ובואו לטבול לתוך sepharose. הוסף עוד כרך של גליצין HCl על העמודה. לאסוף את הזרימה דרך בצינור מ"ל 15 ולהתאים את ה-pH ל 7.3 עם 0.5 מ 'טריס-HCl, pH 8.0.
כדי לחדש את העמודה, לשטוף עם 3 הפלזמה כרכים גליצין HCl. לאחר שטיפה סופית עם 2 כרכים 0.9% NaCl, העמודה עשויה לשמש לדגימת הפלזמה הבאה. לחלופין, העמודה יכולה להיות מלאה עם פתרון שימור ואוחסנה ב 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
לשימוש בcardiomyocytes, שבריר IgG שנאסף צריך להיות דיאליזה נגד מאגר ניסויי (EB). להכנת EB, להוסיף 117 mM NaCl, KCl 2.8 מ"מ, 0.6 המ"מ MgCl _2, 1.2 המ"מ KH _{2 4} ת.ד., 1.2 מ"מ CaCl _2, 10 HEPES המ"מ וגלוקוז 20 מ"מ למי 1 ליטר מזוקקים על stirrer מגנטי ולהתאים את ה-pH ל -7.3.
מלא את שבר IgG לצינור קרום דיאליזת אסתר תאית עם משקל מולקולרי לחתוך של 100 kDa. שים את הצינור בEB 1 ליטר ומערבב לאט עם stirrer מגנטי ב 4 ° C. לאחר שעה 8, להעביר את הצינור לדיאליזת 3 L של EB הטריה ודיאליזה עבור 20 שעות נוספות בשעת 4 ° C.
בעקבות דיאליזה, חום המדגם למשך 30 דקות ב 57 מעלות צלזיוס באמבט מים לinactivatגורמים משלים ה. קביעת ריכוז נוגדנים מוחלט ולהכין aliquots המכיל 330 מיקרוגרם IgG כל אחד. כאשר מוסיף את המדגם כדי cardiomyocytes למדידה (שלב 4.3), למלא את aliquots ל1 מ"ל עם EB. aliquots החי ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.

2. בידוד של cardiomyocytes Rat

להכנת Ca ^{2 +-חיץ} בידוד חופשי (IB), להוסיף 110 המ"מ NaCl, KCl 2.6 מ"מ, 1.2 המ"מ ₄ MgSO, 1.2 mM KH _{2 4} ת.ד., 20 HEPES המ"מ וגלוקוז 11 מ"מ למים מזוקקים 1 ליטר באמצעות מגנטי stirrer. התאם pH ל -7.4 בטמפרטורת חדר ומסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בקבוק עליון לעיקור.
מלא 80 מ"ל של IB במאגר העליון של מערכת זלוף Langendorff thermostated. התאם את גדרות תרמוסטט כדי לשמור על טמפרטורת חיץ של 37 מעלות צלזיוס ולתחח חיץ עם 95% O _2/5% CO ₂ למשך 30 דקות.
שוקל כ 10,000 - 12,000 U של collagenase סוג השני, חומצות שומן חופשי BSA 175 מ"ג ומתמוססים ב20 IB מ"ל מכיל 22.5 μl של 100 פתרון mM CaCl ₂ מניות. לשלוט על ה-pH של חיץ הבידוד במאגר העליון ולהתאים במידת צורך.
לטשטש את עכברוש Wistar של 175-200 גרם עם thiopental משקל 375 מיקרוגרם / קילו משקל הגוף. הוסף הפארין יחב"ל 2500 לפתרון thiopental. לאחר פתיחת בית החזה, בלו הלב בקפידה עם קשת אב עורקים שלמה ולהעביר אותו לקר כקרח 0.9% NaCl. נקה את הלב מדם והרקמות והעברה לטרי 0.9% NaCl שמסביב. לחשוף את אב העורקים, פתח את מפחית הזרימה של מערכת Langendorff להשיג מהירות יורדת מ2-3/sec ולצרף את הלב לצינורית.
תנקב את הלב לתקופה של עד 3 דקות בקצב זרימה של 1 טיפה / שניות לשטוף את הדם שנותר. התחל להפיץ את IB במערכת Langendorff. הסר חיץ מ"ל 20 מהמאגר העליון, מלא את פתרון collagenase ולמלא כמה שיותר חיץ כפי שנדרש כדי להגיע ל80 מ"ל. הפץ ג פתרון לollagenase 27 דקות נוספות. קצב זרימה צריך להיות מבוקר תקופתי ומתוחזק בירידת 1 / שניות באמצעות מפחית הזרימה.
לנתק את הלב מהצינורית, הנקי מאטרייה ואב עורקים וקוצץ לחתיכות קטנות. אפשר פתרון collagenase לרוץ לתוך המאגר התחתון, להפחית את עוצמת קול למקסימום של 40 מ"ל ועוד יותר לעכל את החדרים הקצוצים עבור 10 - 15 דקות מתחת לאוורור רציף עם 95% O% _2/5 CO _2. לאחר מכן, מסנן את השעית התא דרך גזת 200 מיקרומטר רשת גודל לתוך צינור מ"ל 50.
שחזור Ca ^{2 +} התוכן של התאים ב3 שלבים: סרכזת השעית תא XG ב 43 עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר ותאי resuspend ב 10 המ"ל מכיל 200 IB מיקרומטר CaCl _2. צנטריפוגה שוב וresuspend תאים ב10 המ"ל IB עם 500 מיקרומטר CaCl _2. לאחר צנטריפוגה סופית resuspend cardiomyocytes בEB המסוננת סטרילי (ראה 1.8) לצפיפות של 50,000 תאים / מ"ל.

e_title "> 3.-2 Fura הכתמה של cardiomyocytes

מעייל 4 coverglass קבורים היטב עם laminin 10 מיקרוגרם לטובים ולחכות עד שהוא יתייבש לגמרי.
מלא 1 מ"ל של השעית cardiomyocyte לכל השימוש micropipette היטב עם קצה חתוך. אפשר התאים לדבוק לשעה 1 בטמפרטורת חדר.
לדלל 10 μl של 1 מ"ג / המ"ל Fura-02:00 פתרון מנייה בEB 5 מ"ל. שמור את הפתרון המכתים בחושך.
תוריד את החיץ ורווק תאים מcoverglass ו0.5 מיליליטר פיפטה של הפתרון המכתים לכל באר. דגירת התאים למשך 10 דקות ברעידות בינוניות. לאחר מכן, לוקח את הפתרון המכתים, לשטוף תאים פעם אחת עם EB 1 מ"ל ולבסוף למלא EB 0.5 מ"ל לכל באר. הימנע מאור ישיר בתהליך הצביעה ותמיד לשמור על תאים המוכתמים בחושך.

4. הקלטה של קיצור של תא ושל Ca ^{2 +} ארעי

הנח coverglass נאוטילוס על מ 'פלואורסצנטי הפוךicroscope מחובר למערכת הקלטת contractility סידן וmyocyte. מקם אלקטרודה מנהג עשה עם זרם וצינור זרימה בבאר הראשונה. cardiomyocytes Superfuse עם EB 1 מ"ל / דקה ולהתחיל גירוי החשמלי (20 וולט, 1 הרץ, 5 אלפיות משך). לאפשר לתאים להסתגל לגירוי כ 2 דקות.
בחר cardiomyocyte צורת מוט שלם עם תלמים ברורים והתכווצות מתמדת. מקם את התא במרכז שדה הראייה ולפתוח את ערוץ המצלמה. להתמצא התא אופקי בתחום הווידאו על ידי סיבוב מתאם מסגור התא והתנועה את במת מיקרוסקופ.
התאם את קצה איתור רכיבי בקרה של אזור הווידאו (איור 2), לפתוח את ערוץ 10 ולהקליט הניאון - 15 צירים כדי להשיג קיצור התא הראשוני וCa ^{2 +} ארעי.
סגור את ערוץ מיקרוסקופ האור, כדי למנוע הלבנת כתם פלואורסצנטי. כבה את הזרימה דרך מEB למדגםלעקוף עם שסתום 3-way וcardiomyocytes superfuse עם 1 מ"ל של מטופל נוגדנים. עצור את המשאבה ממש לפני האוויר מגיע גם.
פתח את ערוץ האור ולהקליט עוד 10-15 צירים כדי לקבל את תגובת התא החריפה. להשהות את ההקלטה ולסגור את ערוץ האור שוב. חזור על הקלטה לאחר 2 ו 5 דקות.
הוצא את האלקטרודה של הבאר. נקה את הצינורות ביסודיות עם EB ולהמשיך בבאר הבאה של coverglass נאוטילוס.
נתח את קיצור התא וCa ^{2 +} ארעי עם תוכנת IonWizard באמצעות "Edge-Length/Length" והחלון "Fura 2-מספריים נגרע / יחס", בהתאמה. לחשב את אחוז השינוי שחל מהקיצור הראשוני התא וCa ^{2 +} הארעי של גובה השיא התייחס לנקודת ההתחלה (% bl השיא ח) לאקוטי, 2 דקות ותגובת 5 דקות.