Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

Summary

רוב המחקרים של מחלת קרנית herpetic משתמשים במודל זיהום עיקרי. עם זאת, זיהום ראשוני עם HSV-1 אינו בדרך כלל להוביל למחלות אנושיות. כאן אנו מתארים מודל חוזר של מחלה בקרנית herpetic, אשר באופן הדוק יותר מחקה מחלות אנושיות.

Abstract

מחל herpetic עין, קרנית סטרומה herpetic כינה (HSK), היא זיהום שעלול להיות מסנוור של הקרנית שגורמת ליותר מ -300,000 ביקורים קליניים בכל שנה לטיפול. בין 1 ל 2 אחוזים מחולים עם מחלה קלינית חווים אובדן הראייה של הקרנית הנגועה. הרוב המכריע של מקרים אלה הם התוצאה של הפעלה מחדש של זיהום סמוי על ידי הרפס סימפלקס סוג אני וירוס ולא כתוצאה ממחלה חריפה. מעניין, הזיהום החריף הוא המודל המשמש לרוב ללימודי מחלה זו. עם זאת, התחושה הייתה שמודל חוזר של HSK יהיה יותר משקף את מה שמתרחש במהלך מחלה קלינית. את המודלים של בעלי החיים חוזרים לHSK העסיקו שני ארנבות ועכברים. היתרון של ארנבים הוא שהם חווים מחדש מהשהית העדר כל גירוי ידוע. עם זאת, קשה לחקור את התפקיד שהרבה גורמים אימונולוגיים לשחק בHSK החוזר, משום שמודל הארנב אין immunמשאבי ological והגנטיים שיש עכבר. אנחנו בחרנו להשתמש במודל העכבר לHSK חוזר כי יש לו את היתרון של להיות שם משאבים רבים זמינים וגם אנחנו יודעים מתי נתרחש מחדש בגלל מחדש נגרמים עקב חשיפה לקרינת UV-B. עד כה, מודל זה אפשר מעבדות אלה משתמשים בו כדי לקבוע מספר גורמים חיסוניים שחשובים למחלה זו. זה גם אפשר לנו לבחון גם ריפוי ויעילותו.

Protocol

הערת טיפול בבעלי חיים: משככי כאבים אינם משמשים במודל זה כמו שהם אנטי דלקתיים ולכן הייתי פוסלים את המודל.

1. הכנת הווירוס

1. לגדול HSV-1 בתאי Vero (80% confluent) באמצעות דילול התחלתי של 0.01 ריבוי של זיהום (בבקבוק T-150, כ 5 x 10 יחידות יוצרות פלאק ⁵⁾ עבור 3-4 ימים עד שכל תאים מעוגלים למעלה והם משתחררים ממקומם בקלות על ידי להכות את הבקבוק.
2. הסר את המדיה לצינורות סטריליים צנטריפוגות וצנטריפוגות ב Sorvall המקרא RT ב 4 ° C ו3500 סל"ד במשך 15 דקות. לאחר הסרת supernatant (ראה 1.3), resuspend גלולה גדולה מכל צינור 50 מ"ל עם 5 מ"ל בסך הכל תקשורת. Sonicate לדקות 1 בשתי התפרצויות 30 שניות.
3. הסרת supernatant והכניס לתוך צינורות 50 מ"ל סטריליים Oak Ridge וצנטריפוגות ב9000 סל"ד, לשעה 1 ב 4 ° C בקמן צנטריפוגה J2-21. זה הוא לייצר גלולה נגיפית קטנה. השלך את supernatant.
4. שלב sonicate מ -1.2 שנינותח גלולה מ -1.3 וsonicate שוב למשך 45 שניות. צנטריפוגה בSorvall המקרא RT ב 1500 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. זה מהווה את מניית וירוס הaliquoted ואוחסן ב -70 ° C.
5. וירוס כייל נוגדנים על תאי Vero. אני בדרך כלל צלחת 10 ⁰ ל10 ^-8 דילול (כל אחת להיות דילול 10-קיפול) 2x מ2 סטי דילול נפרדים. טיטרציה של וירוס מבוצעת על צלחות סטריליות 12-כן.

2. זיהום מאוס

1. להזריק כל עכבר עם 0.1 מ"ל של חומר הרדמת משקל cocktail/20 גרם עכבר גוף (קטמין, 60 מ"ג / ק"ג + Xylazine 5 מ"ג / ק"ג שדילול בHBSS). קוקטייל זה משמש כי זה אחד האמצעים הכי הבטוחים להרדמה, כאשר המינונים מתאימים משמשים ואת ההשפעות של תרופה זו הן מאוד קצר.
2. כאשר עכברים מורדמים לשרוט את הקרנית של עין ימין עם מחט מד 30 באמצעות מיקרוסקופ לנתח על מנת להבטיח שהקרנית אינה מחוררת.
3. כל rece עכברived הזרקת intraperitoneal של 1 מ"ל של נסיוב אדם נקווה (Sigma, Temecula, קליפורניה; תגובתיות אנטי HSV עם מינון אפקטיבי לנטרול נגיף 50% מ1:800) כדי להגן על קרניות מניזק במהלך הזיהום העיקרי.
4. מספר העכברים עם או אטבי אוזניים או באוזן אגרוף.
5. אחרי כל העכברים מוספרו; באמצעות pipettor μl 20, אנחנו מדביקים כל עין עם 10 ⁶ pfu (5 μl). אנחנו מדביקים רק עין אחת, ובדרך כלל עין הימנית. גם אנחנו שמים 5 μl של HBSS לעין השנייה כדי לשמור אותו הלח בזמן שהם מורדמים. 5 ul הוא מספיק כדי לשמור על לחות של העיניים מאז ההליכים מתבצעים בפחות מ 10 דקות, ואת בעלי החיים במינון עם הרדמה בהתאם. זיהום הוא אשר על ידי ניגוב עכברים 3 ימים לאחר פגיעה עם מוליך כותנת סטרילי שהיה hydrated ב1 מ"ל של תקשורת Vero. אז 100 μl מתווסף לתאי Vero גודלו בצלחות 48-כן. צלחות אלה ניטור יומיומי להשפעות cytopathic (CPE).

3. אקטיבציה של עכברים מהחביון

1. עכברים מורדמים לפחות 5 שבועות לאחר הדבקה ראשונית. יש לציין שיש לנו מחדש עכברים עד הזיהום עיקרי הבא שנה אחת ולא נצפו הבדלים משמעותיים בתגובה.
2. ברגע שהרדים הם ממוקמים TM20 transilluminator Chromato-Vu, אשר פולט קרינה UV-B באורך גל של 302 ננומטר שיא כאלה שרק עין אחת חשופה לאור UV-B. כל עכבר חשוף לmJ של אור UV-B סנטימטר 250 ^2.
3. אקטיבציה נקבעה על ידי ניגוב עיניים עם מוליך הכותנה סטרילי הממוקם ראשון ב1 מ"ל של תקשורת ביום Vero 0 (לפני החשיפה לקרינת UV-B לשליטה לשופכים ספונטניים) ולאחר מכן בימים 1-7 לאחר קרינת UV-B. החומר הספוגי מוערך כמתואר ב2.5). למטליות שיש להם וירוס מדבק כמות הנגיף גחך על ידי assay פלאק הסטנדרטי באמצעות 12 גם צלחות.

ove_title "> 4. הערכה קלינית

1. עכברים מוערכים למחלת עיניים קלינית על ידי משקיף רעול פנים באמצעות מיקרוסקופ לנתח משקף.
2. אטימות קרניות הוא דורג בסולם של 0 עד 4, שבו 0 מציין stroma ברור, 1 מציין עננות סטרומה קלות, 2 עולים אטימות מתונות עם תכונות איריס מובחנות, 3 מציינים אטימות צפופות עם אובדן פרטי קשתית מוגדרת פרט שולי תלמידים, ו 4 מציין אטימות מוחלטות ללא נוף אחורי.
3. Neovascularization הוא דורג בסולם של 1 עד 8 על ידי חלוקת הקרנית ל 4 רבעים שווים וקביעת היקף כלי דם בכל אחד מהרבעים הללו.
4. Blepharitis נמדד באופן הבא: 0, ללא נגעים; 1, עפעף מינימאלי נפיחות, 2, פריקים מתון נפיחות ופריכות עיניים; 3, נפיחות חמורה, נשירת השיער periocular מתון, ונגעים בעור, ו 4, נפיחות חמורות בעיניים עצומות מוקרם, אובדן חמור periocular שיער, ונגעים בעור.
5. עדות לדלקת קרום המוח incluטוליפ גב כפוף, שיער פרוע, וליקויים נוירולוגיים ברורים. עכברים מורדמים כשהם מגלים סימנים מובהקים של דלקת קרום המוח.

5. נציג תוצאות

הדגם החוזר אשר תואר לעיל פורסם לראשונה על ידי Shimeld, et al. ^1-3. הם בדקו והמעבדה שלנו כבר משתמשת בגרסה שונה של מודל זה לפרסם כתבי יד רבים במהלך שנתי ^4-15. המודל המשמש להגדרת התפקיד שציטוקינים מחזות אינטרפרון-γ במחלה החוזרת HSV-1 ^10. כפי שמוצג באיור 3, עכברים שחסרו IFNγ מחלה גרועה קרנית מוצגת מאשר עכברים פראיים מסוג ^14. הוא גם שמש בהצלחה להגדיר את הערך הטיפולי של כמה חיסון שונה בונה ^6,10,11. שים לב כי במקרה אחד החיסון נבדק עבד היטב מונע אבל לא להוכיח להיות טיפולי יעיל ^6. עם זאת,כאשר חיסון נגיפי שכפול פסול נבדק, זה לא היה יעיל רק מונע, אבל היה גם מאוד יעיל טיפולי ^10,11, ראה איור 5 בהתייחסות 10. לאחרונה יש לנו להשתמש במודל זה כדי לקבוע אם הבדלים בין מינים היו להבחין בעכברים שעברו HSK החוזר. כאיור 1 מדגים, C57BL / 6 עכברי זכרים להציג אטימות באופן משמעותי פחות מאשר לעשות קרנית C57BL נקבה / 6 עכברים. כמו כן, כאשר neovascularization קרנית הוערך, עכברי זכרים הפגינו צמיחת כולים משמעותיים פחות חדשה בקרנית מאשר נקבות עכברים (איור 2). אנו בודקים כעת אם זה פנוטיפ הוא זן ספציפי על ידי ביצוע ניתוח דומה בזנים אחרים של עכברים. אנו גם לקבוע אם ההבדל הוא עקב המחסור בטסטוסטרון או הנוכחות של אסטרוגן.

איור 1. מחלות קרניות בC57BL זכר ונקבה / 6 זני עכבר לאחר הפעלה מחדש מושרה UV-B. עכברים נגועים סמוי היו מושרים על מנת להפעיל מחדש עם קרינת UV-B ועכברים היו במעקב לאטימות קרניות במשך 35 ימים. המספרים של עכברים המשמשים למחקרים אלה היו כדלקמן: זכרים, n = 15; נקבות, n = 15. תוצאות מצביעות ± SEM ממוצע. * הייתה מחלה משמעותית יותר וירוס מושרה בעכברי C57BL / 6 מין נקבה, בימים 14-35 (P = 0.001-0.01).

איור 2. מחלות קרניות בC57BL זכר ונקבה / 6 זני עכבר לאחר הפעלה מחדש מושרה UV-B. עכברים נגועים סמוי היו מושרים על מנת להפעיל מחדש עם קרינת UV-B ועכברים היו במעקב במשך neovascularization קרנית במשך 35 ימים. המספרים של עכברים המשמשים למחקרים אלה היו כדלקמן: זכרים, n= 15; נקבות, n = 15. תוצאות מצביעות ± SEM ממוצע. * הייתה מחלה משמעותית יותר וירוס מושרה בעכברי C57BL / 6 מין נקבה, בימים 14-28 (P = 0.001-0.01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הדגם החוזר של קרנית סטרומה herpetic (HSK) המתואר כאן מאפשר לחוקר ללמוד HSK האנושי במודל שהוא מתאים יותר למה שהוא ציין במהלך מחלה האנושית. לכן, העוצמות של המודל הן כי מחלה מתרחשת בהקשר של מערכת חיסון שיש כבר על ידי גירוי במחלה ראשונית. מאז העכברים האלה כבר יש תגובה חיסונית לHSV-1,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Human Serum	Sigma	S7023
L-Glutamine	Cellgro	25-005-C1
Pen/ Strep	Sigma	P4333
Fungizone	Invitrogen	15290018
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Centrifuge	Beckman	52-21
Transilluminatior	UVP	95-0452-02
Sonicatior	Branson	Sonifier 450
Oak Ridge Tubes	Nalgene	Z 720410
Flasks- 7150	Corning	430823
Plates- 12 well	Corning	CLS 3513
Plates- 48 well	Corning	CLS 3548
Sterile Conical Tubes- 30 ml	Corning	CLS 430828
Sterile Cotton-tipped Applicators	Fisher	23-400-125
30G Needles	Becton-Dickinson	305106
25G Needles	BD	305122
10 ml Syringe	BD	309602
10 ml Syringe	BD	309604