ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Method Article

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.

Abstract

האפיון של ביטוי גנים בתאים באמצעות מדידת רמות ה-mRNA הוא כלי שימושי בקביעה כמה מכונות התעתיק של התא מושפעות מאותות חיצוניים (לדוגמה: טיפול תרופתי), או כמה תאים שונים בין מצב בריא ומצב חולה. עם כניסתו ועידון מתמיד של טכנולוגיית רצפי DNA של הדור הבא, RNA-רצף (RNA-seq) הפך שיטה פופולרית יותר ויותר של ניתוח transcriptome לקטלג את כל המינים של תמלילים, כדי לקבוע את מבנה התעתיק של כל הגנים הביעו ולכמת הרמות המשתנות הביטוי של המערך הכולל של תמלילים בניתן ^1,2 תא, רקמה או אורגניזם. RNA-seq הדרגה מחליף מערכי DNA כשיטה מועדפת לניתוח transcriptome כי יש לו את היתרונות של אפיון transcriptome מלא, ומספק נתון סוג דיגיטלי (מספר העתק של כל פרוטוקול) ולא להסתמך על כל sequen הגנומי ידוע³ לספירה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומפורט כדי להחיל RNA-seq לtranscriptomes פרופיל בתאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה תחת הכותרת שלנו "RNA-seq חושף transcriptome רומן של גנים וisoforms בתאי כלי דם ריאתי אדם שטופלו באנדותל טרומבין," ⁴ שבבצענו ניתוח transcriptome המלא הראשון של תאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל בהצלחה טופל בתרומבין באמצעות RNA-seq. הוא הניב משאבים חסרי תקדים לניסויים נוספים כדי לקבל תובנה לתוך מנגנונים מולקולריים שבבסיס תפקוד האנדותל תרומבין בתיווך בפתוגנזה של מצבים דלקתיים, סרטן, סוכרת, ומחלת לב כלילית, ומספק לידים חדשים פוטנציאליים למטרות טיפוליות למחלות אלה.

טקסט התיאורים של פרוטוקול זההוא מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון מתאר את הטיפול בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם תרומבין ו-RNA בידוד, איכות ניתוח וכימות. החלק השני מתאר את בניית ספרייה וסדר. החלק השלישי מתאר את ניתוח הנתונים. החלק הרביעי מתאר assay אימות RT-PCR. תוצאות מייצגות של כמה צעדים מרכזיים מוצגות. טיפים או אזהרות שימושיים כדי לשפר את ההצלחה בשלבים עיקריים מובאים בסעיף הדיון. למרות שפרוטוקול זה משתמש בתאי אנדותל כלי דם ריאתי אדם שטופלו בתרומבין, זה יכול להיות כללי לtranscriptomes הפרופיל בשני תאי יונקים ושאינם יונקים וברקמות שטופלו בגירויים שונים או מעכבים, או להשוואת transcriptomes בתאים או רקמות בין מצב בריא ומצב של מחלה.

Protocol

תרשים זרימה מתאר פרוטוקול זה מוצג באיור 1.

1. טיפול בתאים עם טרומבין, RNA בידוד, הערכת איכות וכימות של RNA

תאי תרבות אנושי ריאות כלי דם (אנדותל HMVEC-LBL) למפגש 90-100% בצלחות 6-גם במדיום EGM-2 עם 5% FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה (Lonza, חתול # CC-3202).
שינוי תקשורת לתקשורת הרעבה (0% FBS) 30 דקות לפני הטיפול עם תרומבין.
פנק את התאים עם 0.05 U / ml תרומבין או להשאיר מטופל כשלט עבור 6 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2.
בודד RNA כלל מהתאים שטופלו ושליטה באמצעות Ambion מיר נה הערכה לפי הוראות היצרן.
להעריך את איכות RNA עם שבב RNA האיקריוטים StdSense Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
לכמת את RNA באמצעות שיטת spectrophotometric סטנדרטית.

2. בניית הספרייה ורצף

השתמש מיקרוגרם 1 של RNA באיכות הגבוהה הכולל לדוגמה כחומר מוצא.
כדי לבנות את הספרייה, בצע את ההליך הסטנדרטי מIllumina (פרוטוקול # 15008136 כומר). בפרוטוקול זה, שני סיבובים של פולי () בחירות mRNA מכילים מבוצעים כדי להסיר rRNA כדי למזער את רצפי rRNA.
להעריך את איכות הספריות באמצעות שבב ה-DNA 1K Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion (www.bio-rad.com).
לכמת את הספרייה באמצעות qPCR: השתמש בספרייה שבעבר כבר רצף כעקומה ופריימרים ספציפיים למתאמי הגבעול סטנדרטי. השתמש במגוון של דילולים של ספריות לא הידועות (כלומר 1:100, 1:500 ו1:1,000). הפעל qPCR עכוrding לפרוטוקול MM SyberGreen ולחשב את ריכוז המנייה המקורית של כל ספרייה.
לדלל את המניות לספריית 10 ננומטר ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לאשכול תא זרימה.
כאשר מוכן לאשכול תא זרימה, להפשיר את הצלחת מגיבה CBOT באמבט מים. CBOT הוא מכשיר Illumina משמש כדי לייעל את תהליך יצירת האשכול.
שטוף את מכשיר CBOT.
לפגל ספריות: שלב 13 מיקרומטר ספריית 6 μl 10 1x TE μl ו, לצדו של הצינור, להוסיף 1 μl 1 N NaOH (המסופק על ידי Illumina). מערבולת, ספין למטה, דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולמקם את הספריות המפוגלות על קרח.
לדלל את הספריות: לדלל את הספריות המפוגלות עם חיץ הכלאה מראש מצונן (HT1, המסופק על ידי Illumina) על ידי שילוב HT1 ו4 ספריית μl מפוגלת μl 996 לריכוז סופי של 12 PM. הנח את הספריות מפוגלות ומדוללות על קרח.
הפוך כל שורה של צינורות של צלחת CBOT,להבטיח כי כל ריאגנטים מופשרים. הספין למטה הצלחת, להסיר / לנקב את חותמות רדידים ולהעמיס CBOT.
120 μl aliquot של ספריות המדוללות, המפוגלות לצינור רצועה, שכותרתו 1-8. הוסף 1.2 ספריית μl מדוללת, מפוגלת PhiX שליטה (מIllumina) לכל צינור כמחודד בשליטה. מערבולת וספין למטה את הצינורות ולטעון אותם על CBOT בכיוון הנכון (צינור # 1 בצד ימין).
טען תא זרימה וסעפת על CBOT.
השלם את הזרימה לבדוק ולהתחיל לרוץ באשכולות.
לאחר הריצה תושלם, לבדוק משלוח מגיב בכל הנתיבים. שים לב לתופעות חריגות. גם להתחיל לרוץ רצף מייד או לאחסן את תא הזרימה בצינור ספק ב 4 ° C.
הפשר את כל סידור אחר הסינתזה (SBS, Illumina) ריאגנטים.
טען את ריאגנטים למקומות המתאימים במגשים המגיבים, כדי לוודא שלא לגעת בחומרים הכימיים האחרים לאחר שנגע תמהיל המחשוף.
שימוש לאתא n-רצף זרימה (כלומר אחד שמיצה בעבר), ממשלת הקווים המגיבים פעמים.
לנקות ביסודיות את תא רצף זרימה עם EtOH 70% וKimwipes, ואחרי EtOH 70% ונייר עדשה. בדוק את תא זרימה לכל פסים. מחדש לנקות אותו במידת צורך.
טען את תא הזרימה על הרצף ולבצע זרימה לבדוק כדי להבטיח שחותם בין הסעפות ותא הזרימה הוא הדוק.
התחל לרוץ רצף.
להעריך את מדדי האיכות (לדוגמה, צפיפות האשכול, אשכולות שעברו סינון, Q30, עצמה) כפי שהם מתפרסמים בזמן הריצה.
לפקח עצמה לאורך הריצה.
אחרי 101 מחזורי הסקרים, לבצע תפנית כימיה כדי להשלים את 2 קראו: הפשר את ריאגנטים הקצה לזווג והצפת התאגדות הקריאה השנייה (ICB, מרכיב של ריאגנטים SBS, Illumina) ולטעון את החומרים כימיים.
המשך ריצת הרצף, הערכת 2 ^nd לקרוא עצמה, Q30מדדים אחרים nd איכות כמו התקדמות הריצה.

3. ניתוח נתונים

השתמש בגרסה העדכנית ביותר של CASAVA (Illumina, כרגע 1.8.2) כדי להמיר את קבצי הבסיס (הטלפוניים. BCL) קבצים לקבצים. Fastq, הגדרת fastq-אשכול ספירה ל 0 כדי להבטיח יצירת קובץ fastq יחיד עבור כל דגימה . לפתוח את קבצי fastq לניתוח במורד זרם.
לבצע יישור הסוף לזווג שימוש בגרסות האחרונות של TopHat (1.4.1) ^5, שמיישרת RNA-seq קורא לגנומים של יונקים בגודל באמצעות אולטרה aligner התפוקה גבוהה הקצר הקריאה (BOWTIE, 0.12.7) ⁶ וSAMtools (0.1. 17) ^7. SAMtools מיישם כלי עזר שונים למערכים לאחר עיבוד בפורמט SAM. Transcriptome אנושי ההתייחסות ניתן להוריד מiGenomes (www.illumina.com). בריצת TopHat והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים כוללים אפשרות סוג הספרייה כfr-unstranded (ברירת מחדל).
לנוing CuffDiff התכנית, חלק מחפת (1.3.0) חבילת תוכנה ^8, להשוות את תאי תרומבין שטופל לתאי הבקרה לסנן את תמלילי הגנים מתבטאים באופן דיפרנציאלי בעבר על בסיס transcriptome ההתייחסות האנושית. השוואה זו מזהה את ביטוי ההפרש של תמלילים ידועים. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בצורת טבלה. בהפעלת תכנית חפת והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים. אלה תעתיקי גנים עם FPKM <0.05 ו-p> 0.05 מסוננים החוצה.
כדי לזהות isoforms רומן, לרוץ בלי חפת transcriptome הפניה. השווה את קבצי תמליל הדוגמא להתייחסות הגנום באמצעות Cuffcompare ולבדוק את ביטוי ההפרש עם Cuffdiff באמצעות קבצי תמליל תרומבין המשולבים כהגנום התייחסות לניתוח אחד ואת קבצי תמליל בקרה המשולבות כהגנום התייחסות לניתוח שני. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בתבנית טבלאית. שוב, thosתעתיקי גני E עם FPKM <0.05 ו-p> 0.05 מסוננים החוצה. לאחר שלב זה, חוקרים יכולים לבחור כדי להעלות רשימה של תמלילים שדווחו לאחרונה לאתר UCSC הגנום הדפדפן (http://genome.ucsc.edu/) כדי לאמת את תוקפם על ידי בדיקה ידנית.
שלח רשימות של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי לניתוח נתיב שנינות (IPA, www.ingenuity.com) לאפיון של הגנים והשבילים המושפעים מטיפול תרומבין. בשלב זה, חוקרים יכולים לבחור להשתמש באבנט (http://compbio.mit.edu/cummeRbund/), חבילת R אשר נועדה לסייע ולפשט את המשימה של ניתוח חפת פלט RNA-seq, כדי לסייע בניהול, לדמיין ולשלב את כל נתונים המיוצרים על ידי ניתוח Cuffdiff.

4. אימות של תוצאות RNA-seq ידי בזמן אמת-פו כמוניתגובת שרשרת lymerase (qRT-PCR)

לבצע בידוד RNA מוחלט משליטה ותאי תרומבין טופל HMVEC-LBL, RNA איכות הערכה וכימות רנ"א תאר בצעדים 1.4-1.6.
לייצר דנ"א משלים מ1 RNA מיקרוגרם הכולל של כל דגימה עם ערכות עיליות III ראשון גדיל סינתזת מערכת RT, בעקבות הוראות היצרן (Invitrogen, 18080-051).
ביצוע ניתוח qRT-PCR על מערכת Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR באמצעות TaqMan oligonucleotides נועד Assay על פי דרישה לגילוי CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor גורם הקשור 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), וβ-יקטין (ACTB, Hs99999903_m1). כל דגימה הייתה תבנית שווה ערך ל 5 ננוגרם של רנ"א בסך הכל. למדוד לכמת בשיטת DDCt ולנרמל לβ-תקטין. כל assay בוצע על פני לפחות שלוש ביולוגיים משכפל.