<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

Summary

שיטה לבודד את שלפוחית ​​submitochondrial מועשרת במתחמי ה-ATP synthase F1FO ממוח חולדה מתוארת. שלפוחית ​​אלה מאפשרים מחקר של הפעילות של F1FO ATPase המורכב והאפנון שלה תוך שימוש בטכניקה של הקלטת תיקון מהדק.

Abstract

המיטוכונדריה הוא מעורב בפונקציות רבות תאיות חשובות, כולל חילוף חומרים, הישרדות ^1, פיתוח ו, סידן איתות ^2. שניים מתפקידיו החשובים ביותר המיטוכונדריה קשורים לייצור יעיל של ה-ATP, מטבע האנרגיה של התא, על ידי זרחון חמצוני, והגישור של אותות למוות תאים מתוכנת ^3.

האנזים האחראי בעיקר לייצור של ה-ATP הוא synthase F1FO-ATP, המכונה גם ה-ATP synthase ^4-5. בשנים האחרונות, את תפקידו של המיטוכונדריה במוות של תאים אפופטוטיים ונימקים קיבלה תשומת לב רבה. במוות של תאים אפופטוטיים, Bcl-2 חלבונים משפחתיים כגון Bax להזין את הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, oligomerize וpermeabilize קרום החיצוני, משחררים גורמים פרו אפופטוטיים ^ל6 cytosol. במוות של תאי נמקי קלאסי, כגון זה המיוצר על ידי איסכמיה או הפעלת יתר רעילה בתאי עצב, largהדואר, גידול מוסדר היטב בסידן מטריצה ​​תורם לפתיחה נקבובית קרום פנימי, נקבובית מעבר חדירות המיטוכונדריה או MPTP. זה depolarizes הקרום הפנימי וגורם למשמרות אוסמוטי, תורם לקרע חיצוני קרום, שחרור של גורמים פרו אפופטוטיים, ובעיות בתפקוד מטבולי. חלבונים רבים, כולל Bcl-XL ⁷ אינטראקציה עם ה-ATP synthase F1FO, ויסות תפקודו. Bcl-XL אינטראקציה ישירות עם מקטע הבטא של ה-ATP synthase F1FO, ואינטראקציה זו מקטינה מוליכות דליפה בתוך F1FOATPasecomplex, הגדלת התחבורה הנקי של H + על ידי F1FO במהלך F1FO פעילות ATPase ⁸ ויעילות ובכך להגדיל המיטוכונדריה. כדי לחקור את הפעילות והאפנון של ה-ATP synthase, אנחנו מבודדים משלפוחית ​​submitochondrial מכרסם במוח (SMVs) המכיל F1FO ATPase. את SMVs לשמר את השלמות המבנית ותפקודית של ATPase F1FO כפי שמוצג בAlavian et al. כאן, אנו מתארים שיטהשאנחנו השתמשנו בהצלחה לבידודה של SMVs ממוח חולדה ואנו להתוות את טכניקת מהדק התיקון לניתוח פעילות ערוץ (מוליכות דליפת יון) של SMVs.

Protocol

1. בידוד מוח מיטוכונדריאלי (מעובד מתוך בראון MR et al. ⁹⁾

1. להקריב את העכברוש תוך שימוש בשיטות שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC).
2. חותכים את ראשו של בעל החיים על ידי עריפת ראש, לחתוך את העור ולחשוף את הגולגולת.
3. פתח את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוך עם מספריים או rongeur. הסר את המוח.
4. ברר היטב את המוח בלי המוח הקטן במאגר הבידוד (ראה טבלת מס '1) ולהעביר אותו ל5 מיליליטר זכוכית / טפלון homogenizer (ראה רשימת ציוד).
5. Homogenize רקמות בעדינות 10 פעמים (אין בועות), כ 5 דקות.
6. צנטריפוגה מדגם ב 1,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה.
7. שמור את supernatant (המיטוכונדריה וsynaptosomes) וזורקים את הכדור (חומר גרעיני ותא פסולת). צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה.
8. להשליךsupernatant מחדש להשעות גלולה ב 500 μl של הצפת בידוד. לשבש synaptosomes עם כלי שיבוש תא (ראה רשימת ציוד). החל לחץ של 1200 psi במשך 10 דקות, ואחרי לחץ מהיר.
9. שכבת תערובת על הדרגתיים Ficoll (ראה טבלה 2), המקום בSW-50.1 הרוטור צנטריפוגות ב 126,500 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C בultracentrifuge (ראה רשימת ציוד). גלולה היא המיטוכונדריה מטוהרת, השכבה בין הצפיפויות של Ficoll השונים היא synaptosomes בלא הפרעה.
10. לשטוף גלולה ידי צנטריפוגה במאגר הבידוד ב16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה.

2. בידוד Submitochondrial שלפוחית ​​(SMV) (מעובד מתוך צ'אן et al. ¹⁰⁾

1. Re-להשעות המיטוכונדריה במאגר 200 בידוד μl בשילוב עם נפח שווה של 1% digitonin ולאפשר לשבת על קרח במשך 15 דקות.
2. הוסף יותר בידוד Buffאה ו צנטריפוגות ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה. לעשות את זה פעמיים.
3. Re-להשעות גלולה ב 200 הצפת בידוד μl ולהוסיף 2 μl של 10% Lubrol PX (C12E9). לערבב ולאפשר לשבת על קרח במשך 15 דקות.
4. תערובת שכבת בידוד על הצפת, מקום בSW-50.1 הרוטור צנטריפוגות ב 182,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
5. לשטוף סופי גלולה ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה שולחן עליונה בבידוד במאגר 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.

3. הקלטת אלקטרו

1. אסדת electrophysiology טיפוסית כוללת מגבר, מחשב PC מצויד בממשק ממיר Digidata 1440A אנלוגי לדיגיטלי בשיתוף עם pClamp10.0 תוכנה, מניפולטורים, מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות, כלוב פאראדיי.
2. צינורות נימי התכה של זכוכית בורה מוכנסים לתוך Flaming / בראון Micropipette פולר דגם P-87. תכנית פיפטה-חולץ היא מותאמת לליצור pipettes עם התנגדויות בין 80 עד 100 MΩ.
3. SMVs ממוקמים בפתרון תאי פיסיולוגי (ATP הוא הוסיף בזמן המתאים במהלך ההקלטה) (לוח 3). pipettes צמד תיקון מלא עם אותו הפתרון (לא ה-ATP). הקלטות נעשות על ידי יצירת חותם גיגה אוהם על SMVs בטמפרטורת חדר. שלפוחית ​​הם דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד למיקרוסקופ הפוך ניקון או Zeiss.
4. פוטנציאל הממברנה נשמר במתח הנע בין -100 mV ל+ 100 mV לתקופות של 10 שניות. הקלטות מסוננות ב5 קילוהרץ באמצעות מעגלי המגבר. רמת הרעש חשמלי או שאינם ספציפי התועה של הרשות הפלסטינית הן פחות מ 1 רצויה להקלטה מוצלחת.
5. הנתונים מנותחים עם תוכנת Clampfit 10.0 למשל כדי לקבוע תדר ומשרעת של אירועי ערוץ אחד. תלות מתח נקבעה על ידי מתכנן מערכת יחסים מתח נוכחי.

תוצאות

הצעד הראשון של הפרוטוקול שלנו מאפשר לבידוד של מטוהרים המיטוכונדריה, כפי שמוצג על ידי כתם מערבי באיור 1. באיור 2 מוצג דוגמה להקלטת תיקון שלפוחית ​​submitochondrial מוח נגזרת. שימוש בתצורת התיקון מבפנים החוצה אנחנו מדגימים פעילות מווסתת על ידי ערוץ ה-ATP. השליטה (CTL) הקל...

Discussion

השיטות שתוארו במסמך זה יאפשר את בידודה של המיטוכונדריה טהורה בסוף השלב 1 ושלפוחית ​​submitochondrial (SMVs) אחרי שלב 2 מהמוח כולו, ללא הבחנה של תא phenotypes.SMVspurified בשיטה זו בעצם נקיה מזיהום על ידי אברונים subcellular אחרים כפי שמוצג ב איור 1 והעבודה הקודמת שלנו (Alavian KN et al.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	5424 000.410
4639 Cell Disruption Vessel	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	P20314
SW-50.1 rotor	Beckman Coulter
L8-70M Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
Manipulator	Sutter Instrument
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1308325
Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87	Sutter Instrument