Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

Michael D. Leipold; Holden T. Maecker

doi:10.3791/4398

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

את הצעדים הדרושים לכוונון ואופטימיזציה יומיים של ביצועים של cytometer המוני CyTOF מתוארים. תגובות על הכנת מדגם אופטימלי וקצב זרימה נדונות

Abstract

בשנים האחרונות, הניתוח המהיר של תאים בודדים יש בדרך כלל בוצע באמצעות cytometry זרימה ונוגדנים שכותרת-fluorescently. עם זאת, סוגיית חפיפת רפאים של פליטות fluorophore הגבילה את מספר הבדיקות בו זמנית. לעומת זאת, cytometer ההמוני CyTOF החדש על ידי זוגות מדעי DVS מערכת הקדמת תא בודד נוזל ICP-MS. ¹ במקום fluorophores, פולימרים המכילים איזוטופים chelating מתכת מועשרת-מאוד הם מצמידים לנוגדנים או בדיקות ספציפיות אחרות. ^2-5 בגלל טוהר המתכת והרזולוציה המונית של cytometer ההמוני, אין "חפיפת רפאים" מהאיזוטופים שכנים, ולכן אין צורך מטריצות פיצויים. בנוסף, בשל השימוש במתכות lanthanide, אין רקע ביולוגי ולכן אין לה מקבילה של autofluorescence. עם חלון המוני הפורשים מסה אטומית 103-203, באופן תיאורטי עד 100 תוויות יכולות להבחין בו זמנית. כיום, יותר מ 35 ערוצים זמינים באמצעות ריאגנטים chelating הזמינים ממדעי DVS, המאפשר לנתיחת תקדים של הפרופיל החיסוני של דגימות. ^6-7

חסרונות cytometry המוני כוללים דרישה המחמירה לאיזוטופ נפרד מתכת לבדיקה (אין מקביל לפיזור קדימה או בצד), ועובדה שמדוברת בטכניקה הרסנית (אין אפשרות למיון החלמה). התצורה הנוכחית של cytometer המסה יש גם שיעור תא שידור של רק ~ 25%, ולכן דורש קלט מספר גבוה יותר של תאים.

ביצועים יומיים אופטימליים של cytometer ההמוני דורשים מספר שלבים. המטרה הבסיסית של אופטימיזציה היא למקסם את עוצמת האות הנמדדת של איזוטופים המתכת הרצויה (M) תוך מזעור ההיווצרות של תחמוצות (16 '), שיהיה הפחתה בעוצמת אות M ולהפריע לאות רצויה בM 16. הצעד הראשון הוא לחמם את המכונה כל כך חם, אני יציבCP פלזמה כבר נקבע. שנית, את ההגדרות עבור קצב זרימת גז נוכחי ואיפור חייבות להיות מותאמות על בסיס יומי. במהלך איסוף דגימה, שיעור אירועי התא המרבי מוגבל על ידי יעילות גלאי ומהירות עיבוד עד 1000 תאים / 2. עם זאת, בהתאם לאיכות המדגם, שיעור אירועי תא איטי יותר (300-500 תאים / 2) הוא בדרך כלל רצוי שיאפשר רזולוציה טובה יותר בין אירועי תאים ובכך למקסם את הגופיות שלמות על כפילויות ופסולות. לבסוף, ניקוי נאות של המכונה בסוף היום מסייע למזער אות רקע בשל מתכת חופשיה.

Protocol

כל דגימות התאים לCyTOF חייבות להיות קבועות וpermeabilized. זה מאפשר כניסה רבה יותר של intercalator דנ"א המכיל אירידיום, וגם מונע תמוגה תא במהלך הרחצה במים וצעדי MilliQ resuspension מייד לפני ההזרקה לתוך cytometer ההמוני.

1. Start-up של Cytometer ההמוני

פתח את תוכנת CyTOF. בחר הגדרת מכשיר. בכרטיסיית קייג' הכרטיס, לך לפינה ימנית התחתונה ולחץ על מחמם "על" כפתור. הפעל לפחות 15 דקות לפני הזמן רצוי בתנור כדי לאפשר מספיק זמן למעטפת תא התרסיס להגיע 200 ° C.
החלף את המזרק הלבן נור מקרין 3 מ"ל במשאבת המזרק עם מזרק מלא במים טרי MilliQ.
ניקוי nebulizer. Backflush nebulizer באמצעות המזרק והצינורות למשוך 2-3 פעמי citranox 5% הם באמצעות היציאה הקטנה יותר הנוזליות מבוא והקדמת יציאת הגז הגדולה יותר. חזור backflushing עם MilliQ מים לאo להסיר citranox שיורית.
בדקו כדי לוודא שהנוריות בלוח הקדמי של CyTOF הם מוארים כמו באיור 1.

figure-protocol-1327
איור 1. נוריות לוח CyTOF לפני ההפעלה.

פתח שסתום מכל גז ארגון. זה אמור לגרום לאור "הארגון" בחזית כדי להפעיל.
צרף nebulizer לאיפור כניסת גז. הברג החוצה את איפור מחבר צינורות גז ולהסיר את O-טבעת הגומי השחור וחתיכת הפלסטיק החרוטה הלבנה. שים לב "המפרק" הרחב יותר על גזע נמל הקדמת הגז של nebulizer. הנח את המחבר בהקדמת יציאת גז. הנח את טבעת o השחורה מעל הקצה של נמל הדלק, ולאלץ את O-טבעת עבר החלק הרחב יותר של גזע הנמל. מניח את יריעת הפלסטיק לבן חרוטים בראש עם הקצה הצר ציינה, ובורג על צינור גז האיפור.
צרף nebulizer לצינורות המבוא הנוזליים. בזהירות להכניס את הצינור הקטן אל תוך הפתח בקצה nebulizer. תהיינה שתי תחנות, דומות בתחושה לתחנות בmicropipettor. ראשית, לחץ עד שנתקלים בהתנגדות קלה; קצה הצינורית הקטנה צריך להיות בסופו של הקטע הישר של זכוכית. שנית, ללחוץ חזק יותר כדי לאלץ את הסוף של הקטע הישר של זכוכית נוספת לתוך הולם, ולהדק את הבורג מתאים כדי לאטום. הכנס את הקצה של nebulizer לתוך הפתח הלבן במעטפת החימום.
בכרטיסיית בקר RFG של חלון הגדרת המכשיר, לחץ על "התחל פלזמה". מאז nebulizer כבר הוכנס, לחץ על "אישור". התוכנה תהפוך בילר, תתחיל הזרימה של גז, ולהצית את פלזמה. מתח הגלאי יהיה כבש את. יהיה חלון קופץ אומר "רצף הזנק פלזמה סיים בהצלחה" כשסיים, לחץ על "אישור". אורות חדשים צריכים להיות על בפנל הקדמי (איור 2 >).

figure-protocol-2985
איור 2. נוריות לוח CyTOF אחרי הפלזמה והציתה הזנק הושלמה בהצלחה.

הפעלת משאבת מזרק. בפינה הימנית העליונה, לחץ על כפתור הירוק "לשחק" כדי להתחיל במשאבת המזרק ולהתחיל זורם נוזל דרך הצינורות וריסוס מתוך nebulizer. הגדרות ברירת המחדל הן למזרק 3 מ"ל של מים. על מנת שמדגם שזורם דרך לולאת הדגימה, משאבת המזרק חייבת להיות שונה מעת לעת כשהוא פועל מחוץ למים. בחלק העליון של המסך, יש דלפק המציין כמה נוזלים זרמו ממשאבת המזרק. משאבת המזרק תפסיק כאשר מונה זה מגיע "3.000" או הבוכנה פוגע בסופו של המזרק. בעת מילוי במזרק, עליך ללחוץ על "עצור" ולא על הכפתור הכחול "שתיקה" על מנת לאפס את המונה.

דואר "> 2. כיול יומי של Cytometer ההמוני

Cytometer ההמוני צריך כ 20 דקות כדי להשיג פלזמה חמה, יציבה לפני הכיול. המטרה של צעדי הכוונון היא למקסם את האות הרצויה של Tm169 או Tb159 תוך שמירה על "Gd155" (תחמוצת; La139 + O16) אות תחת 3% מהערך הגבוה יותר. לחץ על הלחצן הגדרות רכישה כדי לפתוח את חלון הגדרות רכישת נתונים. בכרטיסיית analytes, לחץ על הטבלה המחזורית כדי לפתוח את פנל בחירת איזוטופ. בחר את האיזוטופים בפתרון כוונון מדעי DVS מופיע במדריך, ולאחר מכן לחץ על "שמור".
לחץ על איזוטופים Per קריאת הלחצן כדי לפתוח את המסה (ES) לפי חלון קריאה. בחר "קטניות רוזן", וrescale ציר y על ידי הזנת מספר חדש ולחיצה על "זן".
מלא 1 מיליליטר מזרק ירוק נור מקרין עם פתרון כוונון. הפעל את בורר יציאת מדגם כדי "לטעון", להזרים 450 μl של פתרון כוונון, ואז להפעיל את הבורר ל" להזריק ". בכרטיסיית הכיול ההמוני של הנתונים Acquisit יון חלון הגדרות, לחץ על "הפעל" כדי לפקח שהמונים זורמים על ידי. הצד השמאלי של החלון הוא מסה נמוכה יותר, ואילו בצד ימין הוא מסה גבוהה יותר. הערה: יש כבר יהיו סימנים באזור 9400-9800 TOF, עקב איזוטופים קסנון בגז הארגון (איור 3). חכה עד איזוטופים פתרון כוונון יתחילו להופיע כפסים בתצוגה זו (איור 4).

figure-protocol-5206
איור 3. חלון המוני כיול כרטיסייה, רמות רקע מראה לאיזוטופים שונים לאחר פתרון לשטוף ומים לשטוף. האזור סביב TOF 9400-9800 מתאים לאיזוטופים קסנון בגז הארגון, ותמיד צריך להיות נוכח. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
איור 4. חלון כרטיסיית כיול המוני, מראה פסים אנכיים לאיזוטופים שונים בפתרון כוונון DVS. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

חזור למסה (ES) לפי קריאת חלון ולחץ על הכפתור הירוק "Play" בפינה השמאלית העליונה. כל איזוטופ נבחר בשלב 2.1 מיוצג על ידי קו בצבע שונה. ציר x ברירת המחדל הוא "זמן", בשניות. לנטר את הרמות של איזוטופים השונים עד שהם יציבים.
כוונון של נוכחי. בכרטיסיית הפרמטר של חלון הגדרות רכישת הנתונים, בחר "נוכחי" מהתפריט הנפתח. בואו נתחיל = 0, גימור = 10, ערך צעד = 0.5, זמן התישבות = 200, ולחץ על "שמור". לחץ שוב על המסה (ES) לפי חלון קריאה ומשחק להיט. ציר ה-X הוא עכשיו "נוכחי". שים לב שבו אותות של איזוטופים השיא (איור 5), וr ecord. תחת כרטיסיית הגדרת DAC ערוצים של חלון הגדרת המכשיר, לגלול למטה כדי "נוכחי" ולהיכנס לערך חדש. לחץ על "הגדרת ערך נוכחי בפועל", ואז "לחסוך".

figure-protocol-6919
איור 5. פרופיל כוונון נוכחי.

כוונון של גז האיפור. שינוי תפריט נפתח ל" גז איפור ". בואו נתחיל = 0.55, סוף = 0.95, ערך צעד = 0.05, זמן התישבות = 200. לחץ לשמור. לחזור למסה (ES) לפי חלון קריאה ומשחק להיט. ציר ה-X הוא עכשיו שיעור "איפור גז" זרם. להקליט בו את האותות של שיא איזוטופים. שים לב לעלייה המהירה של האות "Gd155" הקרוב לסוף (איור 6). חזור אל כרטיסיית הגדרת ערוצי DAC, לגלול למטה כדי "איפור גז", ולהיכנס לערך חדש. לחץ על "הגדרת ערך נוכחי בפועל", ואז "לחסוך".

igure 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
איור 6. פרופיל כוונון גז איפור.

יחס של הקלטה רצויה תחמוצת לעומת איזוטופ. הפוך הזרקת μl 2 450 של פתרון כוונון. בכרטיסיית הפרמטרים, בחר "זמן" מהתפריט הנפתח, בואו נתחיל = 0, סוף = 10, ערך צעד = 1, והתיישב זמן = 200. לחץ על "שמור". הכה "לשחק" במסה (ES) לפי קריאת חלון. לאחר הקווים התייצבו (איור 7), השתמש בסמן כדי לקרוא את הערך בתיבות השמאליות העליונות לTm169 או Tb159 (ערך גבוה יותר) וגם את הערך "Gd155" (<3% מהערך הגבוה יותר). ערכים אלה ניתן גם לשמור בקובץ כוונון לשימוש עתידי.

figure-protocol-8488
איור 7. מדידת עוצמת אות פתרון כוונון לאחר אופטימיזציה גז נוכחי ואיפור.

ניקוי של סםלולאת ple. הזרק 3 מ"ל של מי MilliQ דרך לולאת הדגימה, ואחרי 500 μl של פתרון שטפי DVS. המעקב אחר ההתקדמות של הניקוי על ידי לחיצה על "לרוץ" בכרטיסיית הכיול ההמוני. שטוף עד עוצמת הפסים (איור 4) מתחילה לרדת, לאחר מכן פעל על ידי 3 מ"ל של מים ולפקח MilliQ עד למטה לרמות רקע (איור 3).

3. דוגמאות ריצה

פתח את חלון הרכישה. הגדרות ברירת מחדל: האם ניתוח = On-the-fly, אות לניתוח = כיול רוזן כפול, כפול = נתונים. הפחתת רעש נבחרה. כל אלה עשויים להיות שונים אם ירצו בכך. הזן את שם הקובץ. כל הקבצים חייבים להיות נשמרו :/ E / כונן.
הגדרת עיכובי רכישה. יהיה עיכוב קל ברישום אירועי תא של כ 30 שניות עקב אורכו של הצינור בין לולאת הדגימה וnebulizer. לפיכך, הסכום הכולל של "עיכוב רכישה" ו" רח הגלאיעיכוב היכולת "צריך להיות לפחות 30 שניות. עיכוב יציבות גלאי צריך להיות לפחות 20 שניות.
הגדרת זמן איסוף נתונים. "זמן רכישה," הוא מספר השניות שרצונך להפעיל המדגם שלך. מילוי לולאת המדגם 450 μl ידרוש 600 שניות כדי להשלים. הוא הציע כי 50-100 שניות תתווספנה לסוף זמן הריצה כדי למזער לשאת על מדגם.
Resuspension של מדגם. כדי למזער את הצטברות המלחים במכונה, הוא הציע שלפחות שתי שטיפות במי MilliQ להיעשות בסוף צביעת התא, ואחרי resuspension סופי במי MilliQ. נפח מי MilliQ משמש לresuspend תא גלול ישתנה בהתאם למספר התאים שנפתחו ובהתאוששות התא לאחר הליך ההכתמה כולו. מקום טוב להתחיל הוא 10 ⁶ (התחלה) תאים / מ"ל. לאחר resuspension, לסנן דרך מסננת תא כדי להסיר אגרגטים.
מדגם החל לרוץ. הזן את שם קובץ חדש למדגם הנוכחי. לעבור את שסתום לולאת דגימה ל" עומס ", להזריק מדגם, לחזור ל" להזריק", ואז "הפעלה" פגעה בחלון הרכישה.
רישום אירועים סלולריים. תאים יהיו מיוצגים בחלון התמונה כאוספים אופקיים של סימנים בכל ערוץ איזוטופ / סמן אנכי (איור 8). בעוד cytometer ההמוני יכול לרשום 1000 תאים / שני, רזולוציה טובה יותר בין אירועים סלולריים בדרך כלל לקבל ב300-500 תאים / sec. זה מתאים לממוצע של 1 ~ רענון תא / מסך. זה עשוי להימשך עד 30 שניות לפני שמונה אירוע התא מתחיל לטפס. זאת בשל עיבוד נתונים "On-the-fly"; אין מידע לאירוע תא הולך לאיבוד.

figure-protocol-11277
איור 8. חלון רכישה במהלך ריצת מדגם, מראה שורות אופקיות של נקודות מתאימות לגורמים הקשורים בשלושה אירועים נפרדים של תאים.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איכות אירועים סלולריים. שים לב כל רקע פסים בכל ערוץ איזוטופ, כמו גם את שיעור אירועי התא. Cytometer ההמוני מכיר "אירוע סלולרי" כעלייה מסוימת באות מעל רקע, כך אות רקע ממתכת או מאוגד נוגדן יכול לשנות את הספירה "אירוע הנייד" בחינם. בנוסף, פועל תאים בריכוז גבוה מדי עלול לגרום לעלייה במספר אירועי מקטורן. רקע יכול להיות מופחת על ידי כביסות נוספות או דילול תא גדול יותר. כפילויות ניתן למזער על ידי דילול תא גדול יותר, במחיר של זמן ריצה מוגברת.
גימור מדגם רכישת נתונים. כאשר זמן הרכישה הושג, איסוף הנתונים יסיים. יהיה קצת עיכוב לפני חלון קופץ עם הלחצן "אישור" מופיע, שוב, זה נובע "On-the-fly" עיבוד נתונים. רכישת מדגם יכולה להיות גם הפסיקה prematurely על ידי לחיצה על הכפתור "העצור". במקרה זה, את כל האירועים הסלולריים כבר רשומים ייספרו והמעובד לתוך קבצי פלט.
הזרקה של לפחות 500 μl מי MilliQ בין כל דגימה מסייעת גם לצמצם carryover מדגם.

4. ניקוי המחשב לאחר שימוש

שטוף את הפתרון. לאחר המדגם הסופי הוא לרוץ ולולאת הדגימה סמוקה עם מים, להזריק 450 μl של פתרון לשטוף לתוך לולאת הדגימה. לפקח על שחרורו של מתכת חופשיה בכרטיסיית הכיול ההמוני של חלון נתוני רכישת הגדרות כמו בשלב 2.8 (איור 9). כאשר אות המתכת החופשית מתחילה ירידה, שטוף עם 3 מ"ל של מי MilliQ ולפקח עד רמות רקע המושגות.

figure-protocol-13249
איור 9. חלון המוני כיול כרטיסייה, במהלך ניקוי לאחר ריצה עם פתרון לשטוף DVS. את הפסים האנכיים באזור TOF 9800-11000 הם איזוטופים נוגדני תווית שהתנקו מהמכונה. את הפסים האנכיים ברחבי TOF 11500 מתאימים לשני איזוטופים intercalator IR. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.