לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Summary

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

Abstract

הדמיה בדינמיקת vivo של התנהגות תאית לאורך רצף ההתפתחותי יכולה להיות טכניקה רבה עצמה להבנת המכניקה של דפוסי רקמה. במהלך התפתחות בעלי חיים, התפשטות תאים מרכזיות ואירועי דפוסים להתרחש מהר מאוד. לדוגמה, בelegans Caenorhabditis כל חלוקות התא הנדרשות לתכנית גוף זחל סקרים בתוך שש שעות לאחר הפריה, עם שבעה מחזורי mitotic ^1; את mitoses 16 או יותר של התפתחות עוברת תסיסנית להתרחש בפחות מ 24 שעות ^2. לעומת זאת, חלוקות תא במהלך התפתחות צמח הן איטיות, בדרך כלל על סדר יום ^3,4,5. זה מטיל אתגר ייחודי וצורך בהדמיה חייה לטווח ארוך לתיעוד התנהגות דינמית של חלוקת תאים והתמיינות במהלך אירועי organogenesis צמח. האפידרמיס ארבידופסיס הוא מערכת מודל מצוינת לאיתות חקירה, גורל תא, ופיתוח במפעלים. בטבורית, רקמה זו מורכבת מאוויר ותאים עמידים במים וביניהם ריצוף הפיוניות מופצת באופן שווה, שסתום שפתוח וקרוב לשליטת חילוף גזים ואובדן מים. מרווח נכון של הפיוניות אלה הוא קריטי לתפקוד שלהם, ופיתוחם כדלקמן רצף של חלוקה סימטרית ושלבי התמיינות תאים לייצר האפידרמיס המאורגן (1 איור).

פרוטוקול זה מאפשר תצפית של תאים וחלבונים באפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח. מסגרת זמן זו מאפשרת תיעוד מדויק של חטיבות תאי גזע והתמיינותם של תאי אפידרמיס, כולל תאי הפיוניות ומדרכת אפידרמיס. חלבוני ניאון ניתן התמזגו לחלבונים של עניין להעריך הדינמיקה שלהם במהלך חלוקת תאים ותהליכי התמיינות. טכניקה זו מאפשרת לנו להבין את הלוקליזציה של חלבון רומן, ⁶ POLAR, בשלב ההתפשטות של תאי הפיוניות-שושלת בדואר האפידרמיס ארבידופסיס פסיג, שבו הוא מתבטא בתאים שקדמו לאירועי חלוקה סימטריים ועובר לאזור אופייני לקליפת תא זמן קצר לפני חלוקה מתרחשת. תמונות יכולות להיות רשומות ווידאו יעיל בקלות הופק באמצעות תוכנת תחום ציבורית לדמיין לוקליזציה חלבון דינמית וסוגי תאים כפי שהם משתנים עם זמן.

Protocol

1. עיקור זרעים

1. להכין תמיסת זרע עיקור: 33% אקונומיקה ביתית, 0.1% Triton X-100.
2. זרעי Place נשאו מבנה רצוי ניאון כתב (הים) וגנוטיפ (הים) בצינור מ"ל 1.7 ולהחיל 1 מ"ל של תמיסת חיטוי. דגירה על nutator במשך 15 דקות.
3. במכסת מנוע סטרילי, השתמש pipettor להסיר פתרון עיקור מצינור, מותיר אחריו זרעים. לשטוף עם מי 1 מ"ל סטרילי. חזור על התרגיל ארבע פעמים.
4. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך ימים או יותר.

2. הכנה של לשכת שקופיות מדיה

1. ערבב 20 מ"ל של תמיסה 0.5% מאגר Bacto (לא טהור agarose) במים בבקבוק ml 200, ומיקרוגל עד להמסה. היה זהיר בעת הרתחת הפתרון.
2. לקרר את הפתרון לסביבות 60 מעלות צלזיוס
3. איסוף 1 המ"ל של פתרון אגר עם pipettor ולהחיל לאט לכיסוי הזכוכית בתוך השקופית הקאמרית (מערכת Coverglass # 1.5 גרמניה המעבדה Tek השני קבורים). הפתרון which חם מדי או מהר מדי מיושם עלולה להמס דבק או זכוכית סדק.
4. מייד להוסיף מ"ל שני של פתרון אגר. תקשורת אגרה צריכה עכשיו לכסות לחלוטין את החלק התחתון של השקופית הקאמרית. תקשורת המינימאלית זה מספיק כדי לתמוך בפיתוח פסיג מפעל, אשר מכיל חומרים מזינים מאוחסנים, במשך ארבעה עד חמישה ימים על ידי שמירה על לחות ומאפשר חילוף גזים.
5. שקופית מגניבה על benchtop עם חדר מכוסה. אם המכל יהיה מכוסה היטב, פתרון עשוי להישמר וחומם מחדש לשימוש עתידי.

3. Dissection זרעים

1. הסרת צינור זרע סטרילי מ4 ° C אחסון.
2. הנח ממחטת נייר על הבמה של מיקרוסקופ לנתח ולהרטיב במים. התאם רקמות כדי ליצור משטח חלק. רקמה משמשת לייצוב זרעים לנתיחה.
3. Pipet 20-30 זרעים מהצינור לרקמות, תוך שהוא מקפיד למקם אותם בתחום של ביתור ההיקף של נוף.
4. שימוש במלקחיים חדים (Roboz, טיפ # 5 ביולוגיה), להסיר את קליפת הזרע בזהירות מבפנים השתיל. שניהם נעשה עור חיצוני ופנימי יש להסיר.
5. כאשר הדמית הפסיג, זה מועיל להסיר hypocotyl וradicle. פסיגים מכילים חומרים מזינים מספיק כדי לפתח במשך מספר ימים לפי פרוטוקול זה. אם שלם, hypocotyl יתיישרו ולהאריך באופן דרמטי, נע פסיג משדה זמן הפקיעה של נוף. השתמש באזמל כדי לחתוך את הפסיגים ללא hypocotyl.
6. החזק פסיגים גזורים שקועים במים, בmicrotube או דומה.
7. חזור על 3.4-3.6 עד המספר הרצוי של פסיגים הוא הגיע. 15-20 ניתוחים מוצלחים מומלצים לפני שעלה.

4. Cotyledons הרכבה בשקופיות הקאמריות

1. שימוש (18 מ"מ ²⁾ תלוש כיסוי קטן, לחתוך דרך התקשורת אגר ולהרים את כל השכבה מבסיס הזכוכית של השקופיות הקאמריות.
2. Pipet גזור פסיגים עם מינימום של מים מהחזקהצינור לתוך השקופית הקאמרית, מתחת לשכבה אגרה התרוממה.
3. בעדינות להוריד את אגר על גבי הפסיגים. אם מים עודפים הוא הווה, יש להשרות אותו בממחטת נייר, נזהר לא להפריע לפסיגים. דגימות כבר לא צריכות לעבור בקלות כאשר ההר הוא מוחלט.
4. הנח כיסוי על שקופית ושקופית קאמריות מעבר לשלב מיקרוסקופ.

5. זמן לשגות הדמיה

1. הגדרת confocal מיקרוסקופ ההפוך לתמונת fluorophore הרצוי (הים). LSM700 פרמטרים המשמשים ל: GFP, עירור ב488 ננומטר וגבייה עם פס, מסנן ב440-530 ננומטר; למכרז, בעירור 555 ננומטר וגבייה עם פס, מסנן ב570-610 ננומטר.
2. בדוק דגימות רכובות לניזק. לתכנת את המיקומים של שלם, מורכבים כראוי פסיגים לתוך תוכנת מיקרוסקופ. בזן 2009: דגש על פסיג עם 20x אובייקטיבי ולהעביר אובייקטיביים למרכז השקופית קאמרית. תחת מצב רכישה, לשנות זום ​​ל 0.5 וגודל מסגרת </ Em> כדי 48x48 פיקסלים. סמן את תיבת סימון פוזיציות ותמונת סריקת סקירה ... כפתור מתחת פוזיציות, ואז להגדיל את מספר אריחים אנכי ואופקי ל30-35. כאשר הסריקה הסתיימה, לחץ על כפתור המשרות תחת לשונית המידות וכוונת מקום בכל פסיג להתבונן.
3. הגדרת סדרת z מקיפה את האפידרמיס הפסיג מכל זן samples.In 2009: לחץ על תיבת סימון Z-סטאק. בחר כל עמדה תחת רשימת מיקום ולחץ על ההעברה לכפתור. התמקד במישור העליון של האפידרמיס הפסיג ולחץ על הכפתור הראשון שנקבע במסגרת Z-סטאק. פוקוס כדי המיקום הנמוך ביותר שבו האפידרמיס הוא מועיל גלוי ולחץ על הכפתור האחרון הסט. לחץ על הלחצן שליד אופטימלי, המציג את מיטב עובי Z-פרוסה, כדי להגדיר. בדקו כל פסיג כדי לוודא שהגדרות אלה להקיף את כל הדגימות; פרמטרי z לא ניתן להגדיר עבור indivעמדות idual בשנת 2009 זן.
4. הגדרת סדרת זמן ברזולוציה ואורך רצויים. מרווחים של 15-30 דקות במשך שלושה ימים הם יעילים לדינמיקת חלבון בחלוקת תאי האפידרמיס. מרווח זה ניתן לשינוי בהתאם לצורך. בזן 2009: לחץ על תיבת סימון הסדרות עתיות. תחת סדרות עתיות, להגדיר מחזורים למספר התמונות הרצויות באמצעות מחוון או הקלדה בשדה הטקסט. הגדרת פרק זמן ל30 והשתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור דקות.
5. בגין סריקת xyzt במספר המיקומים. שים לב כי מספר התפקידים חייב להיות מוגבל על ידי סריקת המפרטים; אם זמן סריקה כולל הוא גדול יותר מהמרווח הרצוי, את נקודתי הזמן לא תהיינה נכונות. מקסימום של שש עמדות בו זמנית הם אפשרי כאשר ההדמיה GFP וRFP ב59 Z-פרוסות במרווח 30-דק באמצעות המערכת שלנו. בזן 2009: גודל מסגרת שינוי לרזולוציה רצויה ולחץ על התחל ניסוי.

6. עריכת וידאו

1. מקובץ נתוני confocal, להפוך את עוצמתו מרבית Z-השלכה של כל שילוב זמן / עמדה ויצוא כקבצי תמונה בפורמט lossless כמו TIFF. שמות קבצים צריכים להיות בסדרה אחת למשרה (למשל, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, וכו ', לא POLAR-GFP_0001_pos1) לתוכנה לשלב אותם לתוך סרט. בזן 2009: העתק שימוש: Subset תחת לשונית העיבוד לפצל עמדות לקבצים נפרדים, ולאחר מכן הקרנת עצמה מרבית. לבסוף, לייצא כקובץ TIFF (קובץ: יצוא חלון תמונה, תמונה ברזולוציה גבוהה - סדרה).
2. השתמש פיג'י ^7,8 ליישר תמונות רצופות על ידי הפעלת bUnwarpJ ⁹ מאקרו (Plugins: הרשמה: bUnwarpJ). שינוי מצב רישום למונו. כל האפשרויות המתקדמות יכולות להשתמש בערכי ברירת מחדל. לרצפי זמן לשגות ארוכים, להוריד ולהתקין את המאקרו "רישום affine + העקבי אלסטיים 2D תמונה", אשר יחול bUnwarpJ לסדרה של תמונות באופן אוטומטי, וy הפתוחהנתונים שלנו באמצעות קובץ: יבוא: תמונה ברצף כדי להשתמש בו. בטל מגבי חילוץ וטווח ציוני דרך.
3. השתמש בפיג'י / ImageJ או QuickTime Pro כדי לפתוח את הרצף של תמונות מיושרות ולשמור בפורמט וידאו הרצוי (AVI הוא בחירה טובה).

תוצאות

סט של נקודתי זמן אינפורמטיבי שנאספו בשיטה זו הנו שמוצג באיור 3. קרום תא מסומן עם RFP (PM-RB) והוא התמזג GFP לחלבון POLAR תחת האמרגן המקורי שלו (POLAR :: POLAR-GFP) ⁶ בסולם הזמן 30-דקות, אנו רואים חלוקות תא יחד עם השינויים בלוקליזציה חלבון שקדם להם. חלוקות סימטריות ב?...

Discussion

טכניקת confocal זמן לשגות זה מאפשר מחקרים ארוכים טווח של ביטוי ולוקליזציה בתאים בודדים של האפידרמיס הפסיג ארבידופסיס, אשר במקרה של חלבוני POLAR והשני דינמי הוא קריטי להבנה נכונה של תפקודם חלבון מתויג fluorescently. בעבר, זמן לשגות הדמיה מתמשכת נעשתה שימוש כדי לבחון זיהום פט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
אגר Bacto	BD	214010
שקופית אחת קאמרית	Nunc (Thermo Scientific)	155360	או שני הקאמריים (155379)
confocal מיקרוסקופ סריקת ליזר	Zeiss	LSM700	2009 תוכנת זן
עדשה אובייקטיבית 20x	Zeiss	420650-9901	NA 0.8, תכנית-APOCHROMAT
ביתור מיקרוסקופ	נץ (הלאומי)	431TBL	מאיר מלמטה
# 5 מלקחיים, ביולוגית קצה	מכשיר כירורגי Roboz	RS-4978	טיפים יפים מאודהם קריטיים