Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

Summary

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים ל לשעבר vivo הדמיה לחיות להתחקות חלוקות תא בודדות בneuroepithelium עכבר E8.5

Abstract

פיתחנו מערכת המשלבת הדמיה חיה של סמני ניאון ופרוסות של culturing neuroepithelium עכבר העוברי. אנחנו ניצל את קווי עכבר קיים לתא גנטי שושלת התחקות: קו Cre טמוקסיפן מושרה וקו כתב Cre מביע DsRed על רקומבינציה Cre בתיווך. על ידי שימוש ברמה נמוכה יחסית של טמוקסיפן, היינו יכול לגרום לרקומבינציה במספר קטן של תאים, המאפשר לנו לעקוב חלוקות תא בודדות. בנוסף, צפו את תגובת תעתיק לקיפוד איתות קולי (ששש) באמצעות Olig2-eGFP מהונדס קו ^1-3 ואנחנו במעקב היווצרות של ריסים על ידי הדבקת הפרוסה התרבותית בווירוס המבטאת את סמן הריסים, Sstr3-GFP ^4. כדי תמונת neuroepithelium מסקנו עוברים בE8.5, בודד את הצינור העצבי,, רכוב על הפרוסה העצבית בתנאי culturing נכונים לתוך חדר ההדמיה וביצע הדמיה confocal זמן לשגות. האקס שלנושיטת ההדמיה vivo החי מאפשרת לנו לעקוב אחר חלוקות תא בודדות כדי להעריך את התזמון היחסי של היווצרות ראשונית ריסים ותגובה ששש באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ניתן להתאים שיטה זו בקלות באמצעות סמני ניאון ברורים ומספקת בתחום הכלים שבם כדי לפקח על התנהגות תא באתר ובזמן אמת.

Protocol

עכברים בוגרים מורדמים על ידי נקע בצוואר רחם מכאני. נהלי כל החיה שאושר על ידי ועדת IACUC והבטיחות הביולוגית באוניברסיטת אמורי.

1. דור עובר

1. קרוס טמוקסיפן מושרה Cre קו, CAGGCreER, וקו כתב dsRedCre (TG (CAG-Bgeo, DsRed *-MST) 1Nagy) (איור 1) ^5,6. כדי לפקח על התזמון היחסי של תגובה ששש בתאי הבת, צלב CAGGCreER וקו DsRed עם BAC Olig2-eGFP המהונדס העכברים (TG EK23Gsat (Olig2-EGFP)) (איור 1) ^7,8.
2. ממיסים בטמוקסיפן 100% אתנול, ולבצע זריקת intraperitoneal של 2.5 מ"ג לטמוקסיפן 40 גרם של משקל גוף לנשים בהריון בעוברי 6.5 (E6.5) כדי לגרום לביטוי Cre וסימון DsRed בקבוצה קטנה של תאים.
3. 48 שעות מאוחר יותר לנתח עוברים, לזהות עוברים חיוביים dsRed באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להעביר אותם לצלחת התרבות וobservדואר חלוקות תא יחידה במהלך לשעבר vivo ההדמיה (ראה להלן).

2. תרבות העובר עכבר כולו

1. לנתח E8.5 עוברים במדיום לשטוף מחומם מראש המכיל DMEM/F12 (1:1) בתוספת 10% בסרום יילוד עגל ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) ^9.
2. מייד לאחר הנתיחה, עובר מקום על 37 מעלות צלזיוס מתחת שלב חימום מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות כGFP ו / או DsRed חיובי (ראה בהמשך).
3. העברה של עד 2 עובר לירידת 500 μl של תקשורת בתרבות מראש equilibrated המכיל 50% עכברוש סרום מזכר ספראג-Dawley ו -50% DMEM/F12 (1:1) בלי פנול אדום בתוספת L-גלוטמין ו -1% של 1 HEPES ז 0.85% NaCl ו-P / S ^9.
4. למרוח שכבה דקה (0.1 ס"מ) שמן מינרלי אור equilibrated של למעלה מ בינונית על מנת למנוע אידוי ולהעביר את צלחת התרבות המכילה את העוברים ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור.

3.זיהום ויראלי

1. כדי ריסי תווית בneuroepithelium, להוסיף μl 5-10 של Sstr3-GFP lentivirus, כ -2 מיליון virions, לירידת equilibrated μl 500 של מדיום התרבות המכילה E8.5 עובר.
2. לאחר 18 שעות של התרבות, חזרת עוברים נגועים לכמה טיפות של מדיום לשטוף לשטוף את הווירוס ולהכין פרוסה צינור עצבית.

4. הכנה פורסים צינור עצבית עבור הדמית חיה

1. לנתח צינור עצבי של עובר E8.5 במדיום לשטוף מחומם מראש באמצעות מ"מ מיקרו סכין גודל 0.025, על צלחת מצופה אגר 1%.
2. הנח את צד הצינור העצבי המבודד הגחון למטה בירידת 150 μl של מדיום תרבות equilibrated ללא פנול אדום על צלחת 35 מ"מ פולי-L-ליזין המצופה הזכוכית התחתונה.
3. שים כמויות קטנות של תערובת 01:01 עשויים 100% טהורים וזלין ושעוות נר נמס (נר מאיקאה) סביב הצינור העצבי רכוב, ולחץ בעדינות על ידי פיסה צרה של coverslip זכוכית כדילשתק את המדגם.
4. מכסה את התבנית בשכבה דקה (~ 0.1 ס"מ) שמן מינרלי אור equilibrated של (איור 2).

5. חי הדמיה ומיקרוסקופיה confocal זמן לשגות

1. מניחים צלחת תחת ניקון A1R לייזר סריקת מיקרוסקופ הפוך Confocal מצויד בחדר סביבתי המווסת את הטמפרטורה, שנקבעה ל -37 מעלות צלזיוס, ו 5% CO _2.
2. השתמש מטרת נפט הטבילה 60x להקליט ריסי שכותרת GFP ותאים חיוביים dsRed, תוך שימוש מטרת נפט הטבילה 40x לעקוב אחר תאים חיוביים dsRed Olig2-GFP ו.
3. פתח את תוכנת שקל האלמנטים להגדיר תנאי הדמיה זמן לשגות. כל 10 דקות לרכוש Z-ערימות של עד 25 מיקרומטר עם מרווח של 1.5 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X) ועד 8 מיקרומטר עם מרווח של 0.4 מיקרומטר (60x אובייקטיבי). השתמש 488 561 ננומטר ואת אורכי גל העירור וערוץ משודר במידת צורך. לרכוש תמונות בגודל 512 x 512. הגדרת אזורים מרובים למשתמש מוגדר של interest לבצע בו זמנית הקלטה.
   חשיפה אופטימלית לכוח לייזר ובהירות של התמונה הותאמה על ידי שימוש בעוצמה נמוכה לייזר (עד 11% לmCherry 561; עד 4.5% EGFP 405/488), סריקה מהירות 1, 2 קו ממוצע וגודל של חור סיכה (61 מיקרומטר לDsRed; 28.1 מיקרומטר עבור Olig2; 72 מיקרומטר לSSTR3GFP; 61.3 מיקרומטר עבור DsRed וSSTR3GFP; 58 מיקרומטר לDsRed וOlig2). השימוש בכתבי ניאון מקודדים גנטי אפשרו לנו לזהות את הבהירות עם כוח לייזר נמוך.
4. לנתח את הנתונים שנרשמו באמצעות תוכנת שחזור 3D Imaris.

6. Immunofluorescence

1. תקן את העוברים או צינורות עצביים מבודדים בparaformaldehyde 4% / מאגר M 0.1 פוספט על קרח (4 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1 בצלחת זכוכית.
2. לשטוף דגימות שעה 2 בPBS על קרח (4 מעלות צלזיוס) (שינוי PBS כמה פעמים) ולשים בסוכרוז 30% / מאגר M 0.1 פוספט על הלילה או עד שכיור עוברים.
3. שבץ באוקטובר, הקפאת קרח יבש וחנות ב-80 ° C. Perform חתך בcryostat (10 מ"מ).
4. לשטוף שקופיות למשך 10 דקות בתמיסה המכילות 1% לשטוף סרום כבשים חום מומת ו0.1% טריטון X-100 ב PBS.
5. לדלל נוגדנים עיקריים בפתרון לשטוף בבעקבות ריכוזים: העכברוש (5F8,) 1:200 אנטי RFP חד שבטי; ארנב נגד Arl13b סרום 1:1500 ועכבר חד שבטיים אנטי Arl13b 01:05 (295B/54); ארנב נגד Olig2 1:300; monoclonals עכבר Pax6, ששש וכל Nkx2.2-01:10; וארנב polyclonal Ki67 1:500. הוסף סביב 150 μl לכל שקופית בתא humidified שטוח, לכסות עם parafilm כדי למנוע התייבשות ולהשאיר על הלילה ב 4 ° C.
6. לשטוף שקופיות בפתרון לשטוף שלוש פעמים, 20 דקות בכל פעם בטמפרטורת חדר.
7. לדלל המשני נוגדני אלקסה פלואוריד 488, 568, 350 בפתרונות לשטוף ב1:200 ריכוז. השתמש Hoechst 1:3,000 או TO-PRO-3 1:500 להכתים גרעינים. הוסף 150 μl לכל שקופית, להשאיר שעה 1 בטמפרטורת חדר בתא humidified המוגן מפני אור.
8. לשטוף שקופיות בפתרון לשטוף TWפעמים O, 30 דקות בכל פעם בטמפרטורת חדר.
9. הר מחליק ב80% להאריך מגיב אנטי לדעוך זהב ותצוגה בתוך 24 שעות.

תוצאות

כאן אנו ביצע הדמיה לחיות vivo לשעבר של חלוקות תא בודדות בתוך neuroepithelium העכבר E8.5. לתייג תאים בודדים, אנחנו מושרה Cre recombinase בתת קבוצה של תאים המכילים שורת כתב Cre שהביע DsRed על רקומבינציה ^5,6 (איור 3 א). כך, 48 שעות מאוחר יותר היינו מסוגל להתבונן חלוקות תא בודדות ...

Discussion

מערכת vivo לשעבר שלנו מאפשרת לנו להתבונן חלוקות תא בודדות ישירות בתוך neuroepithelium הפיתוח בזמן אמת. כדוגמה נבחנו חלוקות תא בתוך הצינור העצבי העוברי בעכבר והפיקוח או היווצרות cilium או תגובה ששש. אנחנו אישר את תוצאות ההדמיה שלנו (n = 24) עלינו בקנה אחד עם תוצאות מסעיפים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934