לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ"א הגנומי

Summary

תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.

Abstract

5-methylcytosine (5-MC) מהווה ~ 2-8% מכלל cytosines בהדנ"א הגנומי אדם ומשפיע על מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ביטוי גנים, שמירה על שלמות הגנום, החתמה הורית, איון כרומוזום ה-X, רגולציה של פיתוח, הזדקנות וסרטן ^1. לאחרונה, הנוכחות של חומץ 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), התגלתה בתאי יונקים, ובעיקר בתאי גזע עובריים (ES) ותאים עצביים ^2-4. 5-HMC נוצר על ידי חמצון של 5-MC קטליזאטור ידי ט משפחת הברזל (ב ') / dioxygenases α-ketoglutarate התלוי ^{2, 3.} 5-HMC מוצע להיות מעורב בתחזוקה של תא גזע עוברי (MES), hematopoiesis וממאירויות הרגילים, והזיגוטה פיתוח ^{2, 5-10.} כדי להבין טוב יותר את התפקוד של 5-HMC, מערכת רצף אמינה וישירה היא חיונית. רצף יסולפיט מסורתי לא מבחין בין 5-5-HMC מMC ¹¹ 12.

כאן אנו מתארים הליך פשוט שני שלבים לתיוג כימי סלקטיבית של 5-HMC. בשלב התיוג 1, 5-HMC בהדנ"א הגנומי מתויג עם קטליזאטור 6-יזיד-גלוקוז על ידי β-GT, glucosyltransferase מbacteriophage T4, באופן שמעביר את 6-תזיד-גלוקוז ל5-HMC מ העדכון cofactor, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). בצעד, biotinylation השני, מקשר ביוטין דיסולפיד מצורף לקבוצה יזיד ידי לחץ כימיה. שני פעולות ספציפיות ויעילות ביותר, שמובילות לתיוג להשלים ללא קשר לשפע של 5-HMC באזורים גנטיים ונותנים רקע נמוך ביותר. בעקבות biotinylation של 5-HMC, שברי 5-DNA המכיל HMC אז הם כבשו סלקטיביבאמצעות חרוזי streptavidin באופן עצמאי בצפיפות. שברי 5-HMC מועשרי DNA המתקבלים יכולים לשמש עבור ניתוחים במורד זרם, כוללים רצף של הדור הבא.

התיוג סלקטיבית שלנו ופרוטוקול לכידה מקנים רגישות גבוהה, החלה על כל מקור של הדנ"א הגנומי עם שכיחות משתנית / 5-HMC מגוון. אמנם המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא יישומה במורד הזרם (כלומר., הדור הבא של רצף למפות את התפלגות 5-HMC בגנום), זה תואם עם מולקולה בודדה, SMRT (DNA) רצף בזמן אמת, שהוא מסוגל לספק רזולוצית רצף יחיד בסיס של 5-HMC.

Protocol

1. פיצול הדנ"א הגנומי

הדנ"א הגנומי בר באמצעות sonication לטווח גודל רצוי מתאים לפלטפורמת רצף הגנום כולו. (בדרך כלל אנחנו sonicate ל ~ 300 נ"ב.) ודא התפלגות הגודל של הדנ"א הגנומי המקוטע ב% agarose ג'ל 1 (1 איור).

2. הכנת דנ"א

לקבוע את הסכומים המבוססים על דנ"א החל השפע של 5-HMC בהדנ"א הגנומי. מאז רמות 5-HMC להשתנות באופן משמעותי בסוגי רקמות שונים, כמויות DNA החל תלויות ברמות 5-HMC של הדגימות. אנא עיין בטבלת המס '1 לדוגמאות.

3. תגובה מזורז β-GT (תגובת העברת גלוקוז)

1. מערבבים ידי pipetting את התערובת כמפורטת בטבלת 2 ולדגור ב° C אמבט מים במשך 37 שעות 1.
2. לאחר דגירה, לנקות תגובה עם ערכה להסרת נוקלאוטיד QIAquick, באמצעות 10 מיקרוגרם של ה-DNA לעמודה. Elute עם מי μl 30 לעמודה ולשלב.

4. תגובת Biotinylation (לחץ כימיה)

1. הוסף פתרון עובד הצמוד DBCO-SS-PEG3-ביוטין (מ"מ 1) בפתרון ה-DNA eluted (משלב 3) לריכוז סופי של 150 מיקרומטר (כלומר, 5 μl של עובד פתרון לפתרון דנ"א 30 μl).
2. מערבבים ידי pipetting ולדגור ב° C אמבט מי 37 עבור 2 שעות.
3. לנקות תגובה עם ערכה להסרת נוקלאוטיד QIAquick. הנפח הכולל elution האידיאלי הוא 100 μl.
4. לכמת את כמות הדנ"א שנמצא באמצעות ספקטרופוטומטר ההיקף microliter (למשל., NanoDrop).

5. לכידה של 5-DNA המכיל HMC

1. שטוף 50 μl של Dynabeads MyOne streptavidin C1 3 פעמים עם 1 מ"ל של 1X B & W חיץ פי הוראות היצרן. הפרד את החרוזים עם מעמד מגנטי.
2. הוסף נפח שווה של 2X B & W לחיץ התאושש D biotinylatedNA (100 ul) לחרוזים והבהירים.
3. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר עם סיבוב קל על כתף.
4. הפרד את החרוזים עם מעמד מגנטי ולשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של 1X B & W חיץ.
5. Elute דנ"א על ​​ידי דוגר את החרוזים ב100 μl של DTT mM המוכן טרי 50 עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר עם סיבוב קל על כתף.
6. הפרד את החרוזים עם מעמד מגנטי. לשאוב eluent ועומס על 6 טור מייקר יו ספין בהתאם להוראות הייצור להסיר DTT. DNA היעד הוא בפתרון עכשיו.
7. לטהר את הדנ"א eluted מהשלב הקודם על ידי ערכת Qiagen MinElute PCR DNA וטיהור elute ב10 μl של חיץ EB. לכמת דנ"א באמצעות Fluorometer קיוביט, או NanoDrop אם הריכוז גבוה מ 20 ng / ul. ה-DNA היא מוכנה להכנת ספריית מורד הגנום רצף.

6. נציג תוצאות

אם איכות oהדנ"א הגנומי f הוא גבוה, תשואות התאוששות טיפוסיות לאחר β-GT ותגובות biotinylation הן ~ 60-70%. עם זאת, יעילות הלכידה להשתנות באופן משמעותי עם סוגי רקמות שונים בהתאם לרמות 5-HMC של הדגימות. בדרך כלל, את היעילות הלכידה להדנ"א הגנומי מוח היא ~ 4-9%, ובכמה מקרים קיצוניים, היעילות עשויה להגיע עד 12%. לתאי גזע עוברי, יעילות הלכידה הממוצעת היא ~ 2-4%, בניגוד ל~ 0.5% לתאי גזע עצביים. היעילות הנמוכה ביותר שראתה עד כה הייתה להדנ"א הגנומי מתאים סרטניים. כל הדנ"א המועשר מוכן להכנת פרוטוקולים סטנדרטיים של הדור הבא של ספרייה. בנוסף, ה-DNA שנתפס יכול לשמש גם כתבנית לPCR בזמן אמת כדי לזהות את ההעשרה של שברים מסוימים בהשוואה ל-DNA הקלט, אם את פריימרים הקשורים אינם זמינים.

איור 1. ברי sonicated אדם הגנומי DNA ב1% agarose ג'ל. 10 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי המבודד מתאי iPS אדם ב120 μl של 1X TE חיץ היה sonicated באמצעות מכשיר sonication (Covaris). לאחר sonication, 2 μl של דנ"א sonicated הועמס 1% agarose ג'ל באמצעות 100 נ"ב של סמן ה-DNA כדי להשוות את סדר הגודל של מקטעי דנ"א sonicated.

רכיב	נפח	ריכוז סופי
מים	_ Μl
10 X הצפת תגובת β-GT	2 μl	1 X
עד הדנ"א הגנומי מיקרוגרם 10	_ Μl	עד 500 ng / μl
UDP-6-3-N GLC (3 מ"מ)	0.67 μl	100 מיקרומטר
β-GT (40 מיקרומטר)	μl 1	2 מיקרומטר
נפח כולל	20 μl

i) להדנ"א הגנומי רקמות (תכולה גבוהה 5-HMC> 0.1%)

רכיב	נפח	ריכוז סופי
מים	_ Μl
10 X הצפת תגובת β-GT	10 μl	1 X
עד הדנ"א הגנומי מיקרוגרם 20	_ Μl	עד 500 ng / μl
UDP-6-N3-GLC (3 מ"מ)	μl 1.33	100 מיקרומטר
β-GT (40 מיקרומטר)	2 μl	2 מיקרומטר
נפח כולל	40 μl

ii) להדנ"א הגנומי תאי גזע (חציון 5-HMC תוכן ~ 0.05%)

רכיב	נפח	ריכוז סופי
מים	_ Μl
10 X הצפת תגובת β-GT	10 μl	1 X
עד הדנ"א הגנומי מיקרוגרם 50	_ Μl	עד 500 ng / μl
UDP-6-N3-GLC (3 מ"מ)	3.33 μl	100 מיקרומטר
β-GT (40 מיקרומטר)	5 μl	2 מיקרומטר
נפח כולל	100 μl

ג) לדנ"א סרטן התאים גנומית (תוכן נמוך 5-HMC ~ 0.01%)

טבלת 1. דוגמאות לסכומים של ה-DNA קלט ותגובות תיוג באמצעות דגימות עם רמות 5-HMC שונים על ידי שיטת התיוג הכימי סלקטיבית.

מדגם	רמת 5-HMC	דנ"א החל (מיקרוגרם)	התאוששות לאחר תיוג (קלט לחרוזים) (מיקרוגרם)	תשואת שחזור	נפתח דנ"א (נ"ג)	משוך כלפי מטה תניב
מוח קטן עכבר בוגר	0.4%	10	7.5	75%	236	3.1%
מוח קטן עכבר אחרי לידת יום 7	0.1%	11	9	82%	140	1.6%
תא עכבר ES E14	0.05%	60	42	70%	350	0.8%

טבלה 2. נציג תוצאות מרקמות מוח עכבר ותאי גזע עוברי.

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) הוא הווה שינוי epigenetic זיהה לאחרונה בכמויות ניכרות בסוגי תאי יונקים מסוימים. השיטה שהוצגה כאן היא לקביעת חלוקת הגנום של 5-HMC. אנו משתמשים bacteriophage T4 β-glucosyltransferase להעביר מחצית גלוקוז מהונדסת המכילה קבוצה תזיד על קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC. הקבוצה תזיד יכולה לה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	חברה	קטלוג #	הערה
			ריאגנטים
נתרן כלורי 5M (NaCl)	Promega	V4221
חומצת ethylenediaminetetraacetic pH8.0 0.5m (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma בסיס (טריס) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
מגנזיום כלוריד (MgCl 2) 1M	Ambion	AM9530
sulfoxide דימתיל (DMSO)	סיגמא	D8418
20 Tween	BioReagents הפישר	BP337-100
DBCO-SS-PEG3-ביוטין הצמוד	לחץ על כלי כימיה	A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
ערכה להסרת נוקלאוטיד QIAquick	Qiagen	28304
מייקרו יו ספין 6 טור	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
ערכת טיהור PCR MinElute Qiagen	Qiagen	28004
Ultrapure agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-3-N גלוקוז	מוטיב פעיל	55013
			אנזים
β-glucosyltransferase (β-GT)	ניו אינגלנד Biolab	M0357
			ציוד
מכשיר sonication	Covaris
צנטריפוגה שולחן העבודה
אמבט מים	הפישר סיינטיפיק
מנגנון פועל ג'ל	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube אכר	Barnstead
Labquake Tube אכר	Thermolyne
סטנד הפרדה מגנטי	Promega	Z5342
קיוביט 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			התקנת מגיב 10 X תגובת β-GT מאגר (500 HEPES המ"מ pH 7.9, 250 מ"מ MgCl 2) 2 X עקידה וכביסת חיץ (B & W) (10 mM טריס pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% 20 Tween) .