הכנה של קווים סלולריים למציאה מותנית של ביטוי גנים ומדידה של השפעות על מציאת מות תאי E4orf4-induced

Summary

תרומתו של גורם שיפוץ הכרומטין ACF למוות של תאי E4orf4 מושרה נמדדה. הפרוטוקול כולל מבחר של שיבוטים של תאים שבם טיפול דוקסיציקלין גורם מציאה מותנית של ACF יחידות המשנה Acf1 וSNF2h, ולהשתמש של assay DAPI למדוד מות תאים E4orf4 מושרה בשורות התאים מושרות.

Abstract

אינאקטיבציה פונקציונלית של ביטוי גנים בתאי יונקים היא חיונית ללימוד התרומה של חלבון של עניין ^ל1,2 מסלולים השונים. עם זאת, מציאה מותנית של ביטוי גנים נדרשה במקרים שבי מציאה מכוננת אינה נסבלת על ידי תאים לתקופה ארוכה של זמן ^3-5. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנה של שורות תאים המאפשרות מציאה מותנית של יחידות משנה של גורם שיפוץ הכרומטין ACF. שורות תאים אלו יקלו לקבוע את תרומתו של ACF לאינדוקציה של מוות של תאים על ידי E4orf4 חלבון אדנווירוס ^6. רצפי קידוד RNAs מכבנה הקצרה ליחידות משנת Acf1 וSNF2h של גורם שיפוץ הכרומטין ACF היו משובטים ליד אמרגן דוקסיציקלין-מושרה בפלסמיד המכיל גם גן לגן התנגדות נאומיצין. שיבוטים סלולריים neomycin עמידים נבחרו בנוכחות G418 ומבודד. שורות התאים וכתוצאה מכך נגרמות על ידיטיפול דוקסיציקלין, ופעם Acf1 או רמות הביטוי SNF2h הופחתו, התאים היו transfected עם קידוד פלסמיד E4orf4 או וקטור ריק. כדי לאשר את ההשפעה הספציפית של מבני shRNA, רמות חלבון Acf1 או SNF2h שוקמו לרמות WT ידי cotransfection עם פלסמיד Acf1 להביע או SNF2h שניתן היו עמיד לshRNA ידי הקדמה של מוטציות שקטות. היכולת של E4orf4 לגרום למוות של תאים בדגימות השונות נקבעה על ידי assay DAPI, שבתדירות ההופעה של גרעינים עם מורפולוגיות אפופטוטיים באוכלוסיית תאי transfected נמדדה ^7-9.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מנוצל עבור לקבוע את תרומתו הפונקציונלית של חלבונים שונים לאינדוקציה של מוות של תאים על ידי שותפי החלבון שלהם במקרים שבי מציאה מכוננת עשויה להיות תא קטלני.

Protocol

1. דור של שורות תאים מושרים

1. לפני הניסוי אחד צריך למצוא את הריכוז המינימאלי של תרופת G418 שהורג את כל התאים ששמשו לעריכה של שורות התאים רצויות. לצורך כך, צלחת התאים של בחירה בכמה צלחות כפולות ב70% confluency במדיום שישמש במהלך הניסוי ולהוסיף ריכוז גדל והולך של G418 (0-1,000 מיקרוגרם למ"ל). לפקח על התאים היומיים כדי לקבוע את הריכוז המינימאלי G418 שהורג את התאים ביעילות. מוות של תאים נצפה תוך 3-7 ימים.
2. לפני הדור של שורות תאים מומלץ לוודא על ידי מבחני transfection חולפים, שמבטא את פלסמיד shRNA יכול להפחית לכמה ביטוי מידה של הגן נבדק. ניתן לעשות זאת בכל שורת תאים שניתן transfected ביעילות.
3. צלחת T-Rex-293 תאים בצפיפות של כ 5x10 ⁶ תאים לכל צלחת 10 סנטימטרים במ"ל 8 של DMEM בינוני (המכיל 10% ט סאיםהגזע FBS המאושר, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 יחידות למ"ל פניצילין ו0.1 מ"ג למיליליטר סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם למ"ל blasticidin). דגירת צלחות הלילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
4. ביום שלאחר מכן, לשנות את המדיום למדיום טרי מ"ל 8 לפני transfection.
5. Transfect התאים באמצעות 10 מיקרוגרם של pSuperior.neo + GFP פלסמיד (איור 1) הקידוד Acf1 או SNF2h shRNA מונעים על ידי אמרגן טטרציקלין-מושרה H1, כמו גם את גן נאומיצין ההתנגדות התמזג GFP ומונע על ידי אמרגן PGK מכונן. הוסף את ה-DNA של 500 μl של 150 מ"מ NaCl. הוסף למגיב jetPIE aliquot נוסף של 500 μl של 150 המ"מ NaCl בשעת 2 ​​μl לדנ"א מיקרוגרם. הוסף פתרון jetPIE ל-DNA ולערבב היטב על ידי vortexing. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. עדינות פיפטה מתחמי DNA על גבי 10 לוחות הסנטימטר המכילים תאי confluent 70-80%. להחזיר את הצלחות לאינקובטור.
6. למחרת להחליף הבינוני עם מצע סלקטיבי (מדיום DMEM כשתואר לעיל המכיל 500 מיקרוגרם למ"ל נוסף G418).
7. בשבועות הבאים יעקבו אחר התאים ולהחליף את מצע סלקטיבי עם מדיום טרי דומה כל 3-4 ימים עד מושבות תופענה וניתן דמיינו בלי מיקרוסקופ.
8. לפני הבידוד של מושבות, להכין צלחות 24 גם עם מצע סלקטיבי.
9. זהה את המושבות לפי עין, ולסמן את המיקום שלהם בתחתית הצלחת באמצעות סמן צבעוני. ודא מתחת למיקרוסקופ שהמושבות מופרדות היטב.
10. בשכונת סטרילי, לשאוב את המדיום מהצלחת, בעדינות לשטוף עם PBS החם ולשאוב את כל הנוזל שנותר היטב. הוסף 3 μl של 0.25% טריפסין / EDTA למושבה אחת על הצלחת. פיפטה טריפסין שוב ושוב עד שהתאים לנתק ולהוסיף אותם לאחת מהבארות בצלחת 24 היטב. חזור על פעולה זו במשך כמה מושבות אחרות בצלחת.
11. לגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד שהן ממלאות היטב. ואז לפצל את התאים שמקורםכל אחת מהמושבות המקוריות לשלוש בארות, כל אחד בצלחת נפרדת 12-היטב, ודגירת הלילה.
12. ביום הבא, החלף את המדיום בצלחת אחת עם מדיום המכיל מיקרוגרם 1 למ"ל דוקסיציקלין מפתרון מנייה הוכן במים מזוקקי פעמים (1-5 מ"ג למ"ל). החלף את המדיום בצלחת עם שליטה בינונית ללא דוקסיציקלין. דגירת התאים למשך 72 שעות על 37 המעלות צלזיוס, 5% CO _2.
13. תאי קציר מאחד מטופלים ולא מטופלים היטב 1 של כל שיבוט תאים להכנת תמציות חלבונים וניתוח כתם מערבי כדי לקבוע את היעילות של Acf1 או מציאת SNF2h. השתמשו בנוגדנים לAcf1 או SNF2h כמו גם נוגדנים לאלפא טובולין, ושמש כבקרת טעינה. השתמש בתאים בשליש היטב, מטופלת כראוי, להרחבת שיבוטי תא נבחרו בי בנוסף דוקסיציקלין הובילו לירידה של 50% לפחות ברמתו של החלבון נחקר. הקפא aliquots של תאים אלו ב90% FBS, DMSO 10% לשימוש נוסף.

2. אינדוקציה של מציאה וTransfection

1. תאי פלייט במצע סלקטיבי ב10 צלחות סנטימטר. הוסף דוקסיציקלין במיקרוגרם 1 למ"ל למחצית מהצלחות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור 48-72 שעות (ראה איור 4).
2. לאחר 48-72 שעות, trypsinize תאים מכל קבוצה של תאים, לספור אותם, ו1.5x10 ⁶ תאי צלחת לצלחת 6 סנטימטר באותו המדיום, עם או בלי דוקסיציקלין. דגירת התאים ב 37 ₂ לילה המעלות צלזיוס, 5% CO. תכנית, כך שכל קבוצה של צלחות מסעיף 2.1 תספק את התאים ל12 סנטימטר 6 צלחות, כולל שתיים כפילויות assay DAPI עבור כל נקודה, כמו גם צלחת אחת לניתוח כתם מערבי של כל דגימה (ראה איור 4).
3. ביום למחרת transfect התאים בסנטימטר 6 צלחות עם השילובים הבאים של פלסמידים: מיקרוגרם 1 מתוך פלסמיד הריק או כמות זהה של קידוד פלסמיד E4orf4, יחד עם 4 מיקרוגרם של וקטורלהביע Acf1-GFP או SNF2h-GFP שניתנו עמיד לshRNA בשיבוטי התא על ידי הקדמה של מוטציות שקטות, או 3 מיקרוגרם של הווקטור הריק המקביל וGFP 1 מיקרוגרם פלסמיד ביטוי (איור 4). השתמש במגיב jetPIE כפי שתואר לעיל (10 μl לדנ"א 5 מיקרוגרם) להכנת תערובת transfection. לכל מדגם, להכין תערובת transfection לשלוש צלחות.
4. לאחר דגירת 15 דקות של DNA עם ריאגנט jetPIE בטמפרטורת חדר, בעדינות פיפטה כמויות שווות של מתחמי DNA מכל תערובת transfection על שלוש צלחות 6 סנטימטר ולדגור על 37 ₂ לילה המעלות צלזיוס, 5% CO.

3. Assay DAPI בתאי transfected

1. למחרת, לחלץ חלבונים מצלחת אחת לדוגמה לניתוח הכתם המערבי כדי לקבוע שAcf1 או SNF2h כבר דפק ביעילות למטה ושבא לידי ביטוי באופן שווה E4orf4 בדגימות השונות.
2. לשאוב את המדיום מהצלחות המיועדות לDAPIassay, שוטף את הכלים בעדינות עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל של paraformaldehyde 4% מוכנים ב PBS כדי לכסות את התאים. הכנת תמיסת paraformaldehyde והטיפול בתאים עם חומר כימי זה צריכה להתבצע בברדס כימי. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר בלי לרעוד.
3. לשאוב paraformaldehyde ולשטוף שלוש פעמים עם PBS, מתנדנד בטמפרטורת חדר במשך 5 דקות בכל פעם. הוסף אתנול 80% נשמר ב -20 ° C ו הדגירה ב -20 ° C לשעה לפחות 1. הצלחות יכולות להיות כל זמן תחת אתנול ב -20 ° C במשך כמה ימים, כל עוד הם אטומים היטב למניעת אידוי אתנול וייבוש.
4. לשאוב אתנול ולשטוף את התאים פעמים עם PBS ופעם עם PBS-BT (PBS המכיל BSA 0.5% ו 0.05% tween-20), מתנדנד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בכל פעם.
5. כדי למנוע מחייב נוגדן לא ספציפי, לחסום את התאים במאגר 1 המ"ל PBS-BT המכיל 10% בסרום עז למשך 20 דקות בזמן מתנדנד בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לשטוף tהוא תאים פעמים בPBS-BT, 5 דקות כל שטיפה.
6. דגירת התאים עם הנוגדן הראשוני (נוגדן E4orf4 ספציפי במקרה שלנו) ב1 המ"ל PBS-BT לשעת 1 בזמן מתנדנד בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לשטוף פעמים ב PBS-BT ופעם ב PBS המכיל 0.1% BSA, 5 דקות כל שטיפה.
7. דגירת התאים ב1 מ"ל של PBS-BSA 0.1% המכילים נוגדנים המתאימים משני שכותרת fluorescently ו -0.5 מיקרוגרם למיליליטר ריכוז סופי של DAPI ל40 דקות תוך נדנדה בטמפרטורת חדר בחושך. לאחר מכן לשטוף עם PBS למשך 5 דקות, לייבש היטב על ידי שאיפה ולשמור על הצלחות הפוכות לשעה נוספת ללילה להשגת ייבוש מלא. ואז לעלות שקופיות לכסות על התאים, שימוש בפתרון Fluoromount-G. שמור על צלחות ב 4 ° C בחושך עד מוכן לספור גרעינים אפופטוטיים.
8. שאל עמית לזהות את הצלחות השונות על ידי מספרים חדשים, ולכן ספירת גרעינים אפופטוטיים בדגימות השונות ניתן לעשות זאת בדרך בלתי משוחדת.
9. דמיינו את התאים תחת uמיקרוסקופ פלואורסצנטי pright בהגדלה של 400x (באוויר) או 630X (בשמן טבילה). זיהוי תאי transfected אשר מוכתמת של החלבונים השונים הבאים לידי ביטוי בכל מדגם, ולספור את מספר הגרעינים מרוכזים או מפוצלים דמיינו ידי מכתים DAPI בתוך אוכלוסיית תאי transfected. פקח על מספר תחומים ולספור כולל של לפחות 200 תאי transfected.
10. לחשב את אחוז הגרעינים עם מורפולוגיה אפופטוטיים בתוך אוכלוסיית תאי transfected. חזור על הניסוי, עם כפילויות, 2-3 פעמים כדי לחשב את המובהקות הסטטיסטיות של שינויים בין הדגימות השונות.

4. נציג תוצאות

היעילות של מושבות השוררים שבמציאה מותנית של ביטוי גנים הייתה מוצלחת משתנית, תלוי בגן המעורב. בידות שלנו, השיג 7 מושבות מוצלחות מתוך 12 נבדקו לAcf1 ו6 מתוך 18 עבור SNF2h. איור 2 shows צלחת נציג נבחרים שיבוטי תא (איור 2 א), כמו גם מושבה יחידה (האיור 2B). איור 3 מציג כתם נציג מוכן עם חלבונים המופקים מתאים של שיבוטים שונים שגודלו בנוכחות או עדר של דוקסיציקלין במשך 72 שעות. הכתם היה מוכתם בנוגדנים לSNF2h ואלפא טובולין, ושמש כבקרת טעינה. שניים מהשיבוטים (מספר 4 ו 5) הראו ירידה חזקה ברמות SNF2h על אינדוקצית דוקסיציקלין. יש לציין כי למרות pSuperior.neo + GFP פלסמיד (איור 1) המשמש לדור של שורות התאים מקודדות חלבון היתוך הניא GFP, פלואורסצנטי הירוק בשורות תאי היציבות היה נמוכים מאוד וביטוי של חלבוני איחוי אחרים GFP הציג זמנית לתאים אלה ניתן היה לזהות בקלות מעל פלואורסצנטי ירוקת רקע.

ייצוג סכמטי של הניסויים שבוצע בשיבוטים הסלולריים לmeaבטוח השפעת Acf1 או מציאת SNF2h על מוות של תאי E4orf4 מושרה מוצגת באיור. 4. הזמן הדרוש למציאה של ביטוי גנים על ידי טיפול דוקסיציקלין יכול להשתנות בהתאם ליציבות של החלבון שהרמות צריך להיות מופחתות. לAcf1 וSNF2h, טיפול 72 שעות שנדרש למציאה יעילה ברמת החלבון.

איור 5 מראה דוגמה של תאים לבטא E4orf4 וGFP ועוברים מוות של תאים המתבטא בהופעה של גרעינים DAPI מוכתמים עם מורפולוגיה מרוכזת או מפוצלת. איור 6 מציג את תוצאותיו של ניסוי נציג ההוכחה כי Acf1 המציאה דוקסיציקלין מושרה הובילה להגדיל במות מגורה-E4orf4 תא (איור 6 א). גידול זה לא נבע מגידול בE4orf4 רמות (איור 6 ב). יתר על כן, שיקום Acf1 לתאי דוקסיציקלין המושרים פחת העלייה ברעילות E4orf4 לרמות נצפה בתאי uninduced (איור 6).

איור 1. מפה של pSuperior.neo + GFP פלסמיד. המפה מראה אמרגן H1 טטרציקלין-מושרה נהיגת ביטוי shRNA וביטוי נהיגת אמרגן PGK של חלבון היתוך הניא-GFP. המפה הותאמה ממדריך pSuperior OligoEngine.

איור 2. זיהוי של מושבות נאומיצין עמידים. תמונות של צלחת המכילות מושבות () ושל מושבה יחידה (ב ') מוצגות. המושבות התקבלו על ידי culturing התאים במשך 14 ימים במצע סלקטיבי המכיל נאומיצין.

ys ">
איור 3. תאי בדיקה של יעילות מציאה במושבות שנבחרו. ממספר מושבות שנבחרו בנוכחות ניאומיצין היו מצופים בבארות כפולות. אחד טוב של כל דגימה היה מושרה על ידי דוקסיציקלין (+) ואחד טוב שאינו מטופלת כראוי (-). חלבונים שהוצאו לאחר 72 שעות ואינדוקצית chromatographed על SDS-PAGE. הכתם המערבי היה מוכתם ברציפות עם נוגדנים לSNF2h ואלפא טובולין (המשמש כבקרת טעינה) ומראה רמות SNF2h בתאים מושרים ושליטה.

איור 4. תכנון ניסוי assay טיפוסי מציאה-DAPI. צעדים רצופים של הניסוי מוצגים, לרבות טיפול דוקסיציקלין להשיג Acf1 או מציאת SNF2h, transfection לשחזר ביטוי Acf1 או SNF2h או להציג EMPty וקטור ולהציג E4orf4 או הווקטור הריק המתאים לו להיכנס לתאים, וניתוח התוצאות. צלחות דוקסיציקלין טופל מוצגות באדום (DOX) ולוחות בקרה מסומנים בכחול. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5. האיתור של מוות של תאי E4orf4 מושרה על ידי assay DAPI. תאים שעברו את הטיפולים השונים המתוארים באיור 4 קובעו ונצבעו עם נוגדנים ספציפיים E4orf4 וDAPI לדמיין גרעינים של תאי transfected. התמונה ספציפית הזאת נלקחה מן המדגם E4orf4 המכיל החלבון וGFP שליטה. () GFP. (ב) E4orf4. (ג) DAPI. (ד) תמונות ממוזגות. החצים הלבנים הסימן GFP-ותאי E4orf4-transfected המכילים גרעינים עם מורפולוגיות אפופטוטיים. חיצים אדומיםלסמן גרעינים עם צורות חריגות שלא יספר כגרעינים אפופטוטיים. גרעיני כוכביות סימן המיטוטי או גרעינים שפשוט חלקו.

איור 6. Acf1 מציאה משפרת מות תאים E4orf4 מושרה. () תאים משורת תאי T-Rex-293-derived להביע Acf1-shRNA מאמרגן טטרציקלין-מושרה היו מושרים עם דוקסיציקלין (+ DOX) או (-DOX) אינו מטופלת כראוי. שלושה ימים לאחר מכן, התאים היו transfected עם פלסמידים מבטאים E4orf4 (+ E4orf4) או וקטור ריק (-E4orf4) יחד עם וקטור ריק או Acf1 להביע פלסמיד-GFP-tagged, שהפך עמידה לshRNA על ידי ההקדמה של שקט מוטציות. התאים היו קבועים עשרים וארבע שעות לאחר transfection ומוכתם עם נוגדנים לE4orf4 ועם DAPI. אינדוקציה של מוות של תאים נמדדה על ידי assay DAPI תואר לעיל ואחוז of תאי transfected עם גרעינים מרוכזים או מפוצלים נקבעו. ניסוי נציג עם שלוש משכפל מוצג, וברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. (ב) תאים מלוחות מקבילים נקצרו לניתוח כתם מערבי. הכתם היה מוכתם בנוגדנים לE4orf4, GFP, וAcf1. Acf1 אנדוגני וAcf1-GFP מוצגים בשני פנלים נפרדים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מציאה של ביטוי גנים ספציפיים היא גישה חשובה לחקירה של התרומה של חלבון למסלולים רגולטוריים. מאז מציאה מכוננת של ביטוי של גנים חיוניים משפיעה לרעה על שגשוג תאים, מחקרם עשוי לדרוש גם הקדמה חולפת של siRNAs או יישום של מערכות מציאה מותנות יציבות. הדור של שורות תאי יציבות עם ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
גלוקוז DMEM הגבוה	Gibco	41965
ט מערכת FBS המאושר	Clontech	631106
L-גלוטמין	Gibco	25030
פן דלקת	Gibco	15140
0.25% טריפסין-EDTA	Gibco	25200
T-Rex-293 תאים	Invitrogen	R710-07
G418	סיגמא	A1720
blasticidin	Invitרוגן	R210-01
pSuperior.neo + GFP פלסמיד	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	transfection Polyplus	101-40
דוקסיציקלין	סיגמא	D9891
paraformaldehyde	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15710
4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	סיגמא	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01