JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים assay אבחון יקר שעלולים לשמש כדי להחליט הנסיגה של דיכוי חיסוני לאחר השתלה ללא סיכון מוגבר לדחיית שתל. Assay משתמש בעקרונות של רגישות יתר מושהה סוג ומספק הערכה מדויקת של שתי התגובות רכובים על ידי מקבלי חיסון מפעיל ורגולציה הספציפיות תורמות.

Abstract

תגובת רגישות יתר מושהה מסוג (DTH) היא מהירה בביטוי vivo של תגובה החיסונית של תאים תלויות T לאנטיגן זר (Ag) שהמערכת החיסונית של המארח שחוותה בתקופה האחרונה. תגובות DTH לעתים קרובות נחלקות לשלב רגישות, בהתייחסו לניסיון הראשוני אנטיגן, ושלב אתגר, אשר בדרך כלל עוקב אחר כמה ימים לאחר רגישות. חוסר תגובת רגישות יתר מאוחר מסוג להוכיח על ידי בדיקת עור Ag זוכרים נתפש לעתים קרובות כעדות לanergy. Assay DTH המסורתי נעשה שימוש יעיל באבחון זיהומי חיידקים רבים.

למרות שיתוף תכונות דומות חיסוניות כגון חדירה לימפוציטים, בצקת, ונימקו ברקמות, DTH הישיר אינו טכניקת אבחון אפשרית בחולים שעבר השתלה בשל האפשרות של הזרקה הישירה וכתוצאה מכך הרגישות לאנטיגנים תורמים ואובדן שתל. כדי להימנע מבעיה זו, הזמזוםלעכבר "טרנס vivo" assay DTH פותח 1,2. מבחן זה הוא במהותו assay DTH העברה, שבו תאי דם היקפי אדם mononuclear (PBMCs) ואנטיגנים ספציפיים הוזרקו מתחת לעור לתוך הנוצות או שודדים דרכים של עכבר נאיבי ונפיחות דמוית DTH נמדדים לאחר 18-24 שעות 3. מצגת אנטיגן על ידי תאי מציגי אנטיגן אנושיים כמו מקרופאגים או DCs לתאי T ברקמת כלי דם עכבר מאוד מעוררת את המפל הדלקתי ומושכת אליו תאים של מערכת חיסון וכתוצאה מעכבר תגובות נפיחות. התגובה היא אנטיגן ספציפי ודורשת רגישות אנטיגן מוקדמת. תגובת DTH תורם תגובה חיובית בטלביזית assay-DTH משקפת כי מטופל ההשתלה פיתחה נטייה הפרו דלקתית חיסונית כלפי alloantigens שתל.

התכונה החשובה ביותר של assay זה היא שזה גם יכול לשמש כדי לזהות תאי T רגולטוריים, הגורמים לדיכוי עובר אורח. דיכוי של עובר אורחהתגובה זוכרת DTH בנוכחות של אנטיגן התורם היא אופיינית למושתלים עם allografts המקובל 2,4-14. הניטור של מושתלים לalloreactivity ורגולציה על ידי TV-DTH עשוי לזהות תת קבוצה של חולים שיכולים ליהנות מן ההפחתה של דיכוי חיסוני בלי סיכון גבוה של דחייה או תפקוד כליות הולכים ומתדרדר.

אזור מבטיח הוא היישום של assay TV-DTH בניטור של אוטואימוניות 15,16 וגם באימונולוגיה גידול 17.

Protocol

1. הכנה של לימפוציטים מהסוג

  1. איסוף דם לתוך ACD (חומצת ציטראט דקסטרוז) צינורות.
  2. לבודד PBMC מהדם היקפי אנושי טרי באמצעות הפרדה לימפוציטים בינוני על פי שיטות סטנדרטיות.
  3. לשטוף שלוש פעמים עם PBS PBMC להסיר טסיות מזהמות. טסיות דם נמצאו להפריע assay DTH טרנס vivo. זיהום טסיות דם המותר מקסימאלי של הכנת PBMC הוא ≤ 1x10 7 / הזרקה.
  4. אם יש זיהום של תאי דם אדום בולט, לבצע תמוגה של תא אדום באמצעות מאגר תמוגה ACK לאחר הכביסה ראשונה. הסר חיץ ACK על ידי שטיפת 2 פעמים עם PBS.

2. הכנת Alloantigen

  1. לבודד PBMC מתורם הדם ההיקפי באמצעות ההליך המתואר לעיל.
  2. Resuspend התורם PBMC ב PBS בריכוז של 120x10 6 תאים / מ"ל (4x10 6 תאים / μl 30).
  3. הוסף 1 מיקרומטר PMSF לתערובת כדי למנוע חלבוןהשפלה.
  4. Sonicate ההשעיה התא באמצעות פולסים שבע 1 שני עם sonicator מ"מ-בדיקה 2. (שים לב: שמור על קור החומר ולמנוע בועות קצף מוגזמות אם מתרחש, בואו ההשעיה התא לשבת על קרח למשך 2-3 דקות.).
  5. ודא שיבוש> 90% של התאים באמצעות hemocytometer.
  6. צנטריפוגה את התערובת בסל"ד 14,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בmicrofuge בקירור.
  7. העבר את supernatant לצינור בטוח נעילת 2.0 מ"ל חדש ולקבוע את ריכוז חלבון.

3. הכנת תא לזריקות

  1. לכל aliquot הזרקת 7x10 6 PBMC לתוך צינורות בטוחים נעילת 2.0 מ"ל.
  2. צנטריפוגה ב 6000 סל"ד במשך דקה בmicrofuge ולהסיר את supernatant.
  3. Resuspend תאי PBS עם או בלי אנטיגנים. התאם את עוצמת הזריקה ל35 μl עם PBS. התכנית הבאה משמשת לזריקות:
    ביקורת שלילית: PBMC + PBS
    ביקורת חיובית: PBMC + TT / DT (25 & mu, G / הזרקה)
    תגובת אנטיגן ספציפית ניסויית: PBMC + בדיקת Ag (מיקרוגרם / הזרקת 4-8)
    תקנת אנטיגן ספציפית ניסויית: PBMC + בדיקת Ag + TT / DT

4. טרום מדידה, הזרקה, ולאחר המדידה

  1. הרדימי CB17 עכבר SCID עם isoflurane. מדידת עובי שודד אחורי באמצעות קליפר קפיץ. שים קליפר במרכזו של השודד, עם קצה אחד נוגע במשטח ההליכה האחרון של כף הרגל, כדי לספק ביצועים כדי לשמור על אתר המדידה עקבי. עובי שודד נרשם כאשר קריאת מד התייצבה.
  2. לאט לאט להזריק השעיות תא מתחת לעור לתוך לכפות ההרגלים של העכברים באמצעות ½ מזרקים אינסולין סמ"ק עם מחט 28 מד. לבצע הזרקה עם המחט מצביעה לעבר אצבעות הרגליים, והשיפוע כלפי מעלה. (שים לב: לוודא שאין דליפה).
  3. 18-24 שעות לאחר הזרקה, להרדים עכבר עם מדידת isoflurane והחוזרת של נפיחות שודד דרכים.
  4. Subtrלפעול עובי של כל שודד לפני הזריקה מהערך לאחר ההזרקה כדי לקבל את ערך הנפיחות שודד דרכים, מבטא את הנתונים ביחידות של 10 סנטימטרים -4. חישוב אנטיגן ספציפית לנפיחות הנקי על ידי הפחתת שליטה שודד נפיחות (PBMC + PBS) מערכי הנפיחות שודדים הדרכים המתקבלים מהטיפולים (PBMC + תורם alloantigen, TT / DT, או התורם alloantigen + TT / DT). תגובת ביקורת חיובית להיזכר TT / DT של אנטיגן ≥ 25x10 סנטימטר מעל -4 תגובת רקע לPBS נדרש לבדיקה כדי להיחשב חוקי.
  5. לקבוע את העיכוב של תגובות להיזכר בנוכחות של אנטיגנים תורמים ידי השוואת הנפיחות הנקי של כל הזרקה תוך שימוש בנוסחה הבאה:
    figure-protocol-4128

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

1. הערכה של מושתלי כליה לתגובת אנטיגן ספציפית לתורם באמצעות assay TV-DTH

כדי לבדוק את תגובתי תורם-החסינות הסלולר במושתלי כליה שהזרקנו PBMC מחולים אלה עם אנטיגנים תורמים לבד או עם אנטיגן זוכר טטנוס toxoid (TT). כתאי בקרה חיוביים הוזרקו TT לבד. אנו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Assay DTH טרנס vivo הוא בדיקת אבחון רומן עם יישום קליני פוטנציאלי בהערכת תגובות מתווכות תאים בהשתלה, חולי סרטן ואוטואימוניות. זה הוא בעל ערך משום שהוא שימושי לא רק בניטור תגובות מפעיל לא זוכר, אבל גם זה יכול לזהות תגובות T רגולטוריים. דרך אמינה לגילוי הרגולציה DTH אדם עשויה לנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים של כתב היד הזה אין להם ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר בתרומתו של עם VanBuskirk לפיתוח ההבנה של תגובת DTH המוסדרת במושתלים שלנו. עבודה זו נתמכה NIH מענקי PO1AI084853 וR01AI066219-06, ועל ידי מחקר אחד בחסות איחוד אירופי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACD tube for blood collectionBD02-684-26
Lymphocyte Separation MediumCellgro25-072-CV
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineCellgro21-031-CMWithout calcium & magnesium
ACK Lysis BufferBioWhittaker10-548E
TT/DT or EBVSanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSFSigma-Aldrich78830
Eosine for cell countSigma-AldrichE-6003
AlloantigenPurified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubesFisher Scientific06-443-18
10 ml pipettes and pipettorBD Falcon13-675-20
2 ml safe-lock tubesCostar3213
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips
HemocytometerFisher02-671-10
Full size centrifuge and microfugeBeckman Coulter/Eppendorf
1/2cc or 1cc insulin syringesBecton Dickinson14-826-7928 gauge
Vibracell sonicatorDivtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc2 mm probe
Dial thickness gaugeMitutoyo, Japan
SCID miceHarlan
IsofluranePiramal HealthcareInhalant anesthesia

References

  1. Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
  2. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
  3. Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
  4. Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
  5. Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
  6. Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862(2002).
  7. Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
  8. Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
  9. Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
  10. Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
  11. Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
  12. Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
  13. Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
  14. Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
  15. Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
  16. Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
  17. Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

75vivoTV DTHmononuclearPBMCTimmunodeficientSCIDT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved