ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

Summary

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

Abstract

הפיתוח של עצבים היקפיים הוא תהליך מרתק. הנוירונים שולחים אקסונים לinnervate מטרות ספציפיות, אשר בבני אדם הן לעתים קרובות במרחק יותר מ 100 סנטימטרים מסומה של תא העצב. הישרדות עצבית במהלך התפתחות תלויה בגורמי גדילה המופקים מהיעד, אלא גם על התמיכה של תאי שוואן (SCS). לאקסונים קצה זה SC ensheath מאזור סומה העצבית (או המעבר ממרכז למערכת עצבים היקפית) לסינפסה או צומת neuromuscular. תאי שווא הם נגזרים של הרכס העצבי ונודדים כמבשרים לאורך האקסונים המתפתחים עד שכל האקסון מכוסה בSCS. זה מראה את החשיבות של SC הגירה להתפתחות מערכת העצבים ההיקפית ומדגיש את הצורך לחקור את התהליך הזה. על מנת לנתח את SC פיתוח, התקנה יש צורך שליד SCS כולל גם המצע שלהם הפיזיולוגי להגירה, לאקסון. בשל התפתחות תוך רחמית (mus musculus). כדי לעקוף את זה, התאמן גנגליון טכניקת צוואר הרחם המעולה (SCG) explant. לאחר הטיפול בגורם גדילה עצבי (NGF) explants SCG להאריך האקסונים, ואחרי מבשרי SC הנודדים לאורך האקסונים מגנגליון לפריפריה. היופי של שיטה זו הוא שSC נגזר מברכה של SC אנדוגני ושהם נודדים לאורך האקסונים הפיסיולוגיים שלהם שצומחים באותו הזמן. מערכת זו היא מעניינת במיוחד, משום שפיתוח SC לאורך האקסונים יכול להיות מנותח על ידי הדמית זמן לשגות, פתיחת אפשרויות נוספות כדי לקבל תובנה לתוך הגירת SC.

Protocol

1. הכנת ג'לי קולגן

1. הכן בינוני מניות, המכיל 455 MEM μl 10x, ₃ 112 μl 7.5% NaHCO, גלוטמין μl 50 וNaOH. הריכוז וכמות NaOH תלוי בהכנת עכברוש זנב קולגן (ראה 1.2), הנפח הסופי של מדיום המנייה להיות μl 1000.
2. הכן קולגן עכברוש זנב פי Ebendal (1). אחסן את פתרון קולגן ב 4 ° C. שפלה של קולגן הפתרון לא יכולה להיות שנצפתה. לאחר ההכנה של קבוצה חדשה, להעריך את ריכוז NaOH דרוש למדיום המניות (ראה 1.1). השתמש כאינדיקטור של pH של המדיום לטיטרציה של הכמות והריכוז של NaOH. 800 קולגן חומצי μl עכברוש זנב צריך להפוך גוון אדום כאשר מעורבב עם 210 μl של מדיום המניות. אם הריכוז של NaOH הוא נמוך מדי פתרון קולגן יהפוך צהוב, בשל מדד החומציות של המדיום. הוסף קולגן לבינוני ומערבבים ללא לדרבןucing בועות. בצע את השלבים הבאים על קרח. פילמור מתרחש בתוך 2 שעות לאחר פתרון קולגן ובינוני המנייה היו מעורבים והפתרון החדש הודגרו ב 37 ° C. בדיקה זו לפני תחילת ניסוי. 1.3) מערבבים 800 μl של פתרון קולגן עם μl 210 מתוך מניות בינוניות (ראה 1.2). 100 μl המקום של פתרון זה בבארות של שקופיות קאמריות 8 היטב. דגירת השקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ותנאי לחות בתא תרבות חממה. הכן את ג'לי קולגן תחת ספסל תרבית תאים ותנאים סטריליים. קולגן gelatinizes בתוך 2 שעות.

2. נתיחה של SCGs העוברי

1. עוברים של עכברי קציר זמן הריון (E16-18) מהרחם ולשמור אותם בPBS, עד לביצוע הנדרש.
2. לנתח שעוברים אחד מamnion. לערוף את זנב העובר של רמת clavicular. תקן הראש על צלחת תחתית סיליקון עם מחטים "חרקים". צד הגחון של הראש יש לך להתמודדד יש לך לראות את אזור הלסת התחתון. הקיבעון מאפשר הכנה קלה יותר.
3. הסר את העור באזור הלסת התחתון ימינה ושמאלה ועימו רקמת חיבור תת עורית.
4. הסר את בלוטות רוק הלסת תחתונות מהמיקום שלהם כדי לנקות את התצוגה על גבי הלשון ו, שרירי infrahyoidal ושרירי sternocleidomastoid.
5. הסר את השרירים האלה בזהירות כדי לנקות את התצוגה על הגרון וקנה נשימה. הסר את קנה הנשימה והגרון. עורקי הראש הם אז גלויים משני הצדדים על שרירי prevertebral. SCG ממוקם בהסתעפות של עורקי הראש ויש צורת אליפסה. מוציא בזהירות את הגרעינים ולמקם אותם בערוץ המדע. הסר את הגרעינים בעדינות מכלי הנתיחה אם הם דבוקים אליהם. זה מועיל כדי להשתמש במלקחיים וכן מחזיק מחט רכובה עם "מחט חרק" להסרת SCG.
6. פעם ב PBS, לאחסן גרעינים בטמפרטורת החדר בPBS עד שנתחת enouגרעיני gh. ואז לנקות את הגרעינים מכלי דם ורקמות חיבור. לבצע נתיחה וניקוי SCG תחת מיקרוסקופ לנתח תחת ספסל זרימה למינרית.
7. לבסוף, מקם גרעיני explanted על גבי ג'לי קולגן gelatinized בעזרת מחטי מזרק רכובים על מזרק לטיפול קל יותר.
8. דגירת explants SCG על קולגן gelatinized בתא תרבות חממה על 37 מעלות צלזיוס, עם CO ₂ ולחים תנאי 5%.

3. טיפול בexplants SCG

1. לאחר הדגרת 1-2 שעות, לכסות קולגן המכיל explant SCG עם מדיום 100 μl Neurobasal תא התרבות המכיל תוסף B27, גלוטמין ואנטיביוטיקה. עכשיו את הבארות של השקופיות הקאמריות מכילות נפח של 200 μl (ג'ל 100 μl ובינוני μl 100). הוסף 200 μl אחר של המדיום, אולם בה עכשיו NGF (60 ng / ml) כדי להקל על צמיחת אקסונלית. בהתאם לריכוז NGF הסופי הוא 30 ng / ml.
2. 1. כדי לחקור את ההתפרצות של SC הגירה, להוסיף גורמים נוספים ישירות ביום במבחנת 0 (DIV0). ממס את הגורמים במדיום המכיל NGF בריכוז הכפול צורך (2).
   2. על מנת לנתח את ההשפעה על SCS, שכבר נכתב על הנדידה לאורך האקסונים, להוסיף גורמים נוספים בDIV3 עד DIV4 (תחנת פוטנציאל של הניסוי). לשם כך, להסיר בזהירות 180 μl של הפתרון, בDIV3, ולהוסיף NGF 200 μl החדש בינוני מכיל וגורמים הנוספים של ריבית בריכוז הכפול (2).

4. הדמית זמן לשגות

השתמש במיקרוסקופ הפוך לניתוחים. יעדים שונים ניתן להשתמש, מגדיר את שדה הראיה והגדלה. היבט חשוב אחד, עם זאת, הוא מרחק העבודה של המטרה בשימוש, כמו הדמיה של explants SCG מתבצעת באמצעות שקופית הזכוכית וקולגןג'ל. במסגרת שיעור ההקלטה של 1/10-30 דקות הראתה תוצאות טובות (2). עם זאת, היבט זה צריך להיות מותאם לשאלה המדעית. מצלמת CCD רגילה יכולה לשמש לרכישה של תמונה. לזמן לשגות הדמית תא דגירת תרבות תא יש שיצורף לשלב של המיקרוסקופ. דגירת הרקמה במהלך הדמיה על 37 מעלות צלזיוס, עם CO ₂ ולחים תנאי 5%. התחל שעה אחת מערכת הדגירה לפני תחילת ההדמיה. זה מאפשר את חלקי מיקרוסקופ (אובייקטיבי למשל) כולל שקופיות הקאמריות להסתגל לטמפרטורה ומונע מרחף טמפרטורה מושרה. להגדיר אזורים ספציפיים של ניתוחים (בתוך בexplant ובין explants השונה) עם העזרה של תוכנת מיקרוסקופ ושלב תוכנת שליטה ממונעת (התקנת מספר מיקומים) עבור ניתוחים בו זמניים של תנאים מיושמים שונים לexplants SCG. לרקמת זמן לשגות הדמית wildtype כמו גם רקמות מבעלי חיים מהונדסים יכול לשמשסימון SCS (s100b: GFP) (3). לfluorophores הדמית מקור אור ניאון צריך להיות מיושם בהתקנת micropscope. השתמש במסננים סטנדרטיים.

5. כימות של מרחקי SC הגירה

1. בנקודת הסיום (DIV4 למשל), לתקן את ג'לי קולגן עם 4% PFA בשקופית החדר לשעתי 3-4. רצף לשטוף את ג'לי קולגן 5 פעמים למשך 10 דקות עם PBS. החל פרוטוקולים סטנדרטיים לimmunocytochemistry (2). אם אתה חדש להכנת SCGs, לאמת את הזהות של גנגליון כגנגליון אוהד ידי אימונוהיסטוכימיה נגד hydroxylase טירוזין (TH) סמן משותף לתאי catecholaminergic. במהלך אימונוהיסטוכימיה (לאחר הנוגדן הראשוני), להעביר את ג'לי קולגן המכיל explant ל 24 גם צלחות, שיש נפח גדול יותר, שהוא מועיל לשטיפה בג'לי.
2. לאחר אימונוהיסטוכימיה, למקם את ג'לי קולגן בזהירות על שקופיות זכוכית. זהירותלהסיר את הפתרון שנותר ולתת לקולגן לייבש / להתכווץ לשני ממדים. זה מאפשר מדידות קלות של מרחקים (2). אחרי זה, יעלה את הדגימות.
3. לבסוף, למדוד מרחקי נדידה עם העזרה של תוכנת פיג'י (NIH). לא נמצא תוספים מיוחדים דרושים למטרה זו. כדי לאפשר למידות נכונות במיקרומטר, בדוק את מטה הנכונים הדמיה ואת ההגדרות תחת פיג'י, תמונה וקנה המידה. השתמש בפיג'י גם לכימות של תאים.

תוצאות

צמיחת axonal היא הקל מSCG explants על טיפול עם NGF (4) (מזימת סרט ערכת S1 איור 1). תהליך זה נראה בקלות על ידי כל מיקרוסקופ הפוך ויכול להיות מלווה בזמן לשגות הדמיה (סרט S2). אם מדען הוא חדש לביתור SCG מעוברי עכברים אנו ממליצים אימות של הטכניקה על ידי hydroxylase אנטי טירוזין ?...

Discussion

התפתחותה של מערכת העצבים ההיקפית היא תהליך מרתק. כאשר הפיתוח יושלם, אקסונים הensheathed ידי SCS לאורך כל האורך, אשר יכול, בבני אדם, לעתים קרובות יהיה מעל 100 סנטימטר. לצורך כך את המספר הנכון של SCS הנדרש יש שיוקם במהלך הפיתוח וSCS גם צריך לנוע לאורך האקסונים מתארכים לפריפריה כדי ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
MEM 10x	Gibco	21430
סודיום ביקרבונט (7.5%)	Gibco	25080
גלוטמין	Gibco	25030
NaOH	מרק	109137
NGF	רוש	1058231	מו"פ # 556-NG-100
בינוני Neurobasal	Gibco	21103
B27 מוסף	Gibco	17504
אנטיביוטיקה	Gibco	15640
d-PBS	Gibco	14040
מחטי חרקים	FST	26002-20
מחט מזרק	בראון		BD # 300013
שקופית קאמרית 8 היטב	המעבדת tek	177402