Biochip Multi-אנליטי (MAB) על בסיס אלקטרודות יון-All-סלקטיבית של מצב מוצק (ASSISE) למחקר הפיזיולוגי

Summary

אלקטרודות יון סלקטיבית כל מצב מוצק (ASSISEs) הבנויות ממתמר פולימר מוליך (CP) לספק כמה חודשים של חיים תפקודי בתקשורת נוזלית. כאן, אנו מתארים את תהליך הייצור וכיול של ASSISEs בפורמט מעבדה על שבב. ASSISE הוא הוכיח ששמר על פרופיל מדרון קרוב Nernstian לאחר אחסון ממושך בתקשורת הביולוגית מורכבת.

Abstract

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media ^1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H⁺, Ca²⁺, and CO₃^2- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.

The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface ^5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) ^7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).

Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO₃^2- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca²⁺ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.

The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.

Biochip Design and Experimental Methods

The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 μm in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 μm in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.

Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H⁺ and CO₃^2-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO₄) is utilized for Ca²⁺. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K₃Fe(CN)₆)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area ¹⁰. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 μm thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).

The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 μl volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Protocol

1. הכנה של פולי (3,4-ethylenedioxythiophene): פוליפוני (נתרן 4-styrenesulfonate) (PEDOT: PSS) פתרון Electropolymerization עבור H ⁺ ו-CO ² ₃ ^- יונים

1. הוסף 70 מ"ג פולי (נתרן 4-styrenesulfonate) (Na ⁺ PSS ^-) למים 10 מיליליטר deionized (DI) ומערבולת עד התפזר לחלוטין (כ -10 שניות).
2. הוסף 10.7 μl 3,4-ethlyenedioxythiophene (EDOT) לפתרון ב1.1 ומערבולת עד פתרון הוא מעורב לחלוטין.

2. הכנה של פולי (3,4-ethylenedioxythiophene): גופרת סידן (PEDOT: Caso ₄₎ פתרון לElectropolymerization Ca ^{2 +} יונים

1. הוסף סולפט 136 מ"ג סידן (Caso ₄₎ למים די 10 מ"ל ומערבולת; הפתרון לא יהיה לפזר לחלוטין ומופיע חלבי.
2. הוסף 10.7 EDOT μl לפתרון ב2.1 ומערבולת עד מעורבב לחלוטין.

3. Electropolymerization של מבוסס PEDOTפולימר מוליך

1. עמדת תא C3 (איור 3) וEC אפסילון potentiostat / galvanostat Bioanalytical מערכות בע"מ (BASI) משמש כדי ליצור את תא אלקטרוכימי לelectropolymerization. הנח את EDOT: פתרון electropolymerization PSS בתא אלקטרוכימי ובועת חנקן במשך 20 דקות כדי להסיר את החמצן מומס.
2. עכשיו קליפ פלטינה גזה במיקום האלקטרודה הנגדי של תא אלקטרוכימי. לאחר מכן קליפ MAB במיקום האלקטרודה העבודה של תא אלקטרוכימי עם האלקטרודות העבודה מול הפלטינה הגזה. לכוונן את עומק MAB כך שרק אלקטרודות עגולות שקועות בPEDOT: פתרון electropolymerization PSS. יש להימנע ממגע תמיסה עם רפידות המגע החשמליות רבועות.
3. הנח כלוריד BASI רווי כסף / כסף (Ag / AgCl) אלקטרודה בעמדת אלקטרודה ההשוואתית של תא אלקטרוכימי. ודא כי האלקטרודה ההפניה היא לא בעבודה ובין counteאלקטרודות r.
4. לPEDOT: תצהיר PSS: בועת תא אלקטרוכימי במשך 20 דקות, ולהשתמש EC אפסילון potentiostat / galvanostat לרוץ voltammogram מחזורי אחת מ0V - 1.1V עם קצב סריקה של 20 mV / שנייה בקנה מידת μA ± 100.
5. לPEDOT: Caso ₄ בתצהיר: בועת תא אלקטרוכימי במשך 20 דקות, ולהשתמש EC אפסילון potentiostat / galvanostat לרוץ chronopotentiometry ב814 Na למשך 30 דקות.

4. Voltammetry המחזורי של conjugates הפולימר מבוסס PEDOT בK ₃ Fe (CN) ₆

1. לבצע שלבים 3.1-3.3 לעיל.
2. השתמש EC אפסילון potentiostat / galvanostat לרוץ voltammograms המחזורי בודד מ-653 mV ל853 mV עם משתנה קצב סריקה של (25, 50, 75, 100, L25, 150, 175, 200) mV / שנייה בקנה מידת μA ± 10 .

5. פרוטוקול Functionalization משטח

1. הפקדת מוליך פולימר המצומד ספציפית ליונים של עניין כמו בשלב 3.
2. החל קרום בררני כיון בשלב 6.

6. יישום של ממברנה יון סלקטיבי

1. מרכז מב בואקום ספינר צ'אק.
2. קרום μl 100 פיקדון על מרכז MAB והריצה.
3. קרום ספין מעיל יון סלקטיבית עם coater ספין ב 1500 סל"ד במשך 30 שניות עם שניות כבש 5 למעלה ולמטה.
4. ואקום MAB ספין המצופה למשך 30 דקות ואופים את השבב בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

7. כיול של PEDOT-PSS ואטימה פולימר גייט עם pH וקרבונט (CO ₃ ^{2 -)} ממברנה יון סלקטיבי

1. מצב MAB הלילה בסודיום ביקרבונט 10 מיקרומטר (NaHCO ₃₎ ו -5 מ"מ אשלגן כלורי (KCl) בתקשורת אצות.
2. הכנס את MAB לבעל שבב זרימת תאי microfluidic.
3. הזרק פתרון מבחן 5 מ"ל עם ערך pH ראשוני או ריכוז (pH למשל 4 או 10 מיקרומטר לCO ₃ ^{2 -).} הסר bub Bles מבעל שבב זרימת תאים.
4. הנח את בעל שבב זרימת תאים על גבי מתקן החשמלי זרימת התא.
5. פתח את תוכנת אפסילון EC ולהיכנס למצב פוטנציאל במעגל פתוח (OP). קבע את הזמן עד 300 דקות, בקנה מידה המתח ל± 1V, ותדר החיתוך עד 10 קילוהרץ, ולהקליט את הערך כל 2 שניות.
6. בואו MAB לייצב (חפש קו שטוח) לפני שימשיך בתהליך הכיול.
7. ברגע שהוא התייצב MAB, שטוף את תא הזרימה עם פתרון מבחן ולהזריק את הריכוז ליד להיות מכוילים (pH 5 או 25 מיקרומטר CO ₃ ^{2 -).} ודא שאין בועות מותר להיכנס לתא הזרימה. חזור על שלבים 7.5 ו -7.6 עבור ה-pH 6, 7, 8 ו -9 או CO ₃ ^{2 -} ריכוזים של 50, 75, 100, 250, 500, 750, ו -1,000 מיקרומטר.
8. לאחר הריכוז האחרון יש להפעיל, להסיר את MAB ויבש עם אוויר חנקן.
9. מניחים בחזרה MAB לפתרון מיזוג טרי עד לשימוש הבא.

"Jove_title"> 8. כיול של PEDOT: מוליך Caso ₄ פולימר גייט בCaCl ₂

1. מצב MAB הלילה ב7 מ"ל של 0.1 מ 'CaCl ₂ ו -10 מיקרומטר Nano _3.
2. בצע את פעולות דומות ל7.2-7.10. בשלב 8.3, החלף את פתרון מבחן קרבונט עם ריכוז ראשוני של 0.01 מ"מ CaCl _2. חזור על פעולה עבור ריכוזי מבחן פתרון של 0.05, 0.1, 0.5, 1 ו 10 מ"מ.

תוצאות

דוגמה לתוצאת voltammogram מחזורית (קורות חיים) של PEDOT: PSS ושיאו המקביל קתודית הנוכחי _(i P) לעומת שיעור הסריקה (v _1/2) מוצגת באיורים 5 א ו5b בהתאמה. PEDOT: Caso ₄ בקצב סריקה שונים והשיא הנוכחי קתודית שלה לא מוצג. שימוש ^Randles-10 סבצ'יק ניתוח, את פ...

Discussion

MAB biochip מורכב מASSISEs שבנויים מISM גבי שכבת התמרה המצומד CP מבוססת PEDOT על האלקטרודה Pt, שילוב של אשר transduces הריכוז היוני של עניין לאות חשמלי למדידה. פוטנציאל האלקטרודה יציב מוגדר על ידי שתי שכבת המחסום ושכבת ISM. שתי השכבות גם לקבוע את חיי העבודה של MAB והאיכות (רעש, סחיפה) של האות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028
Poly(sodium 4-styrenesulfonate)	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon galvanostat/potentiostat	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
Saturated Ag/AgCl reference electrode	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
Pt gauze	Alfa Aesar	10283
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Potassium nitrate	J.T. Baker	3190-01
Sodium bicarbonate	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S-7127
Calcium chloride	J.T. Baker	1311-01
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Calcium sulphate	Sigma-Aldrich	237132
C3 cell stand	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
Flow-cell chip holder			Custom, courtesy of NASA Ames
Flow-cell electrical fixture			Custom, courtesy of NASA Ames
Table 2. Specific reagents and equipment.