הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

Summary

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor CI ¹.

Abstract

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC) לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו מאפשרת לספור את המספרים של מולקולות חלבון היוצר בתא אחד בחלונות זמן רציפים של חמש דקות. זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם צפיפות הספק עירור ליזר של ~ 0.5-1 קילוואט / ² סנטימטר, שהוא רגיש מספיק כדי לזהות מולקולות חלבון ניאון בודדות בתאים חיים. כתב הניאון בשימוש בשיטה זו מורכב משלושה חלקים: רצף קרום מיקוד, מהר התבגרות חלבון, צהוב ניאון ורצף הכרת פרוטאז. הכתב הוא התמזג translationally לN-הסופי של חלבון של עניין. תאים גדלים על במת מיקרוסקופ טמפרטורה מבוקרת. כל חמש דקות, מולקולות ניאון בתוך תאים הם צלמו (ומאוחר יותר שיתוףunted על ידי ניתוח תמונות פלואורסצנציה) ולאחר מכן photobleached כך שחלבונים שתורגמו רק לאחרונה נספרים במדידה הבאה.

תמונות פלואורסצנציה נובעות משיטה זו ניתן לנתח על ידי איתור נקודתי ניאון בכל תמונה, הקצאתם לתאים בודדים ולאחר מכן הקצאת תאים לשושלות תאים. מספר חלבונים המיוצרים בתוך חלון זמן בתא נתון מחושב על ידי חלוקת עוצמת הקרינה המשולבת של כתמים מהעוצמת הממוצעת של מולקולות ניאון בודדות. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד את רמות ביטוי בטווח של 0-45 מולקולות ב 5 חלונות זמן דקות בודדות. שיטה זו אפשרה לנו למדוד את הרעש בביטוי של λ repressor CI, ויש יישומים פוטנציאליים רבים אחרים בביולוגית מערכות.

Protocol

1. זרימת עבודת הנדסת מתח

1. הכנס קידוד רצפים () רצף קרום לוקליזציה, (ב) חלבון מהיר התבגרות פלורסנט ו( ג) רצף הכרת פרוטאז N-מסוף ולמסגרת עם חלבון של עניין (גורם שעתוק לדוגמה). אנחנו השתמשנו הקרום הממוקד כתב ^TSR-2 ונוס והתמזגנו זה ברצף פרוטאז הכרת יוביקוויטין (UB) לספור את מספר המולקולות הביעו bacteriophage λ מדכאי CI חלבון. פרטים על אופן בו אנו נבנינו חלבון היתוך TSR-ונוס-UB-CI, החלפה פרועה סוג קידוד CI אזור ושילוב המבנה לE. כרומוזום חיידק באמצעות רקומבינציה λ האדום ^3, מתואר בפירוט בנ"צ. 1.
2. לאמת את כל השינויים ברצף.
3. להפוך קידוד פלסמיד פרוטאז ספציפי לרצף ההכרה בשימוש מעל לתוך זן מבטא את הכתב והחלבון פלואורסצנטי של ענייןבהיתוך translational. אנחנו השתמשנו פרוטאז Ubp1, שחותך מייד לאחר שאריות יוביקוויטין C-מסוף ^4.

2. תאי תרבות ולהתכונן לדוגמה

1. בחר אחד E. מושבת coli ריבית מצלחת אגרה טרי מפוספסת למיליליטר M9 מדיה 1 מינימאלית ⁵ בתוספת חומצות אמינו 1X ממ ואנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בייקרה בטמפרטורה רצויה מספיק זמן כדי להגיע OD _600> 1.0 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר).
2. דלל את התרבות למדיום M9 טרי 1 מ"ל באנטיביוטיקה מתאימה לOD ₆₀₀ = 0.02. דגירה בייקרה בטמפרטורה המתאימה. צפיפות תאית ראשונית ניתן להגדיל במידת צורך לצמיחה בטמפרטורה נמוכה.
3. כאשר OD ₆₀₀ = 0.2-0.3 (ב 37 ° C עם תרבית תאים ראשונית בOD ₆₀₀ = 0.02, זה ייקח שעתי 3-4), להתחיל להכין את agarose ג'ל הכרית (שלב 3).
4. התאים מוכנים להדמיה כאשר OD _{600 = 0.3-0.4.}
5. העברת התרבות דגרה 1 מ"ל לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1 בmicrocentrifuge benchtop.
6. בטל supernatant ולהוסיף בינוניים M9 מ"ל טרי 1 וresuspend הגלולה בעדינות.
7. צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1.
8. חזור על השלב 1.6 ו 1.7. השלך את supernatant.
9. resuspend עדינות במיליליטר M9 מדיה 1. תאים יכולים לשמש ישירות להדמית מיקרוסקופ או 10 מדוללים - ל100-קיפול על מנת להבטיח צפיפות נמוכה של תאים להדמית timelapse. שים לב שהצפיפות נמוכה של תאים חשובות להדמית timelapse מורחבת. חדר ההדמיה (שלב 4) הוא חתום במהלך הניסוי. בשל גידול המעריכי של תאים, תאי ריכוזים ראשוניים גבוהים באופן משמעותי יכולים לרוקן חמצן בתוך התא לאחר צמיחה ממושכת בכרית ג'ל, הפחתת הבשלת החלבון פלואורסצנטי ומשפיע על גדילת תאים.

3. הכן את פתרון agarose

1. שוקל 10-20 מ"גהיתוך בטמפרטורה הנמוכה agarose לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
2. הוסף מדיום המתאים M9 נפח מינימאלי ללא אנטיביוטיקה לעשות 3% פתרון agarose.
3. מחמם את פתרון agarose למשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי להמס, היפוך הצינור כדי להבטיח שהפתרון הוא לגמרי נמס והומוגנית. כרית ג'ל אפשר לשפוך בשלב זה (שלב 4) או הטמפרטורה יכולה להיות ירידה ל 50 מעלות צלזיוס והחזיקה למשך מספר שעות לשימוש מאוחר יותר.

4. הכן Pad ג'ל בלשכה

1. אודות 50 דקות לפני ההדמיה, לשטוף שקופית Microaqueduct עם מים.
2. לשטוף 1 ניקה מכסה זכוכית (באמצעות שיטת ניקוי מחמירה כמו זו המתוארת ^ב6) וMicroaqueduct שקופית עם מים סטריליים ויבשים על ידי נשיפה עם אוויר דחוס.
3. הנח את אטם הגומי בשקופית Microaqueduct כך שהוא מכסה את פתחי כניסה ושקעים בצד כוס שקופית Microaqueduct (זה יכול להיות שונה עבור יישומיםשתקשורת היא perfused באמצעות המדגם). החל פתרון 50 μl agarose (שלב 3) למרכז שקופית Microaqueduct.
4. למעלה פתרון agarose עם ניקה זכוכית, היבשה הכיסוי.
5. בואו פתרון agarose לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
6. בינתיים מכין מדגם תא (שלב 2).
7. זהירות לקלף את מכסה הזכוכית מהחלק העליון של כרית ג'ל. הוסף תרבית תאים שטופה μl 1.0 לחלק העליון של כרית ג'ל. חכה ~ 2 דקות לתרבות להיספג על ידי כרית ג'ל. חשוב לא לחכות זמן רב כל כך שoverdries הכרית ג'ל, אבל ארוך מספיק כדי שתאים מודבקים היטב למשטח ג'ל. זמן ההמתנה האידיאלי ישתנה בהתאם לטמפרטורה ולחות.
8. בזמן המתנה, לייבש מכסה זכוכית precleaned אחרת.
9. כסה את המדגם עם מכסה הזכוכית החדשה להבטיח כי מכסה הזכוכית ושקופית Microaqueduct מיושרות היטב.
10. להרכיב את חדר צמיחה בטמפרטורה המבוקרת בהתאם להוראות היצרן.עכשיו זה יכול לשמש להדמיה במיקרוסקופ (שלב 5).

5. הדמיה ורכישת סרטי timelapse

1. הפעל את הליזר ומיקרוסקופ בעקבות הוראות היצרן (למשל הליזר ייתכן שיצטרך התחמם במשך ~ 0.5 שעות לפני הניסוי).
2. נעל את החדר כנס להוספת השלב במיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה של חדר הצמיחה והתנור בטמפרטורה האובייקטיבי צמיחה רצויה אחרת 37 ° C או.
3. אם הדמיה מעל טמפרטורת חדר, המיקוד או כרית ג'ל בדרך כלל נסחף באופן משמעותי ל~ 15 דקות אחרי שינוי הטמפרטורה ההתחלתית. בפועל, להשתמש בזמן הזה כדי למצוא אזורים של עניין ולשנות תסריטי הדמיה לפי צורך לניסוי.
4. מצא את התאים במיקרוסקופ ולאחסן את המיקום של כל תא לאחר שמרכזו בתוך אזור מוגדר מראש הדמיה ומיושרת. יותר מתא אחד יכול להיות צלם בכל חלון זמן רכישת תמונה. לtimelapse הדמיה מעל מ 'דורות כלשהם, ודאו כי תאי הדמיה מופרדים בתחילה מתאים אחרים בלפחות כמה מאה מיקרומטר כך שמושבות אחרות לא להיכנס לאזור ההדמיה במהלך צמיחה.
5. התאם עוצמת עירור ליזר, כך שכמעט כל photobleach ניאון המולקולות בתוך 6 חשיפות (איור 5).
6. באמצעות הסקריפט אוטומטי הדמיה / יומן, איסוף נתוני timelapse שימוש באלגוריתם שתואר בעבודה הניסיונית באיור 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תוצאות אופייניות מניסוי CoTrAC מעקב הייצור של λ repressor CI מוצגות באיורי 4, 5. בניסוי זה, 12 מושבות צלמו במרווחי 5 דקות. בכל נקודת זמן, מושבת autofocused הראשון ורכזה בתוך אזור ההדמיה. בשלב הבא, העמדה במרכז / ממוקד הייתה מאוחסנת ותמונת brightfield נרכשה. אז הבמה הייתה translocated ידי ~ 0.5...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטת CoTrAC ניתן להכליל למדוד את הייצור של חלבונים אחרים כאשר N-או קונבנציונלי fusions החלבון פלואורסצנטי C-מסוף עלול לשבש את פעילות חלבון. אסטרטגית CoTrAC יש שלושה יתרונות ייחודיים על פני שיטות קיימות. ראשית, ההיתוך משותף translational מבטיח שמולקולה אחת של כתב הניאון מיוצרת עבור כל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
Agarose (טמפרטורת התכה נמוכה)	Lonza	50100
מילי-Q H 2 O
5 × מלחי M9			המתכון הבא מתואר ב9
20% גלוקוז
MgSO 4
CaCl 2
50 × פתרון חומצת אמין MEM	Invitrogen	11130-051
צמיחת טמפרטורה מבוקרתלשכה מתאם שלב	BIOPTECHS	FCS-2
מחמם אובייקטיבי	BIOPTECHS	מודל תלוי במטרת מיקרוסקופ
Microaqueduct שקופיות	BIOPTECHS	130119-5
משקפים לכסות Micro	VWR	40CIR-1	יכול להיות קשה למקור; זמין גם BIOPTECHS
כיסוי זכוכית / אטם שקופית	BIOPTECHS	0.75 מ"מ FCS2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	שונה	הגדרת דוגמה: קוהירנט Innova 308C ארגון יון הליזר, אולימפוס מיקרוסקופ IX-81, 1.45 אובייקטיבי אולימפוס PlanApo 100X NA, Metamorph תוכנה	חייב להיות עירור ליזר, שלב xyz אוטומטי, תוכנת אוטומציה מסוגלת הדמיה ופוקוס אוטומטי תסריט, אופטיקה מסוגלים Resolvinחלבוני ניאון בודדים גרם
מצלמת EM-CCD	שונה	הגדרת דוגמה: תידור iXon DU-898	חייב להיות רעש נמוך מספיק כדי לזהות חלבוני ניאון בודדים מעל הרקע