נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

Summary

שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.

Abstract

כל decellularization האיבר זלוף המבוסס צבר לאחרונה עניין בתחום הנדסת רקמות כאמצעי ליצור פיגומים תאיים מטריקס ספציפיים לאתר, תוך שמירה על מידה רבה את הארכיטקטורה המקורית של הפיגום. עד כה, גישה זו נוצלה במגוון רחב של מערכות איברים, כוללת לב, ריאות, הכבד ^ו1-5. שיטות decellularization קודמות לרקמות ללא רשת כלי דם נגישה הסתמכו על חשיפה ממושכת של רקמות לפתרונות של חומרי ניקוי, חומצות, או טיפולים אנזימטיים כאמצעי כדי להסיר את הרכיבים הסלולריים וגרעיניים מהסביבה התאית ^6-8. עם זאת, היעילות של שיטות אלה תלויים על יכולתו של את הפתרונים לחלחל רקמות באמצעות דיפוזיה. לעומת זאת, טפטוף של איברים דרך מערכת כלי הדם הטבעית ביעילות מצמצם את מרחק דיפוזיה ותחבורת הנחייתם של decellularizatiעל סוכנים לרקמה והמרכיבים תאיים מהרקמות. בזאת, אנו מתארים שיטה לdecellularize לב חזירי שלם מלא דרך זלוף המדרדר כלילית. הפרוטוקול הניב decellularized מלוא לב תאי מטריצה ​​(c-ECM) פיגום עם המבנה תלת הממדים של הלב השלם. השיטה שלנו השתמשה בסדרה של אנזימים, חומרי ניקוי, וחומצות בשילוב עם שטיפות hypertonic וhypotonic לסייע בתמוגה וההסרה של תאים. הפרוטוקול המשמש פתרון טריפסין לנתק את התאים מהמטריצה ​​אחרי Triton פתרוני X-100 ונתרן deoxycholate כדי לסייע בהסרה של חומר תאי. הפרוטוקול המתואר משתמש גם במהירויות של יותר מ זלוף 2 ליטר / דקה לפרקי זמן ארוכים. קצב הזרימה הגבוהה, בשילוב עם שינויי פתרון נתן הובלה של סוכנים לרקמות ללא זיהום של פסולת תאית והבטיח יעיל שטיפה של הרקמות. השיטה המתוארת הסירה את כל החומר גרעיני מנתיve רקמת לב חזירית, יצירת לב ECM פיגום באתר ספציפי שיכול לשמש למגוון רחב של יישומים.

Protocol

1. הכנת רקמה והתקנת ניסוי

1. איבר חזירי קציר מייד לאחר המתת חסד ממתקן משחטה או מחקר ולשטוף את הדם עודף. חתוך את הלב של שומן ורקמה עודפים, שמירת הפרוזדורים ואב העורקים בשלמותה. לחתוך שומן להפריד מעורק הריאה לאב העורקים. אם יש קיצוצים כלשהם ברקמה, להשליך כראוי.
2. עוטף כל אחד בנפרד בנייר לב מקפיא ולאחסן את כל הרקמות במקפיא ° C -80 לפחות 24 שעות כדי להבטיח הקפאה מוחלטת.
3. כשמוכן לשימוש (בדרך כלל פחות מ 3 חודשים), לב הפשרה 1 שלם קפוא חזירי במים מסוג 1 מתחת למים למשך הלילה בכוס 4 ליטר ב 4 ° C.
4. לאחר הלב מופשר לחלוטין, ללטף את הלב יבש, לשקול את הלב, ולהקליט במשקל. לבו של חזיר במשקל שוק צריך לשקול כ 375-450 גרם.
5. חבר צינורות גודל 18 Masterflex לסוף ¼ "של מפחית תיל. הכנס מפחית התיל וצינורות בתוך אב העורקים. 2 תפסי מקום צינור או קשרי zip מאובטחים ברחבי אב העורקים, ממש מתחת לתא מטען brachiocephalic. המפחית והצנרת חייב להישאר מעל לשסתום אב העורקים, ולכן העורקים הכליליים ניתן perfused (איור 1).
6. השתמש במזרק 30 או 60 מ"ל כדי למלא את הצינור במי סוג I. הכנס את הצינורות בתוך המחסנית של משאבת גלגלת Masterflex באמצע המשוער שלו. הצף את סוף היבוא של הצינורות בחלק התחתון של 4 כוס ליטר מלאה עם 2.5 ליטר מים ולאבטח את הצינור.
7. הנח את הלב בכוס מלאה במים, וראש המשאבה כדי להסיר בועות אוויר. אם בועות הם נצפו מגיעים מאב העורקים שבו הצינור מוכנס, אב העורקים ייתכן שיהיה הצורך לשנות את מיקום או מאובטח עם קשרים נוספים. חותם אטום הוא חשוב כדי לשמור על לחץ מתאים במשך תהליך decellularization (איור 2).
8. הנח את 4 כוס הליטר המכיל 3 ליטר של 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 פתרון בצלחת מערבבים ומחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס בהכנת תהליך decellularization.

2. רקמת שטיפות

1. הגדר את המשאבה לקצב זרימה של 400 מ"ל / דקה, להבטיח כי את גודל הצינורות נכון נבחר. שטוף את הלב עם סוג מים שעבור 15-25 דקות. כמשאבה התחילה, לב צריך להתנפח וeffuse דם מחדרי הלב. פתרון טרי צריך להחליף כל 5-10 דקות, או לפי צורך על בסיס כמות הדם הוסרה מהלב. אם דם לא effused מהלב, להתאים את הצינורות ותפסים במידת צורך.
2. עצור את המשאבה ולהעביר את הלב לכוס נפרדת מלאה בפוספט 2X נאגר מלוח (PBS). אחרי הצינורות הם שקועים בפתרון, מפעיל את המשאבה ולהגביר את קצב הזרימה של 700 מ"ל / דקה. הלב צריך להישאר בתמיסה למשך 15 דקות, שינוי הפתרון כל 5 דקות. כל שינוי דורש פתרון המשאבה צריך לעצור באופן זמני תוך הרקמות והצינורות מועברותלכוס החדשה.
3. להעביר את הלב לסוג מים שעבור 10 דקות ולהגביר את קצב הזרימה ל750 מ"ל / דקה.

3. זלוף Decellularization והפתרון

1. להעביר את הלב לכוס המכילה 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% ₃ NaN ב 37 ° C. הגדל את מהירות משאבת 1200 מ"ל / דקה ומפעיל את המשאבה. השתמש במוט מערבבים הונח בתחתית הכוס לזרום פתרון במבחנה. הלב צריך להישאר בEDTA/0.05% ₃ פתרון 0.2% Trypsin/0.05% NaN על 37 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של שלוש שעות. לאחר השעה 1, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,500 מ"ל / דקה. לאחר שעה נוספת, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,800 מ"ל / דקה. הרקמה היא נתונה באיטיות למהירות מוגברת זלוף למצב הרקמות ולמנוע קרע של כלי הדם. הלב יתפח וכמעט כפול בגודלו במהלך שלב זה של הפרוטוקול. הרקמות תאבדנה את צבעו הטבעי, ומתקדם מהאטרייה לשיא בכל רחבי הדואר הפרוטוקול (איור 3).
2. לאחר כל זלוף פתרון, 2 שלב שטיפה מתבצע על מנת להסיר שאריות סלולריות, שאריות כימיקלים, ותמוגה תא סיוע. כל השטיפה מורכבת מ10 דקות לשטוף במי סוג I ואחרי 10 דקות לשטוף עם פתרון 2X PBS בטמפרטורת חדר. כל שטיפה מורכבת מהסרת הפתרון מהכוס המקורית, והוסיף לשטוף פתרונות, ומחזור perfusate בתוך הכוס המכילה את הלב מתחת למים. לאחר ₃ פתרון NaN 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% מים, ינקבו ב1900 מ"ל / דקה ואז ינקבו 2X PBS ב 1950 מ"ל / דקה.
3. להעביר את הלב לפתרון של 3% X-100/0.05% טריטון EDTA/0.05% ₃ NaN בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות המשאבה עד 2,000 מ"ל / פתרון ינקב דקות ובמשך שעה אחת. הסר את התמיסה מהמבחנה ולהחליף עם פתרון חדש, להגדיל את מהירות המשאבה עד 2100 מ"ל / דקה, ותנקב את הפתרון הטרי לשעה נוספת וחצי, מביא את הסך כל זמן ב3% טריטון X-100/0.05% EDTA/0.05% ₃ NaN ל -2.5 שעות.
4. שטוף את הרקמה במי סוג I ב2150 מ"ל / דקה ו2X PBS ב 2180 מ"ל / דקה למשך 10 דקות כל אחד.
5. להעביר את הלב ל4% פתרון Deoxycholate נתרן בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות משאבת 2200 מ"ל / דקה ופתרון ינקב עבור 3 שעות.
6. שטוף את הרקמה במי סוג I וב2X PBS ב 2200 מ"ל / דקה במשך 15 דקות כל אחד, משנות את הפתרונים לאחר דקות 5-10 לכל פתרון. ניתן לפצל את צעדי זלוף תואר על ימים מרובים על ידי ביצוע הצעד לשטוף פעמים ואחסון הלב עם צינורות מחוברים בין הלילה ב 4 ° C ושקוע במי סוג I.
7. למחרת, בצעו 5 דקות לשטוף עם מי סוג I ב 750 מ"ל / דקה, ואחרי 5 דקות לשטוף ב1X PBS ב 1500 מ"ל / דקה. הפרוטוקול ואז ניתן להמשיך בקצב הזרימה המתוארת בפתרון הראוי.

4. חיטוי ועיבוד סופי

1. להעביר את הלב לperac 0.1%פתרון ינקב עבור 1.5 שעתי פתרון אתנול 4% וב2200 מ"ל / דקת חומצת etic /.
2. את השטיפות הסופיות לרקמות שבוצעו בכל 2200 מ"ל / דקה. תנקב את הרקמה עם 1X PBS במשך 15 דקות, ואחרי 2 דקות 5 שטיפות במי סוג I. זו סדרה של שטיפות חוזרת על עצמו פעם נוספת על מנת להשלים את הליך זלוף פתרון.
3. הפעל את המשאבה וניתק את הלב מפתרון לניקוז הלב. חותך את הקשרים מאב העורקים, להסיר את כל הצנרת, ולמקם את הלב בגביע ריק לניקוז לשעה 1. עודף נוזלים יהיו צורך לנקז אותו מדי. הנח את הלב על משטח סופג כדי לנקז את הלב (איור 4) באופן מלא.
4. לאחר שרוב המים מוסרים, להקליט את המשקל של מטריקס הלב (C-ECM). הלב יכול להיות צפוי לאבד כ 20-25% מהמשקל ההתחלתי שלה במהלך תהליך decellularization.
5. לנתח את חדרי לב הימניים ושמאליים, וכן מחצו חדרית לדנ"א quantificatiובעיבוד היסטולוגית כדי לאשר decellularization המלא של הרקמה (איור 5).
6. הקפא C-ECM ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 שעות לפני lyophilization.

תוצאות

ההשפעה של decellularization על לב חזירי שלם באופן טבעי משתנית בהתאם להבדלים בגודל, לחצים, וסידור כלי. לכן, את ההרכב המדויק של הפיגומים התאיים מטריקס הנגזרים לא יהיה אותו הדבר מלב אל לב. השלמת הפרוטוקול המתואר תניב לב שמופיע לבן או שקוף, המציין את האובדן של חומר תאי. עם זאת, מקוב?...

Discussion

המחקר הנוכחי תאר מתודולוגיה לdecellularization עקבי והיעיל של לב חזירי. הפרוטוקול היה שינוי ^ל1 דו"ח שפורסם בעבר, וכלל חשיפה ארוכה יותר לזרימה ולחץ מוגבר, אשר ספקה תוצאות דיר יותר. רקמת decellularized התקבלה עמדה בכל הקריטריונים שפורסמו לdecellularization המוצלח של רקמה ^2. שינו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
טריפסין	Gibco	15090
EDTA	דיג	BP120-500
3 NaN	סיגמא	S2002-500G
טריטון X-100	סיגמא	X100-1L
PBS 10X	דיג	BP399-20
Deoxycholate נתרן	סיגמא	D6750-500G
חומצת Peracetic	Pfaltz ובאואר	P05020	35% CAS # 79-21-0
אתנול	Pharmco	111000200
כונן המשאבה Masterflex	הקול בן זוגו	Si-07524-50
אבובי Masterflex	הקול בן זוגו	96400-18	גודל 18
Reducer תיל	הקול בן זוגו	EW-30612-20
כוס 4L	הפישר סיינטיפיק	02-540T